專利名稱：一株淡紫擬青霉及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株淡紫擬青霉及其應(yīng)用，特別涉及淡紫擬青霉在防控熱帶亞熱帶地區(qū)香蕉等熱帶果樹蔬菜根結(jié)線蟲病和香蕉枯萎病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物線蟲病是ー種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，危害3000多種植物。全球每年因線蟲造成的損失高達1000多億美元。在我國，線蟲危害果樹、花、蔬、糧、油、林、煙草、藥材等幾乎所有作物，成為農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的重要限制因子之一。香蕉是重要的熱帶水果，但香蕉線蟲在我國華南地區(qū)普遍發(fā)生，同時誘發(fā)枯萎病、根腐病和細菌性軟腐病等多重土傳 病害。嚴重威脅我國香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。長期以來，生產(chǎn)上對香蕉線蟲病主要是采用化學防治，這些殺線蟲劑毒性強，污染環(huán)境，殘留含量高，缺乏安全、有效的防控手段，因此生物防治受到廣泛重視。目前，汪軍和黃俊生等分離到了兩株對香蕉根結(jié)線蟲具有致病性的淡紫擬青霉E7菌株(汪軍，劉磊，李傳東，劉昌燕，黃俊生.淡紫擬青霉E7菌株對香蕉根結(jié)線蟲的致病性和生防效果.中國植保導(dǎo)刊.2008年第10期)和淡紫擬青霉PL04菌株(汪軍，黃俊生*，鄧國平，趙培靜，楊臘英，陳希德.淡紫擬青霉PL04菌株抗逆性及其對香蕉根結(jié)線蟲的寄生作用.西北農(nóng)業(yè)學報.2009，18(3):263-267)。雖然，已得到了對香蕉根結(jié)線蟲具有致病性的菌株，但還需分離對香蕉根結(jié)線蟲具有更高致病性的菌株，以加速高效穩(wěn)定的生物殺線蟲劑的開發(fā)進程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的ー個技術(shù)問題是提供一株淡紫擬青霉。本發(fā)明所提供的淡紫擬青霉是淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5951。該菌種已于2012年04月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCOo本發(fā)明的淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus) E16 CGMCC No. 5951 在查氏培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)7d，菌落直徑為40mm，菌落很干燥與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取，中央為淡紅色，周圍為白色；菌絲呈絨毛狀，長而細。分生孢子梗呈掃帚狀，菌絲較長，分生孢子為橢圓形，成串呈不分枝的鏈狀。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種殺線蟲劑。本發(fā)明所提供的殺線蟲劑，它的活性成分是上述淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus) E16CGMCC No. 5951。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供以上述淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus) E16CGMCC No. 5951為活性成分的下述I) _5)中的任一種產(chǎn)品I)增加香蕉果實產(chǎn)量的產(chǎn)品；
2)增加香蕉根重的產(chǎn)品；3)增加香蕉株高的產(chǎn)品；4)増加香蕉地上部分重量的產(chǎn)品；5)防治由尖孢錸刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害的產(chǎn)品。在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物病害具體為香蕉枯萎病。所述淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCCNo. 5951具體可為分生抱子或/和菌絲體。所述殺線蟲劑可用于防治由南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和爪日圭根結(jié)線蟲(Meloidogyne Goeidi)中的至少一種引起的植物蟲害。在本發(fā)明的一個實施例中，所述植物蟲害具體為香蕉根結(jié)線蟲病。實驗證明，4X106cfu/mL 的淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCCNo. 5951孢子懸液對南方根結(jié)線蟲卵的相對寄生率為39. 43% ;淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)E16 CGMCC No. 5951固體菌劑,在盆栽實驗中對2齡香蕉根結(jié)線蟲的防治效果為86. 37%，對香蕉根重的增長率為37. 76%，對香蕉株高的增長率為56. 47%，對香蕉地上部分的增長率為38. 03% ;小區(qū)實驗中對香蕉根結(jié)線蟲的防治效果為83. 03%,對香蕉果實的增產(chǎn)率為28. 05%。而且，淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16 CGMCCNo. 5951對香蕉枯萎病的防治效果達83. 2%。生物材料信息分類命名淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)菌株編號E16保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2012年04月06日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 5951下面結(jié)合具體實施例詳細描述本發(fā)明，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的淡紫擬青霉E7菌株(汪軍，劉磊，李傳東，劉昌燕，黃俊生.淡紫擬青霉E7菌株對香蕉根結(jié)線蟲的致病性和生防效果.中國植保導(dǎo)刊.2008年第10期)，公眾可從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所獲得。