一種通過(guò)補(bǔ)料提高冬蟲(chóng)夏草菌液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過(guò)補(bǔ)充培養(yǎng)基原料提高冬蟲(chóng)夏草菌液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲(chóng)夏草[Ophiocordycepssinensis度erk. )G.比Sung,J.M.Sung,Hywel-Jonesfe Spatafora( =Cordycepssinensis(Berk. )Sacc.)]是我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藥，屬于子囊菌口 (Ascomycota)、肉座菌目（Hypocreales)、蛇形蟲(chóng)草科（Ophiocordycipitaceae)。有關(guān)冬蟲(chóng) 夏草的記錄歷史悠久。"冬蟲(chóng)夏草"最早出現(xiàn)在1694年成書(shū)的《本草備要》中，其藥用功效 被記載為"甘平，保肺益腎，止血化姨，已勞咳。"在《本草從新》（1757)中也明確記載"冬蟲(chóng) 夏草味甘平，入肺、腎二經(jīng)，保肺益腎，補(bǔ)精髓、止血化姨，已勞咳，治福癥皆良。"在《中華人 民共和國(guó)藥典》(2000年版）中則被解釋為；"冬蟲(chóng)夏草味甘，平。歸肺、腎經(jīng)；功能為補(bǔ)肺益 腎，止血化姨。用于久咳虛喘，勞嗽咯血，陽(yáng)邊遺精，腰膝酸痛。"現(xiàn)代研究結(jié)果證明冬蟲(chóng)夏草 具有巧姨平喘、免疫調(diào)節(jié)、保肝護(hù)腎、抗腫瘤等多種藥理作用。但是冬蟲(chóng)夏草是青藏高原特 有的菌物，因寄主特異性、地理分布局限性導(dǎo)致其天然產(chǎn)量非常有限，加之長(zhǎng)期采挖過(guò)度、 其賴W生存的生態(tài)環(huán)境遭到破壞，送種珍貴藥材的分布范圍和發(fā)生數(shù)量已經(jīng)出現(xiàn)明顯的萎 縮趨勢(shì)。由于良好的治療與保健效果，目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)冬蟲(chóng)夏草需求量激增。送一供需 矛盾進(jìn)一步刺激其價(jià)格昂貴，并繼續(xù)上漲。目前已有研究表明通過(guò)人工發(fā)酵得到的冬蟲(chóng)夏 草與天然蟲(chóng)草的功效相似，因此，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌粉W代替天然冬蟲(chóng)夏草，也成為 緩解自然資源壓力，調(diào)節(jié)供需平衡、創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)價(jià)值的很有潛力的途徑。
[0003]DNA分子研究結(jié)果表明，目前市面上很多稱為"冬蟲(chóng)夏草菌絲體"的發(fā)酵產(chǎn)品與天 然冬蟲(chóng)夏草沒(méi)有聯(lián)系，因此其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不能應(yīng)用于真正的冬蟲(chóng)夏草菌種；而用冬 蟲(chóng)夏草菌種進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，仍存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)率低、成本高的問(wèn)題。關(guān)于冬蟲(chóng)夏草菌種 液體發(fā)酵技術(shù)有待優(yōu)化，關(guān)于其培養(yǎng)方式仍有很大的改進(jìn)空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)補(bǔ)充培養(yǎng)基原料提高冬蟲(chóng)夏草菌液體發(fā)酵菌絲體 產(chǎn)量的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的通過(guò)補(bǔ)充培養(yǎng)基原料提高冬蟲(chóng)夏草菌液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量的方 法，為；在將冬蟲(chóng)夏草菌進(jìn)行液體發(fā)酵的過(guò)程中，向培養(yǎng)體系中補(bǔ)充碳源和氮源，從而得到 產(chǎn)量提高的冬蟲(chóng)夏草菌絲體。
[0006] 該方法具體可包括如下步驟；將冬蟲(chóng)夏草菌進(jìn)行液體發(fā)酵，待培養(yǎng)體系中碳源和 氮源的含量均下降至初始濃度的50% -60% (如55% -58% )時(shí)，向所述培養(yǎng)體系中補(bǔ)充 所述碳源和所述氮源（即所述補(bǔ)充培養(yǎng)基原料），繼續(xù)培養(yǎng)，從而得到產(chǎn)量提高的冬蟲(chóng)夏草 菌絲體。
[0007] 在本發(fā)明中，所述碳源為單糖，具體如葡萄糖；所述氮源為復(fù)合氮源，具體為魚(yú)蛋 白腺和酵母提取物。
[0008] 在本發(fā)明中，上述方法中的所述氮源的含量具體是W氨基氮含量計(jì)的。
