專利名稱：一種降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
一種降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其應(yīng)用，尤其涉及一種降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株及應(yīng)用其制備辛硫磷的降解菌劑。
背景技術(shù)：
隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，病蟲害增多，農(nóng)藥用量增大，據(jù)統(tǒng)計，全世界每年通過植物保護方法增加的產(chǎn)量有80%依靠農(nóng)藥。有機磷農(nóng)藥一直是中國用量最大的農(nóng)藥種類，每年都在十萬噸以上。但是農(nóng)藥在提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，提高人們生活質(zhì)量的同時，也給人類和動物帶來了巨大的危害，同時還帶來了很大的環(huán)境污染和食品安全問題。辛硫磷是一種常用的有機磷農(nóng)藥，主要用于防治地下害蟲，在土壤中的殘留時間較長，長期累積易造成環(huán)境污染。
生物修復(fù)法是利用微生物或植物或動物將土壤、地下水或海洋中的污染物降解、吸收或富集的生物工程技術(shù)。它主要可分為三種類型植物修復(fù)技術(shù)、微生物修復(fù)技術(shù)和菌根修復(fù)技術(shù)。其中微生物修復(fù)技術(shù)是從污染土壤、水體中篩選出能降解污染物的真菌、細菌、放線菌、固氮菌、酵母菌和霉菌，通過實驗室馴化、修飾來提高其降解能力，制成菌劑再放入被污染領(lǐng)域中，是目前研究較多的領(lǐng)域。目前據(jù)公開資料報道過的辛硫磷的降解菌主要有鄰單胞菌屬(Plesiomonassp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、玫瑰單胞菌屬(Rosemonas sp·)、戴爾福特菌屬(Delftia sp.)、不動桿菌屬(Acinetobacter sp.)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopesudomonasplaustris)、芽抱桿菌屬(Bacillus spp.)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum sp.),大部分處于理論研究階段,還不足以進行生產(chǎn)應(yīng)用。將淡紫擬青霉用于對辛硫磷的降解為發(fā)明人首次報道并制備成菌劑應(yīng)用于田間。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種能夠降解辛硫磷的淡紫擬青霉菌株，該菌株為淡紫擬青霉菌株FJAT-9041 (Paecilomyces Iilacinus),且該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041于2012年05月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC NO 6110，并利用該囷株制備羊硫憐的降解囷劑。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的本申請人從福建省福州市閩侯縣的番茄根際土壤中分離得到的菌株，通過對該菌株進行病原形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定，最終鑒定其為淡紫擬青霉的一個菌株。進一步地，利用該菌株制備辛硫磷的降解菌劑，其制備方法的具體步驟如下(I)所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的活化用接種環(huán)將所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30 0C ；(2)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)所獲得的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度設(shè)定為30°C，振蕩培養(yǎng)24h后即得種子液；(3)降解菌劑的制備將步驟(2)獲得的種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，通氣量I : I. 2，溫度設(shè)定為30°C ;在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中每隔一段時間取適量的發(fā)酵液測定其孢子濃度，當測定的孢子濃度值達到2. OX 108CFU/mL時則發(fā)酵完成；然后將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液直接以包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附劑吸附后用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。其中，所述步驟(I)中PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g,水 IOOOmL ； 所述步驟(2)中種子培養(yǎng)基與步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水余量；且該培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比。本發(fā)明的有益效果在于提供一種淡紫擬青霉菌株FJAT-9041 (Paecilomyceslilacinus),并利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備辛硫磷的降解菌劑,該降解菌劑對辛硫磷的降解效率很高，使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生產(chǎn)過程中正常使用有機磷農(nóng)藥辛硫磷進行病蟲害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量符合人體健康要求，另外，該降解菌劑的制備過程簡單、成本低廉、且對環(huán)境及人體無害，可進行無害化生產(chǎn)。
