一種低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及功能性食品添加劑的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低分子量蝙蝠蛾擬青霉低胞外多糖的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)和中華被毛抱(Hirsutella sinensis)是天然冬蟲夏草中兩種重要的內(nèi)生真菌，研宄表明兩者共同參與了天然冬蟲夏草的生長分化，其中化學(xué)組成分析表明蝙蝠蛾擬青霉的化學(xué)指紋圖譜與天然冬蟲夏草更為接近，也含有天然冬蟲夏草中所具有的蟲草素、甘露醇、蟲草多糖、生物堿類等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、調(diào)節(jié)機體免疫能力等多種生物功能。
[0003]多糖類作為冬蟲夏草所含的生理活性物質(zhì)中含量最高、功能最豐富的類群之一，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生理功能，是冬蟲夏草開發(fā)研宄的一個重要突破口，具有良好的應(yīng)用前景。由于天然冬蟲夏草價格昂貴，蟲草多糖可從天然蟲草中分離出的相關(guān)無性型菌株的發(fā)酵獲得，可分別從它們的菌絲體和發(fā)酵液中分離得到胞內(nèi)多糖和胞外多糖。
[0004]近年來，隨著蝙蝠蛾擬青霉(P.hepiali)、中華被毛孢(H.sinensis)、中華彎頸曲霉(Tolypocladium sp.)、蝙蝠蛾被孢霉(Mortierella hepiali)等冬蟲夏草無性型菌株研宄的深入，采用這些菌株進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲夏草中替代活性物質(zhì)稱為研宄的熱點。其中，蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)作為蟲草無性型的一種，是天然冬蟲夏草分化成熟過程中的一種重要內(nèi)生真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物與天然冬蟲夏草成分非常接近。本研宄中所用菌株于2002年分離自青海省玉樹地區(qū)的天然蟲草子實體中，并由中科院菌種保藏中心鑒定。由于蟲草分布的廣泛性和無性型菌株的多樣性，不同科研機構(gòu)對無性型蟲草的研宄有很大差異，而關(guān)于利用該菌株液體發(fā)酵并從發(fā)酵液中分離獲得低分子量胞外多糖的研宄尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的旨在提供一種制備低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的方法，實現(xiàn)本發(fā)明的具體方案如下:
[0006](I)從保存于土豆斜面培養(yǎng)基上的母種中挖取菌絲體塊(大小為0.5cmX0.5cm)，接種于種子培養(yǎng)基中(每只250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基10mL)，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，120轉(zhuǎn)/分鐘下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時，S卩可獲得種子液。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30.00，酵母膏6.00，磷酸二氫鉀1.50，硫酸鎂0.50，麥芽汁10.00，土豆汁10.00，pH 6.5。
[0007](2)取步驟(I)中的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(每只500mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基200mL)，接種量為2% (V/V)，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，然后在120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)48小時后，在無菌條件下，按發(fā)酵液體積的1.0%加入吐溫80，再繼續(xù)培養(yǎng)96小時后，將發(fā)酵產(chǎn)物于4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘獲得蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):甘露糖50，酵母膏1.50g/L，硫酸銨5.00g/L,磷酸二氫鉀1.50g/L，硫酸鎂0.05g/L，土豆汁 15.00g/L，麥芽汁 15.00g/L，pH 6.5 ；
[0008](3)將步驟(2)中獲得的蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)HNl菌株發(fā)酵液分別于超濾系統(tǒng)下先后經(jīng)過0.1 μπι和截留分子量大小為100kD、50kD、10kD和3kD的超濾膜組件，將3kD超濾膜組件的截留液減壓濃縮至原體積的1/3，加4倍體積的無水乙醇，沉淀12小時后，用90%乙醇洗滌3次后，在5000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘收集沉淀即可獲得低分子量胞外粗多糖；
[0009](4)將步驟(3)制得的低分子量胞外多糖通風(fēng)揮去乙醇，加少量去離子水復(fù)溶后，用氯仿和正丁醇體積比為4: I的混合溶液脫蛋白3次后，將水相溶液冷凍干燥即可獲得低分子量胞外多糖冷凍干粉；
[0010](5)將步驟(4)所得低分子量胞外多糖用分子排阻色譜檢測其分子量分布情況，用紅外光譜分析特征基團組成，用紫外光譜掃描確定其是否具有蛋白質(zhì)組分。
[0011]2、根據(jù)專利要求I所述的一種具有生物活性胞外酸性糖蛋白的制備方法，其特征在于:
[0012](I)所述步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方:甘露糖50g/L，酵母膏1.50g/L，硫酸銨
5.00g/L，磷酸二氫鉀 1.50g/L，硫酸鎂 0.05g/L，土豆汁 15.00g/L，麥芽汁 15.00g/L，pH
6.5 ；
[0013](2)所得到的低分子量胞外多糖的分子量范圍為3000-10000道爾頓，單糖組成為甘露糖:核糖:鼠李糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=53.62: 3.20: 3.51: 13.10: 14.17: 2.24。
[0014]制備的低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外胞外多糖為灰白色疏松粉末，其中多糖含量86.72%，蛋白含量12.58%，容易吸潮。該低分子量胞外多糖的紅外吸收光譜表明其具有多糖、羧基、硫酸基和氨基的特征吸收峰。該低分子量胞外多糖的紫外吸收掃描表明其含有蛋白的吸收峰。對該低分子量胞外多糖的分子量進(jìn)行測定，表明其分子量分布在3000-10000道爾頓之間。
【附圖說明】
[0015]圖1不同碳源發(fā)酵對低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖分子量組成的影響
[0016]圖2不同添加劑對低分子量胞外多糖產(chǎn)量的影響
[0017]圖3低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的紅外吸收圖譜
[0018]圖4低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的單糖組成分析
[0019]圖5低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的分子量分布
[0020]圖6低分子量蝙蝠蛾擬青霉胞外多糖的掃描電鏡圖
【具體實施方式】
[0021]下面通過實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0022]實施例1:
[0023](I)從保存于土豆斜面培養(yǎng)基上的母種中挖取出菌絲體塊(大小為0.5cmX0.5cm)，接種于種子培養(yǎng)基中(每只250mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基10mL)，于207°C下靜止培養(yǎng)12小時后，120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)72小時，即可獲得種子液。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖糖30.00，酵母膏6.00，磷酸二氫鉀1.50，硫酸鎂0.50，麥芽汁10.00，土豆汁10.00，pH 6.5，ο
[0024](2)取步驟(I)中的種子液接種于裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的容量為500mL的三角瓶中，按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%接入種子液，于20°C下靜止培養(yǎng)12小時后，然后在120rpm下振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)48小時后，在無菌條件下，按發(fā)酵液體積的1.0%加入吐溫80，再繼續(xù)培養(yǎng)96小時后，將發(fā)酵產(chǎn)物于4000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘后，收集上清液即為蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)HNl菌株發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:甘露糖50g/L，酵母膏1.50g/L，硫酸銨5.00g/L，磷酸二氫鉀1.50g/L，硫酸鎂0.05g/L，土豆汁15.00g/L，麥芽汁15.00g/L，pH 6.5 ；
[0025](3)將步驟(2)中獲得的蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)HNl菌株發(fā)酵液分別于超濾系統(tǒng)下先后經(jīng)過0.1 μπι和截留分子量大小為100kD、50kD、10kD和3kD的超濾膜組件，將3kD超濾膜組件的截留液減壓濃縮至原體積的1/2，加4倍體積的無水乙醇，沉淀12小時，用90%乙醇洗滌3次后，