一種防治植物終極腐霉病害的木霉菌株及制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種防治植物病害的木霉及其應(yīng)用，特別是涉及一種防治植物終極腐 霉病害的木霉菌株及制劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 終極腐霉（/yMii/a? 屬于真菌界真菌門鞭毛菌亞門藻狀菌綱霜霉目腐霉 科，為低等真菌，目前報(bào)道分布甚廣，它不僅棲息在土壤中，還廣泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘 薯、松苗、咖啡、蘋果、柑橘、桃、棉花、菊花、大麗花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余種 經(jīng)濟(jì)植物，引起苗枯，猝倒、根腐、腳腐、枯萎等多種病害。
[0003]目前常用的預(yù)防及防治該病害的方法有：農(nóng)田管理改善、應(yīng)用抗性品種、化學(xué)藥劑 防治，但效果不甚明顯，且化學(xué)農(nóng)藥施用不當(dāng)造成了一系列的環(huán)境及健康問題。隨著生活水 平的提高，人們對(duì)綠色食品、有機(jī)食品需求越來越大，對(duì)支撐其生產(chǎn)的綠色、無污染、高效生 物農(nóng)藥的需求也日益擴(kuò)大。國內(nèi)外也開展了相關(guān)的研究，如李琳（2013)等分離到的棘孢木 霉T31對(duì)腐霉的平板抑制率為74. 39 %，但沒有開發(fā)出相關(guān)產(chǎn)品，僅有10多項(xiàng)相關(guān)的發(fā)明專 利涉及植物提取抑菌有效成分或微生物菌株可防治腐霉猝倒病的報(bào)道。BinLi(2007)篩 選到14株類芽孢桿菌，防治黃瓜腐霉猝倒病防效達(dá)到73 % ;Novozymes公司利用專利菌株 利迪鏈霉菌WYEC108研制了防治腐霉、疫霉、鐮刀菌、絲核菌等病原菌的生物殺菌劑；國外 還有報(bào)道利用木霉菌、熒光假單胞菌防治玉米腐霉猝倒病的成功案例。
[0004] 然而，國內(nèi)登記防治作物猝倒病的藥劑99個(gè)，其中僅有2個(gè)產(chǎn)品不是化學(xué)農(nóng)藥，且 為捷克進(jìn)口產(chǎn)品，國內(nèi)沒有相關(guān)產(chǎn)品報(bào)道，因此研制多機(jī)制防治腐霉病害的微生物農(nóng)藥成 為市場急需。木霉spp.)具有多種生防機(jī)制：寄生、競爭、水解酶活性、抗生 性代謝產(chǎn)物等，是重要的植物病害生物防治菌，目前已有10多個(gè)木霉產(chǎn)品獲得農(nóng)藥登記并 得到廣泛應(yīng)用，故利用木霉研發(fā)生物農(nóng)藥防治由終極腐霉類低等真菌引起的植物病害成為 可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述存在的缺陷而提供一種防治植物終極腐霉病害的木 霉菌株及制劑。該木霉產(chǎn)生的纖維素酶和葡聚糖酶可消解終極腐霉的細(xì)胞壁，引起菌絲破 裂；對(duì)終極腐霉有強(qiáng)烈的抑制作用，平板抑制率達(dá)100 %。本發(fā)明制劑對(duì)由終極腐霉引起的 植物病害防治效果達(dá)到90 %以上。
[0006] 本發(fā)明一種防治植物終極腐霉病害的木霉菌株及制劑的技術(shù)方案為，該木霉 CCTCC-TW20622在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，其保藏編號(hào)是： CGMCCN0. 11337,菌種的拉丁文名稱是 參據(jù)的微生物(株）： CCTCC-TW20622,保藏日期是2015年9月8日。
[0007] 該木霉CCTCC-TW20622在PDA平板上對(duì)終極腐霉抑制率高達(dá)100 %，其產(chǎn)生的纖維 素酶和葡聚糖酶可消解終極腐霉的細(xì)胞壁，引起菌絲破裂；CCTCC-TW20622在PDA平板上產(chǎn) 生分生孢子能力較弱，而產(chǎn)生厚垣孢子的能力較強(qiáng)，4d后可產(chǎn)生大量的厚垣孢子；液體發(fā) 酵厚垣孢子產(chǎn)量為5億/mL。