下述實施例中的淡紫擬青霉PL04菌株(汪軍，黃俊生*，鄧國平，趙培靜，楊臘英，陳希德.淡紫擬青霉PL04菌株抗逆性及其對香蕉根結(jié)線蟲的寄生作用.西北農(nóng)業(yè)學報.2009, 18(3) :263-267)，公眾可從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所獲得。下述實施例中的尖孢錸刀菌古巴?；?號生理小種(Fusarium oxysporumf. sp. cubense race 4，F(xiàn)0C4) B2 菌株(F0C4-B2)(齊興柱，楊臘英，黃俊生.F0C4 的 2 個過氧化氫酶基因的克隆與表達分析.及其引起的香蕉苗活性氧迸發(fā)研究中國農(nóng)學通報2012，28(15) : 163-169)，公眾可從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所獲得。實施例I、淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCC No. 5951 的分離及鑒
定I、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的分離從中國海南省香蕉種植地選擇線蟲病重發(fā)田中的香蕉植株，采集根部土樣，采用透明圈篩選法從土壤里分離擬青霉。選取一定量土樣置于加有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，180r/min，28°C震蕩lh，讓土樣充分打散，靜置lOmin，再用無菌水稀釋成不同稀釋度的土壤懸浮液，取一定量的土壤懸浮液涂布于殼聚糖選擇性培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4 6天，挑取單菌落進行平板劃線純化，并置于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，挑取單菌落進行反復(fù)純化，得·到E16菌株。2、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的鑒定I)形態(tài)鑒定將E16菌株劃線接種于查氏培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7d，觀察菌落形態(tài)。另取培養(yǎng)的菌落，適當稀釋后于顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示E16菌株在查氏培養(yǎng)基上菌落直徑為40mm，菌落很干燥與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑取，中央為淡紅色，周圍為白色；菌絲呈絨毛狀，長而細。顯微鏡下觀察到的形態(tài)特征分生孢子梗呈掃帚狀，菌絲較長，分生孢子為橢圓形，成串呈不分枝的鏈狀。2)分子鑒定E16菌株經(jīng)反復(fù)純化后，于查氏培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，將單菌落進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒回收純化，由寶生物工程(大連)有限公司測定得擬青霉E16的ITS序列，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST分析，結(jié)果表明，與該菌株ITS序列最為接近的為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus),其ITS序列同源性為97%,結(jié)合菌株E16的形態(tài)學特點,將該菌株鑒定為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。其中，淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCCNo. 5951的ITS序列如序列表中的序列I所
/Jn o淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16已于2012年04月06日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5951。3、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的抗逆特性淡紫擬青霉(PaecilomycesIilacinus)E16CGMCC No. 5951 有較強的抗逆性,淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951菌落生長和產(chǎn)抱的適宜溫度為5 400C，最適溫度為29°C;在pH值4 13范圍內(nèi)的PDA培養(yǎng)基中均可以生長，其最適生長pH值為7 ;在NaCl濃度為0. 05 0. 25mol/L條件下，NaCl對菌株E16的生長有一定的促進作用有較強的耐鹽能力；對氯霉素有較強的耐受性。實施例2、淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCC No. 5951 對南方根結(jié)線蟲(番茄)卵的寄生性I、南方根結(jié)線蟲卵粒懸浮液的制備將帶有大量南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)根結(jié)的番爺病根洗凈,在解剖鏡下挑取卵囊，用1%的次氯酸鈉表而消毒3min，后無菌水漂洗5次，掏碎卵囊用滅菌水調(diào)節(jié)使懸浮液中卵粒為100個/mL。2、淡紫擬青霉孢子懸浮液的制備將淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus) E16CGMCC No. 5951 菌株、淡紫擬青霉E7菌株和淡紫擬青霉PL04菌株分別在PDA培養(yǎng)基上，25°C下培養(yǎng)7d (天)后，用無菌水將培養(yǎng)基上的孢子洗出，用血球計數(shù)板計數(shù)算出孢子濃度，配制成濃度為4X106cfu/mL的孢子懸浮液。3、淡紫擬青霉孢子懸浮液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的影響實驗設(shè)四個處理，分別為淡紫擬青霉E16組、淡紫擬青霉E7組、淡紫擬青霉PL04組和對照組。
