專利名稱：一種用蠶蛹培養(yǎng)擬青霉菌的方法及藥用用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擬青霉菌的培養(yǎng)技術(shù)，提供一種用蠶蛹培養(yǎng)擬青霉的方法，并公開了其藥用用途，屬于生物菌類培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
擬青霉菌屬含粉狀擬青霉菌、蟬擬青霉、細(xì)腳擬青霉等，該屬為半知菌亞門、絲孢綱、擬青霉屬真菌。該菌與蟲草菌同為蟲生真菌類。半知菌中擬青霉是包含蟲生真菌較多的一個屬，通常選用桑蠶幼蟲作為寄主培養(yǎng)擬青霉菌，培養(yǎng)期只能在養(yǎng)蠶季節(jié)進(jìn)行，并且，在培養(yǎng)中直接將擬青霉菌種噴灑在蠶幼蟲體或桑葉上，靠接觸性自然感染培養(yǎng)，容易污染環(huán)境，感染時間長，寄生率低，不利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，影響了擬青霉菌的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
目前，國內(nèi)外開發(fā)成正式藥的藥用真菌大多數(shù)集中在擔(dān)子菌亞門的層菌綱中，其次在子囊菌的核菌綱中。在半知菌中能入藥的僅有白僵菌屬的僵蠶或僵蠶蛹。關(guān)于用蠶蛹培養(yǎng)擬青霉菌及藥用用途的研究，國內(nèi)外尚末見有報道。
本發(fā)明的目的在于公開一種用蠶蛹培養(yǎng)擬青霉菌的方法，解決了用蠶幼蟲作為寄主，培養(yǎng)擬青霉菌受養(yǎng)蠶季節(jié)環(huán)境條件限制的問題；本發(fā)明的另一個目的是提供擬青霉菌的醫(yī)用用途。
本發(fā)明的采用以下技術(shù)解決方案選用蠶蛹作為寄主培養(yǎng)擬青霉菌，通過以下技術(shù)工藝實現(xiàn)
菌種制作-菌種培養(yǎng)-蠶蛹選擇-消毒處理-接種蠶蛹-培養(yǎng)僵蛹-培擬青霉霉菌(孢梗束、孢子粉)-采收干制-包裝-冷藏。
1、菌種制作采用含C、N源豐富的培養(yǎng)基，例如鮮蠶蛹(或蠶蛹粉)10g、蛋白胨8g、奶粉8g、葡萄糖10g、磷酸二鉀氫1.5g、磷酸二氫鈉1.0g、硫酸鎂500ng、水1000ml、PH5.8配制成培養(yǎng)基。
首先將鮮蠶蛹攪碎(蠶蛹粉)加500ml水，煮沸10分鐘，過濾，用此濾液溶解蛋白胨、奶粉、葡萄糖，取另一容器放入磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂元素，加入適量水溶解，合并藥液，定容1000ml。充分?jǐn)嚢韬蠓盅b在500ml三角瓶內(nèi)。每瓶250ml。將瓶口封好，置于滅菌鍋內(nèi)，在1.2Pa下滅菌30分鐘。取出，置于潔凈工作臺上，冷卻后接入黃豆粒大小的擬青霉菌種一塊，瓶口按原樣封好。
2、菌種培養(yǎng)將上述制備好的菌種置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)溫度23℃±2℃。靜止培養(yǎng)12小時，然后間歇振蕩培養(yǎng)，每隔6小時振動培養(yǎng)20-30分鐘。培養(yǎng)4-5天約100小時左右開始接種蠶蛹。
3、活蠶蛹的選擇和消毒處理將活柞、家蠶蛹從繭殼中取出。選擇無病、健壯、不發(fā)育的柞、家蠶活蛹，首先用流水沖洗干凈，然后放入75％酒精溶液內(nèi)浸泡3分鐘，取出。移入5℃無菌室備用。(儲備時間不超過6小時)。
4、接種蠶蛹將菌種和蠶蛹移入無菌室內(nèi)工作臺上，在無菌條件下，用注射器吸取菌液注入蛹體內(nèi)柞蠶蛹0.2ml左右；家蠶蛹0.1ml左右。接種后的蠶蛹擺放在培養(yǎng)盤中培養(yǎng)。