[0008]該木霉ITS擴(kuò)增引物：ITS1-F:5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3'，ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，菌株CCTCC-TW20622 的ITS序列全長為 613bp，如下所示：
[0009]該木霉ie/7擴(kuò)增引物：EF1-728F:5'-CATCGAGAAGTTCGAGA AGG-3'，EF200R:5' -GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3'，菌株CCTCC-TW20622 的ie/7序列全 長為649bp，如下所不：
[0010]該木霉印似擴(kuò)增引物：fRPB2-5F:5' -GA(T/C)GA(T/C) (A/C)G (A/T)GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3 '，fRPB2-7cR: 5 '-CCCAT(A/G)GCT TG(T/C)TT(A/G)CCCAT-3'，菌株CCTCC-TW20622 的印似序列全長為 1 146bp，如下所 示：

[0011] 所述木霉制備的制劑，由該木霉經(jīng)過斜面培養(yǎng)、三角瓶培養(yǎng)、液體培養(yǎng)后得到的發(fā) 酵液，以及凹凸棒土、羧甲基纖維素鈉、茯苓粉、黃原膠、SDS組成。
[0012] 所述的發(fā)酵液制備過程為： (1) 斜面培養(yǎng)：采用固體PDA培養(yǎng)基，將菌株接種在試管培養(yǎng)基上，25 °C培養(yǎng)2d~3 d; (2) 三角瓶培養(yǎng)：采用液體PDB培養(yǎng)基，將試管菌種接種在液體三角瓶中，置于搖床上 25 °C振蕩培養(yǎng)1d~2d; (3) 液體培養(yǎng)：采用發(fā)酵培養(yǎng)基，115 °C滅菌30min，將三角瓶種接種發(fā)酵罐，接種量 0. 2 %，25 °C培養(yǎng)，溶氧量40 %~50 %，通氣量1 :0. 6~0. 8,攪拌速度為160r/min，培養(yǎng) 24h后，添加0.4 %草酸，調(diào)整發(fā)酵參數(shù)：25 °C培養(yǎng)，溶氧量20 %~30 %，通氣量1 :0.4~ 〇. 6,攪拌速度為140r/min，繼續(xù)培養(yǎng)24h~30h，至厚垣孢子量達(dá)到5億/mL以上時(shí)，結(jié) 束發(fā)酵得到發(fā)酵液。
[0013] 步驟（3)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為，玉米粉2 %，葡萄糖0.5 %，豆餅粉4 %，磷酸氫二鉀0.2 %，磷酸二氫鉀0. 2 %，碳酸鈣0. 5 %，余量為水，pH5. 5~6. 0。
[0014] 所述的制劑，由以下成分組成： 發(fā)酵液 20 mL 凹凸棒土（300目） 78g 羧甲基纖維素鈉 〇.8g 茯苓粉 〇.8g 黃原膠 〇.2g SDS 0. 2g〇
[0015] 本發(fā)明的有益效果為：該木霉產(chǎn)生的纖維素酶和葡聚糖酶可消解終極腐霉的細(xì)胞 壁，引起菌絲破裂；該木霉CCTCC-TW20622在PDA平板上產(chǎn)生分生孢子能力較弱，而產(chǎn)生厚 垣孢子的能力較強(qiáng)，4d后可產(chǎn)生大量的厚垣孢子；液體發(fā)酵厚垣孢子產(chǎn)量為5億/mL，該木 霉菌株CCTCC-TW20622對(duì)終極腐霉有強(qiáng)烈的抑制作用，25 °C對(duì)峙培養(yǎng)4d，已完全覆蓋終 極腐霉，且終極腐霉的氣生菌絲成塌陷現(xiàn)象，抑制率達(dá)100 %。溫室試驗(yàn)和小區(qū)試驗(yàn)表明，本 發(fā)明制劑對(duì)由終極腐霉引起的植物病害防治效果達(dá)到90 %以上。
[0016] 本發(fā)明制劑對(duì)茄子猝倒病的防治效果達(dá)到了 94. 9 %，對(duì)番茄猝倒病防治效果達(dá)到 了 90 %以上。
【附圖說明】