淡紫擬青霉E16組按照如下方法處理在經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿加入ImL卵粒懸浮液，姆皿加4mT,淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951抱子懸浮液(4X106cfu/mL)，25°C、培養(yǎng)3d后隔日鏡檢，統(tǒng)計各皿中孵化幼蟲數(shù)。淡紫擬青霉E7組按照如下方法處理在經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿加入ImL卵粒懸液，每皿加4mL淡紫擬青霉E7菌株孢子懸浮液(4 X IO6Cf u/mL)，25°C、培養(yǎng)3d后隔日鏡檢，統(tǒng)計各皿中孵化幼蟲數(shù)。淡紫擬青霉PL04組按照如下方法處理在經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿加入ImL卵粒懸浮液，每皿加4mL淡紫擬青霉PL04菌株孢子懸浮液(4X 106cfu/mL)，25°C、培養(yǎng)3d后隔日鏡檢，統(tǒng)計各皿中孵化幼蟲數(shù)。對照組按照如下方法處理在經(jīng)過高壓滅菌的培養(yǎng)皿加入ImL卵粒懸浮液，每皿加4mL無菌水，25°C、培養(yǎng)3d后隔日鏡檢，統(tǒng)計各皿中孵化幼蟲數(shù)。其中，上述四個處理各3個重復(fù)，每個重復(fù)設(shè)3個培養(yǎng)皿。第9天，按照下式計算卵孵化率和卵相對寄生率，利用Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理卵孵化率(％)=[孵化幼蟲數(shù)/ (孵化幼蟲數(shù)+未孵化卵粒數(shù))]X 100。卵相對寄生率(%) = [(對照卵孵化率一處理卵孵化率)/對照卵孵化率]X 100。試驗結(jié)果如表I所示，表明淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)E16CGMCCN0. 5951孢子懸液對南方根結(jié)線蟲卵的孵化有明顯的抑制效果。在培養(yǎng)9天時，對照(CK)的卵孵化率達到97. 22%，所有的卵粒已基本孵化成幼蟲，而淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) E16CGMCC No. 5951 的卻只有 59. 22% 孵化，淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)E16CGMCC No. 5951孢子對卵的相對寄生率達到39. 08%優(yōu)于淡紫擬青霉E7和淡紫擬青霉PL04菌株。表I.淡紫擬青霉孢子懸液對南方根結(jié)線蟲卵的孵化的影響
權(quán)利要求
1.淡紫擬青霉(PaecilomycesIilacinus),其特征在于所述淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)的菌株號為E16,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 5951。
2.權(quán)利要求I所述的淡紫擬青霉(PaecilomycesIilacinus)在生產(chǎn)分生孢子和/或菌絲體中的應(yīng)用。
3.下述I)-6)的產(chǎn)品，它的活性成分是權(quán)利要求I所述的淡紫擬青霉(PaecilomycesIiiacinus) O殺線蟲劑； 2)増加香蕉果實產(chǎn)量的產(chǎn)品； 3)増加香蕉根重的產(chǎn)品； 4)增加香蕉株高的產(chǎn)品； 5)増加香蕉地上部分重量的產(chǎn)品； 6)防治由尖孢錸刀菌古巴?；?Fusairiumoxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害的產(chǎn)品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于所述淡紫擬青霉(PaecilomycesIilacinus)為分生孢子或/和菌絲體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的產(chǎn)品，其特征在于所述殺線蟲劑用于防治由南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和爪H圭根結(jié)線蟲(Meloidogyne Goeidi)中的至少一種引起的植物蟲害。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于所述植物蟲害為香蕉根結(jié)線蟲病。
7.權(quán)利要求I所述的淡紫擬青霉(PaecilomycesIilacinus)在制備植物殺線蟲劑中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物殺線蟲劑的靶標線蟲為南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)和爪日圭根結(jié)線蟲(Meloidogyne Goeidi)中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物殺線蟲劑用于防治香蕉根結(jié)線蟲病。
10.權(quán)利要求I所述的淡紫擬青霉(PaecilomycesIilacinus)在制備下述至少ー種產(chǎn)品中的應(yīng)用 1)増加香蕉果實產(chǎn)量的產(chǎn)品； 2)増加香蕉根重的產(chǎn)品； 3)增加香蕉株高的產(chǎn)品； 4)増加香蕉地上部分重量的產(chǎn)品； 5)防治由尖孢錸刀菌古巴?；?Fusariumoxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株淡紫擬青霉及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的淡紫擬青霉是所述淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)E16，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.5951。本發(fā)明的淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)E16CGMCC No.5951在盆栽實驗中對2齡香蕉根結(jié)線蟲的防治效果為86.37%，對香蕉根重的增長率為37.76%，對香蕉株高的增長率為56.47%，對香蕉地上部分的增長率為38.03%；小區(qū)實驗中對香蕉根結(jié)線蟲的防治效果為83.03%，對香蕉果實的增產(chǎn)率為28.05%。
文檔編號A01P3/00GK102851219SQ20121035876
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者黃俊生, 汪軍, 梁昌聰, 鄧國平, 任文彬, 郭立佳 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所