5、培養(yǎng)僵蛹培養(yǎng)溫度15-18℃，培養(yǎng)時間5-10天。將已僵化的蠶蛹放入潔凈培養(yǎng)瓶內(nèi)，柞蠶蛹每瓶7個，家蠶蛹每瓶17個。瓶口用塑料膜封好。移入高溫室培養(yǎng)子實體。
6、培養(yǎng)擬青霉孢梗束23-25℃高溫?zé)o光條件下培養(yǎng)3天，侍菌絲從蛹體上發(fā)出時，進(jìn)行降溫光照培養(yǎng)光照強(qiáng)度為500勒克斯，溫度18℃±2，濕度90％以上。培養(yǎng)時間約25天。整個培養(yǎng)時間(從培養(yǎng)僵蛹到孢梗束長成)35天左右。
7、采收干制侍孢梗束從蛹體上長高2-7cm時，將其從培養(yǎng)瓶內(nèi)取出，裝入干燥盤中，陰干或冷凍燥。
8、包裝儲存為防止孢梗束從蛹體上脫落，采用真空包裝，在-2℃度下避光保存。保存時間為3-5年。
蠶蛹擬青霉菌的用途該菌可廣乏在醫(yī)藥、食品、保健品、制酒、飲料、日用化妝品、生物防治等領(lǐng)域應(yīng)用。
在醫(yī)藥方面內(nèi)服主要用于抗炎抑菌，提高機(jī)體免疫力，預(yù)防腫瘤發(fā)生，具有清熱解毒、降膽固醇、抗疲勞和補腎壯陽等作用。可廣泛地應(yīng)用于各種腫瘤患者，免疫功能和性功能低下等患者，還可用于治療癲癇、小兒驚癇、喉痹、中風(fēng)、腦炎后遺癥、瘰疬結(jié)核及動脈硬化病等疾病。外用治丹毒搔癢、滅諸瘡瘢痕等。本發(fā)明可制成單方制劑也可與其它藥物制成復(fù)合制劑，劑型包括藥劑學(xué)中的任何劑型。
在食品方面可用于制作各種飲料、口服液、保健茶、保健酒，食品添加劑等?？善鸬娇蛊?、增強(qiáng)體力、延緩衰老。降低血脂，預(yù)防腫瘤等作用。
在外用或化妝品方面用于治療丹毒、痤瘡、粉刺，酒糟鼻、色斑等。
本發(fā)明的積極效果在于本發(fā)明以蠶蛹作為寄主，在蛹期培養(yǎng)擬青霉菌，原料蠶蛹易購、耐儲、可進(jìn)行長年培養(yǎng)，原料來源不受環(huán)境條件限制。本發(fā)明工藝在全自控?zé)o菌條件下接種，培養(yǎng)到采收包裝，整個培養(yǎng)過程約30左右天，寄生率高達(dá)98％以上，產(chǎn)品質(zhì)量好，無雜菌污染，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)吉林省中醫(yī)研究院藥理研究室藥理活性試驗表明，該菌、具有多種藥理活性無毒副作用，有些藥效高于蛹蟲草；北京中醫(yī)研究院中藥研究所對該菌化學(xué)成分測試結(jié)果為該菌含有核苷類、氨基酸、?；撬?、多糖、硒、鍺、鋅等微量元素等化學(xué)成分和天然冬蟲夏基本一致；孢子粉的多糖含量是靈芝孢子粉3倍以上、核苷類含量高于靈芝孢子粉。
為了說明本發(fā)明的藥用用途，采用同類藥物對照的試驗的形式給予證明
試驗品擬青霉菌(稱為白蛹粉)、粉狀擬青霉孢子粉(稱為白基粉)對照品蛹蟲草(稱黃基粉)、頤和春(對照陽性藥物)。
試驗動物雄性健康未成年小鼠，體重12-15g。雄性wistar健康大白鼠體重150-200g，雌性健康KM封閉群小鼠18-22g試驗方法1、對成年去勢雄性大鼠血清睪丸酮含量及附性器官重量的影響選擇wistar雄性大鼠，體重150-200g左右80只，用乙醚麻醉后摘除以側(cè)睪丸，正常飼養(yǎng)一周，使體內(nèi)雄性激素代謝后，挑選狀態(tài)健康的大鼠80只，隨機(jī)分為組，每組8只。用乙醚麻醉后摘除雙側(cè)睪丸，正常飼養(yǎng)一周，使體內(nèi)雄性激素代謝掉后，選健康大鼠隨機(jī)分組，每組8只同時設(shè)正常對照組、去勢對照組、陽性藥對照組及各大、小劑量組連1g給藥10天，每天1次對照組給同體積蒸餾水，末閃給藥后稱體重并處理死亡動物，取血離心，測血清睪酮含量，并立即剖取包皮腺、前列腺-貯精囊及提肛肌-海綿球肌，稱重并計策臟器指數(shù)。結(jié)果采用組間t檢驗統(tǒng)計。結(jié)果見表1。