[0017] 圖1所示為基于17也序列的CCTCC-TW20622系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹； 圖2所示為CCTCC-TW20622分別在SNA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、CMD培養(yǎng)基上25 °C下培 養(yǎng)7d的平板形態(tài)； 圖3所示為CCTCC-TW20622的顯微形態(tài)；其中，a，分生孢子；b~e，分生孢子梗；f，厚垣 孢子，標(biāo)尺：a~e，5ym;f，10μπι; 圖4所示為CCTCC-TW20622在PDA平板上對(duì)終極腐霉的抑制結(jié)果； 圖5所示為CCTCC-TW20622與終極腐霉對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)的顯微形態(tài)； 圖6所示為CCTCC-TW20622分別在β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基和纖維素培養(yǎng)基平板培 養(yǎng)基上的水解圈。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0019] 實(shí)施例1:木霉菌株的分離 從全國各地采集土樣及水樣，利用選擇性培養(yǎng)基PDAm分離木霉。稱取10g土樣，倒入 100mL生理鹽水三角瓶中，25 °C，160r/min搖床振蕩1h，進(jìn)行梯度稀釋，每稀釋度取1mL 放入平板中，加入45 °C左右的PDAm混勻，25 °C培養(yǎng)7d~14d，對(duì)于水樣，直接取1mL與 PDAm混勻倒平板。待平板中長出木霉后，挑取木霉菌落轉(zhuǎn)接PDA平板，并鏡檢純化至單菌落 后保存。
[0020] PDAm:200g馬鈴薯，20g葡萄糖，15g瓊脂，0· 1g鏈霉素（streptomytin)，0· 3g 氣霉素（。]11〇抑115)]1611；[(301)，0.02 8玫瑰紅（1'086&61^&1)，0.5%曲酬（1'1'；[1:011乂-100)，1 000mL蒸饋水。
[0021] PDA:200g馬鈴薯，20g葡萄糖，15g瓊脂，1 000mL蒸餾水。
[0022] 本實(shí)驗(yàn)從229個(gè)樣品中，分離保存木霉菌株323株，其中菌株CCTCC-TW20622分離 自山東省濟(jì)南市七星臺(tái)森林公園內(nèi)的松蘑上。
[0023] 實(shí)施例2:菌種鑒定 主要通過平板形態(tài)、顯微形態(tài)、ITS、k/7及序列結(jié)果進(jìn)行鑒定。
ie/7擴(kuò)增引物：EF1-728F:5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG -3'，EF200R:5' -GCCATCCTTGGAGATACCAGC-3'，菌株CCTCC-TW20622 的ie/7序列全長 為649bp，如下所示：
ipAif廣增引物：fRPB2-5F: 5 '-GA(T/C)GA(T/C) (A/C)G(A/T) GATCA(T/C)TT(T/C)GG-3 '，fRPB2-7cR: 5 '-CCCAT(A/G)GCTTG(T/C) TT(A/G)CCCAT-3'，菌株CCTCC-TW20622的印似序列全長為1 146bp，如下所示：
[0025] 目前木霉分子鑒定序列比對(duì)網(wǎng)站有www.isth.info和www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0026] 將ITS序列提交www.isth.info中的TyicAftK1]進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果分別在97、118、 265、423、525處發(fā)現(xiàn)了木霉的5個(gè)DNA寡核苷酸條形編碼，表明CCTCC-TW20622為木霉屬， 但在該數(shù)據(jù)庫中找不到與該序列同源性較高的序列信息，初步表明該菌株可能為新種。
[0027]將ITS序列提交www.ncbi.nlm.nih.gov