具體實施方式本發(fā)明中淡紫擬青霉菌株FJAT-9041 (Paecilomyces IiIacinus)是從福建省福州市閩侯縣的番茄根際土壤中分離得到的菌株，并揭露了利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備降解菌劑的方法。一、該菌株FJAT-9041的分離(I)樣品的采集取番茄根際土壤約IOOOg裝入采集袋中，采集袋中裝入標簽并在標簽上注明采集時間、地點、寄主等，同時在采樣記錄本上詳細記錄采集時間、地點、寄主、土壤類型等樣品采集后，低溫保存，在一個月內(nèi)分離真菌，備用；(2)分離菌株(采用選擇性培養(yǎng)基法)配置Czapek培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基；取上述備用的土樣5g并加至裝有IOOmLCzapek培養(yǎng)基的三角瓶中，且往該三角瓶內(nèi)添加辛硫磷至濃度為40μ g/mL ;然后將三角瓶置于28°C、110r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5天；接著取ImL培養(yǎng)獲得的菌液并轉(zhuǎn)至新鮮的Czapek培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并添加辛硫磷至該培養(yǎng)基中辛硫磷濃度為400μ g/mL ;之后取繼續(xù)培養(yǎng)獲得的菌液按10倍梯度稀釋至10_7，將稀釋液涂布于辛硫磷濃度為800 μ g/mL的PDA平板培養(yǎng)基上，并28 °C恒溫培養(yǎng)，待PDA平板培養(yǎng)基長出菌落后，挑取單菌落上的菌絲體通過連續(xù)劃線分離，得到純化的菌株，并將該菌株保存于PDA培養(yǎng)基斜面。其中，Czapek培養(yǎng)基的組分為=KCl O. 5g，K2HPO4Ig, NaN033g，MgSO4 · 7H20 O. 5g，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 O.Olg，蔗糖30g，水1000mL;PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂 20g，水 IOOOmL0二、該菌株FJAT-9041的鑒定I.初步鑒定-病原形態(tài)學鑒定病原形態(tài)學鑒定依據(jù)Booth (1971)的鑒定方法進行初步鑒定測定上述保存于PDA培養(yǎng)基斜面上的菌株的單孢菌落的生長速度、孢子形態(tài)及產(chǎn)孢細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌落在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，直徑可達約3. 5cm，正面顏色呈淡紫色，突起，表面粉質(zhì)，輪紋明顯，背面無色或紫紅色；菌絲無色，有隔膜；分生孢子梗直立，輪狀分枝，2 4個瓶梗輪狀排列在孢子梗上；瓶?；颗虼?，頂端稍細長，約I μ m長，瓶梗大小為7. 5^12. 5 X 2. 5^3. O μ m ;分生孢子橢圓形至紡錘形，表面光滑，大小為2. 5^4. 0X2. 0 2· 5μ m。依據(jù)Booth (1971)的鑒定結(jié)果，初步確定該菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。2.進一步鑒定一分子生物學鑒定(I)菌株菌絲體的培養(yǎng)和收集供試菌株(即上述保存于PDA培養(yǎng)基斜面上的菌株)經(jīng)單孢培養(yǎng)后，采用玻璃紙平板培養(yǎng)法收集菌絲。具體地，在直徑為9cm培養(yǎng)皿中倒入PDA培養(yǎng)基約12mL，待凝固后，放入與培養(yǎng)皿等大的滅菌玻璃紙，該玻璃紙上接種3飛塊直徑為6mm的菌餅，28°C下培養(yǎng)72h，刮取菌絲，經(jīng)真空冷凍干燥后置于_80°C冰箱保存?zhèn)溆茫?
(2)基因組DNA的提取稱取(I)中獲得的干菌絲O. 05g于預(yù)冷的無菌研缽中，并加入液氮研磨至細粉狀，之后迅速轉(zhuǎn)入I. 5mL離心管中，參照Invitrogen公司的TRIzol Reagent (Cat. No. 15596-018)說明書進行操作提取菌株的基因組DNA ；(3)菌株 FJAT-9041 的鑒定采用引物ITS4和ITS5 (White, 1990)進行rDNA-ITS序列的擴增。引物ITS4和ITS5委托生物工程(上海)有限公司利用DNA合成儀合成引物序列分別為 ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ；ITS5 :5， -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，；以提取所獲得的菌株的基因組DNA為模板，上述引物(ITS4/ITS5)為引物對進行PCR擴增擴增反應(yīng)體系(25μ I 體系):DNA 模板 10_20ng，Ex Taq(5U/y L)0. 125mL, 10XPCR 緩沖液 2· 5 μ L，Dntp (2. 5mM) 2mL，引物(10 μ M)各 I μ L，加無菌水至 25 μ L ；擴增條件94°C5min;接著 94°C lmin,54°C lmin,72°C Imin 共 35 個循環(huán)；最后72°C IOmin。PCR產(chǎn)物的測序與分析將rDNA的PCR擴增產(chǎn)物直接送交上海英駿生物技術(shù)有限公司測序(測得的序列如SEQ ID NO. I所示)。序列分析的結(jié)果通過國際互連網(wǎng)進行核酸同源性檢索，得到相似性最高的均為淡紫擬青霉，其中與基因庫編碼為AB124670的淡紫擬青霉ITS序列同源性最高，達到99%。通過上述的鑒定,可確定該菌株為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。