[0009] 在本發(fā)明中，所述"待培養(yǎng)體系中碳源和氮源的含量均下降至初始濃度的 50%-60% (如55%-58% )"時(shí)，具體為；所述培養(yǎng)體系中所述碳源的含量下降至初始濃度 的58%，同時(shí)所述培養(yǎng)體系中所述氮源的含量（W氨基氮含量計(jì)）下降至初始濃度的55% 時(shí)。
[0010] 在所述方法中，所述將冬蟲(chóng)夏草菌進(jìn)行液體發(fā)酵的培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基； 所述半合成培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下；葡萄糖30. 0-50.OgA,魚(yú)蛋白腺 5. 0-10.Og/l，酵母提取物 1. 0-3.OgA,磯酸二氨鐘 1.O-lg/l，硫酸鎮(zhèn) 0. 5-1.Og/L。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述半合成培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度具體 如下；葡萄糖50. 0邑/1，魚(yú)蛋白腺10.Og/l，酵母提取物3.OgA,磯酸二氨鐘IgA,硫酸鎮(zhèn) 0.5g/L〇
[0012] 在所述方法中，所述將冬蟲(chóng)夏草菌進(jìn)行液體發(fā)酵，具體為：將所述冬蟲(chóng)夏草菌的種 子液按照1 : (7-11)，如1:9,的體積比（種子液；培養(yǎng)基）接入到所述半合成培養(yǎng)基中，進(jìn)行 液體發(fā)酵。
[0013] 進(jìn)一步，向所述培養(yǎng)體系中補(bǔ)充所述碳源和所述氮源的時(shí)間具體為將所述冬蟲(chóng)夏 草菌的種子液接入到所述半合成培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵的第5-10天（如第9天）。
[0014] 在所述方法中，向所述培養(yǎng)體系中補(bǔ)充所述碳源和所述氮源具體為：向每50mL 初始培養(yǎng)體系中補(bǔ)充8-12mL(如10. 2mL)液體；所述8-12mL(如10. 2mL)液體中含有 0. 8-1. 6g(如1. 6g或0.Sg)作為碳源的所述葡萄糖、0. 35-0. 7g(如0. 7g或0. 35g)作為氮 源的所述魚(yú)蛋白腺和0. 105-0. 21g(如0. 21g或0. 105g)作為氮源的所述酵母提取物，余量 為水。
[0015] 更加具體的，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述8-12mL液體具體為10. 2mL液體； 所述10. 2mL液體具體為如下（a) - (d)中任一 ：(a) 1. 6mL濃度為500g/L的葡萄糖水溶液、 7. 0血含有l(wèi)OOg/L魚(yú)蛋白腺和30g/L酵母提取物的混合物水溶液，W及1. 6血水；化）1. 6血 濃度為500g/L的葡萄糖水溶液、3. 5mL含有l(wèi)OOg/L魚(yú)蛋白腺和30g/L酵母提取物的混合物 水溶液，W及5.ImL水；（C) 3. 2mL濃度為500g/L的葡萄糖水溶液、3. 5mL含有l(wèi)OOg/L魚(yú)蛋 白腺和30g/L酵母提取物的混合物水溶液，W及3. 5mL水；（d) 3. 2mL濃度為500g/L的葡萄 糖水溶液，W及7.OmL含有l(wèi)OOg/L魚(yú)蛋白腺和30g/L酵母提取物的混合物水溶液。
[0016]在上述方法中，所述培養(yǎng)具體為15-18°C(如18°C)U00-150巧m(如I(K)巧m)、黑 暗條件下振蕩培養(yǎng)。
[0017] 在上述方法中，所述培養(yǎng)的時(shí)間具體為6-9天（如9天）。
[0018] 在上述方法中，所述冬蟲(chóng)夏草菌的種子液具體是按照包括如下步驟的方法制備得 到；
[0019] (al)將所述冬蟲(chóng)夏草菌原始菌種接種于含有固體菌種培養(yǎng)基的平板中， 15-18°C(如15°C)黑暗培養(yǎng)90-120天（如90天），獲得冬蟲(chóng)夏草菌菌種；
[0020] 其中，所述冬蟲(chóng)夏草菌原始菌種在所述固體菌種培養(yǎng)基斜面上，4C黑暗保存，接 種時(shí)由接種針挑取表面積約為1平方厘米的菌絲體轉(zhuǎn)接入所述固體菌種培養(yǎng)基中。
[0021] (a2)將所述冬蟲(chóng)夏草菌菌種用水制成菌懸液，將所述菌懸液接種于液體菌種培養(yǎng) 基中，15-18°C(如18°C)UOO-150巧m(如100巧m)、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)12-16天（如14 天），得到冬蟲(chóng)夏草菌第一菌種液；
[0022] 其中，水的用量為IOml;將所述菌懸液接種于液體菌種培養(yǎng)基中為將所述菌懸液 按照1: (2-6)，如1:4,的體積比接種于液體菌種培養(yǎng)基中。
[002引（曰3)將所述冬蟲(chóng)夏草菌第一菌種液按照1;(7-11)，如1:9的體積比接種于所述液 體菌種培養(yǎng)基中，15-18°C(如18°C)U00-150巧m(如I(K)巧m)、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)12-16 天（如14天），得到冬蟲(chóng)夏草菌第二菌種液；所述冬蟲(chóng)夏草菌第二菌種液即為所述冬蟲(chóng)夏 草菌的種子液。
[0024]進(jìn)一步，每升所述固體菌種培養(yǎng)基的組成如下；30. 0-50.Og(如50.Og)麥款、 200.Og±豆、10. 0-20.Og(如 20.Og)葡萄糖、3. 0-5.Og(如 5.Og)魚(yú)蛋白腺、1.0-2.Og(如 1.Og)酵母提取物、20.Og瓊脂，余量為水。
[00巧]每升所述液體菌種培養(yǎng)基的組成如下；30. 0-50.Og(如50.Og)麥款，200.Og±豆， 10. 0-20.Og(如 20.Og)葡萄糖，3. 0-5.Og(如 5.Og)魚(yú)蛋白腺，1.0-2.Og(如LOg)酵母提 取物，余量為水。
[002引在本發(fā)明中，所述冬蟲(chóng)夏草菌具體為冬蟲(chóng)夏草菌（Ophiocordyceps sinensis) 1621CGMCCN0. 6445。該菌種已于2012年9月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中必（簡(jiǎn)稱CGMCC)。
[0027] 本發(fā)明提供了一種在冬蟲(chóng)夏草液體發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充碳源和氮源W提高菌絲體產(chǎn) 量的方法。實(shí)驗(yàn)證明，該方法具有操作簡(jiǎn)便、生長(zhǎng)速度快、周期短、產(chǎn)率高（18天可到17. 5g/L)等優(yōu)點(diǎn)。采用本發(fā)明所述方法所得的冬蟲(chóng)夏草菌絲體可更大地滿足市場(chǎng)對(duì)冬蟲(chóng)夏草的需 求，緩解了市場(chǎng)需求對(duì)自然資源的壓力?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明可產(chǎn)生較好的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效 益，市場(chǎng)前景廣闊。
[002引保藏說(shuō)明
[0029] 建議分類命名：冬蟲(chóng)夏草菌
[0030]拉了名：（0地iocordyc巧Ssinensis)
[0031] 參據(jù)的生物材料（株）：1621
[0032]保藏機(jī)構(gòu)；中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中必 [003引保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱；CGMCC
[0034]地址；北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)[003引保藏日期：2012年9月4日
[0036] 保藏中必登記入冊(cè)編號(hào)；CGMCCNo. 6445
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的冬蟲(chóng)夏草菌為冬蟲(chóng)夏草菌（Ophiocordyceps sinensis)1621CGMCCNO. 6445〇 冬蟲(chóng)夏草菌（Ophiocordycepssinensis)1621CGMCC NO. 6445,是分離自青海果洛州的一株野生冬蟲(chóng)夏草上，該菌種已于2012年9月4日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中必（簡(jiǎn)稱CGMCC)。
[0040] 下述實(shí)施例中用于制備固體培養(yǎng)基平板的培養(yǎng)皿均相同，直徑為9. 0cm。用于液體 種子液培養(yǎng)和液體補(bǔ)料培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)瓶均相同，為250mLH角瓶，使用封口膜隔離。
[0041] 下述實(shí)施例中的培養(yǎng)基如下：
[0042] 每IL固體菌種培養(yǎng)基由如下物質(zhì)制成；50.Og麥款，200.Og±豆，20.Og葡萄糖， 5.Og魚(yú)蛋白腺，1.Og酵母提取物，20.Og瓊脂，用水定容至lOOOmL。
[0043] 每IL液體菌種培養(yǎng)基由如下物質(zhì)制成；50.Og麥款，200.Og±豆，20.Og葡萄糖， 5.Og魚(yú)蛋白腺，1.Og酵母提取物，用水定容至lOOOmL。
[0044] 每IL半合成培養(yǎng)基由如下物質(zhì)組成；50.Og葡萄糖，10.Og魚(yú)蛋白腺，3.Og酵母提 取物，磯酸二氨鐘1.Og,硫酸鎮(zhèn)0. 5g，用水定容至lOOOmL。
[004引上述培養(yǎng)基抑自然即可。
[0046] 液體菌種培養(yǎng)基和固體菌種培養(yǎng)基的配制方法如下；將麥款煮沸10分鐘，加入切 成小塊的去皮±豆再煮沸半小時(shí)，然后用紗布過(guò)濾，在濾液中，按上述配方加入其他成分， 用水定容至1000血，i2rc濕熱滅菌半小時(shí)得到培養(yǎng)基。
[0047] 上述半合成培養(yǎng)基的配制方法如下：將葡萄糖、魚(yú)蛋白腺、酵母提取物、無(wú)機(jī)鹽等 共同溶解后，8磅滅菌后半小時(shí)后得到培養(yǎng)基。
[0048] 下述實(shí)施例中作為補(bǔ)料的碳源溶液和氮源溶液如下：
[0049] 碳源溶液為濃度為500g/L的葡萄糖水溶液，經(jīng)8磅滅菌后備用；氮源溶液為含有 lOOg/L的魚(yú)蛋白腺和30g/L的酵母提取物的