三、辛硫磷降解菌劑的制備步驟(I)淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的活化用接種環(huán)將淡紫擬青霉菌株FJAT-9041劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上,并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,培養(yǎng)溫度設(shè)定為30°C ；(2)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)所獲得的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度設(shè)定為30°C，振蕩培養(yǎng)24h后即得種子液；(3)降解菌劑的制備將步驟(2)獲得的種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，通氣量I : I. 2，溫度設(shè)定為30°C ;在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中每隔一段時間取適量的發(fā)酵液測定其孢子濃度，當測定的孢子濃度值大袋2. OX 108CFU/mL時則發(fā)酵完成；然后將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液直接以包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附劑吸附后用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。其中，步驟(I)中PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水IOOOmL ;步驟(2)中種子培養(yǎng)基與步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水余量；且該培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比。四、降解菌劑對辛硫磷的降解試驗 試驗I降解菌劑對辛硫磷的室內(nèi) 降解試驗設(shè)置實驗組與對照組，以上述所制備的降解菌劑作為處理組，以不接種淡紫擬青霉的空白液體培養(yǎng)基為空白對照，其余處理步驟完全相同；在實驗組的樣品中加入4%的辛硫憐乳液Iml,使羊硫憐在樣品中的添加濃度達到400 μ g/ml,并于恒溫搖床繼續(xù)振湯培養(yǎng)5天，轉(zhuǎn)速200rpm，溫度設(shè)定為30°C ;且實驗組與對照組均設(shè)三個重復(fù)。取樣檢測實驗組及對照組中的辛硫磷殘留量，檢測結(jié)果見下表I。由表I可知，經(jīng)降解菌劑處理5天后，辛硫磷的降解率均達到97%以上；而對照的自然降解率只有5. 46%。表I降解菌劑對辛硫磷的降解效果
權(quán)利要求
1.一種降解羊硫憐的淡紫擬青霉囷株，其特征在于所述囷株為淡紫擬青霉囷株FJAT-9041 (Paecilomyces Iilacinus),于2012年05月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0. 6110。
2.一種辛硫磷的降解菌劑，其特征在于其制備方法的具體步驟如下 (1)權(quán)利要求I中所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的活化用接種環(huán)將權(quán)利要求I中所述的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041劃線接種于PDA平板培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30°C ； (2)種子液的制備將步驟(I)培養(yǎng)所獲得的淡紫擬青霉菌株FJAT-9041的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm,溫度設(shè)定為30°C,振蕩培養(yǎng)24h后即得種子液； (3)降解菌劑的制備將步驟(2)獲得的種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1%，通氣量I : I. 2，溫度設(shè)定為30°C;在發(fā)酵培養(yǎng)的過程中每隔一段時間取適量的發(fā)酵液測定其孢子濃度，當測定的孢子濃度值達到2. OX 108CFU/mL時則發(fā)酵完成；然后將發(fā)酵完成后的發(fā)酵液直接以包裝瓶分裝成液體劑型，或采用泥炭吸附劑吸附后用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種辛硫磷的降解菌劑，其特征在于所述步驟(I)中PDA培養(yǎng)基的組分為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水IOOOmL ； 所述步驟(2)中種子培養(yǎng)基與步驟(3)中發(fā)酵培養(yǎng)基均為PDB培養(yǎng)基，其組分為馬鈴薯20%，葡萄糖2%，水余量；且該培養(yǎng)基組分中的百分比均為重量比。
全文摘要
本發(fā)明從福建省福州市閩侯縣的番茄根際土壤中分離得到菌株，該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041(Paecilomyces lilacinus)，于2012年05月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO．6110，并揭露了利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041(Paecilomyces lilacinus)制備辛硫磷的降解菌劑的方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于提供一種淡紫擬青霉菌株FJAT-9041(Paecilomyces lilacinus)，并利用該淡紫擬青霉菌株FJAT-9041制備辛硫磷的降解菌劑，獲得的降解菌劑對辛硫磷的降解效率很高。
文檔編號A62D101/28GK102796671SQ20121027640
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者劉波, 黃素芳, 史懷, 李芳 , 朱育菁, 唐建陽 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所