表1、對雄性去勢大鼠血清睪酮含量及附性器官指數(shù)的影響(X＋S)
由表1結(jié)果可以看出，雄性大鼠去勢后與正常對照比較，無論是血清睪酮含量還是附性器官指數(shù)均較正常對照組有非常明顯的降低及減輕(p0.001)，說明去勢模型成立，各給藥組與去勢組比較血清睪丸酮含量明顯的增加趨勢。尤其是白基粉二種樣品更好些；對附怕器官指數(shù)各給藥組對包皮腺的重量均有非常顯著的增加作用(p0.001)，對前列腺-貯精囊的重量，白基粉及白蛹粉有顯著的增加作用(p0.05)；對提肛肌-海棉球肌的重量，白及白蛹粉也呈現(xiàn)出明顯的使重量增加的趨勢。
2、對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響選擇健康小鼠(體重18-22g)雌雄各半，隨機(jī)分組給藥，對照組給同體積蒸餾水，每天一次，連續(xù)10天，每次給藥40min尾靜脈注射墨汁0.1ml/10g體重，置于5ml0.1的NaCl溶液中，7230分光光度計比色，并摘取肝、脾臟器、扭力天平稱重，參照NaIpem文獻(xiàn)方法計算指數(shù)K及活性。組間t檢驗比較，結(jié)果見表2
表2、對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(X±S)
結(jié)果表明，各給藥組連續(xù)1g給藥后是，均可使小鼠噬細(xì)胞的吞噬功能增強(qiáng)，而陽性藥物頤和春卻無此作用，而對于吞噬活性白基粉及白蛹粉的作用有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，黃基粉有增強(qiáng)趨勢。
3、抗疲勞作用選體重18-22g健康小鼠70只雌雄各半，隨機(jī)分為8組，分組情況及給藥劑量詳見表3，連續(xù)給藥7天，末次給藥后0分鐘將動物投入水溫282、水深35cm的游泳槽內(nèi)進(jìn)行游泳試驗，記錄每只動物的游泳時間，組間t檢驗比較結(jié)果見表3表3、抗疲勞作用(X±S)
4、抗乏氧作用將80只健康小鼠(體重)20-22g雌雄各半，隨機(jī)分為8組，一組為對照組，二組為頤和春藥物對照組，其余6組為三個樣品大、小劑量組，連續(xù)1g給荮10天，末次給藥40min后將小鼠裝入250ml的密閉廣口瓶內(nèi)，瓶內(nèi)裝5g鈉石灰，瓶口涂凡士林封閉，觀察并記錄小鼠的死亡時間，結(jié)果見表4表4、抗疲勞作用(X±S)
表3結(jié)果表明各給藥組對小鼠的抗乏氧作用與對照組比較均有延長小鼠生存時間的趨勢(p＜0.05)。
結(jié)論與討論通過上述各項藥理活性實驗表明，蠶蛹培養(yǎng)的擬青霉菌和粉狀擬青霉孢子粉和蛹蟲草均有補腎壯陽之功效，相對而言白基粉與白蛹粉的效果略好于蛹蟲草及頤和春。擬青霉菌和粉狀擬青霉菌有非常明顯的增強(qiáng)免疫功能的作用。使注射化可的松造成免疫低下的動物(胸腺明顯萎縮)免疫功能器官重量明顯增加，同時增強(qiáng)小鼠的噬細(xì)胞吞噬功能，對健體強(qiáng)身扶正固本，起到較好的作用。抗乏氧和抗疲勞試驗中粉狀擬青霉菌也有明顯的作用。
該菌、具有多種藥理活性無毒副作用，有些藥效高于蛹蟲草；北京中醫(yī)研究院中藥研究所對該菌化學(xué)成分測試結(jié)果為該菌含有核苷類、氨基酸、?；撬?、微量元素等化學(xué)成分和天然冬蟲夏基本一致；孢子粉的多糖含量是靈芝孢子粉3倍以上、核苷類含量高于靈芝孢子粉。
下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以實施例限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實施例1用柞蠶蛹培養(yǎng)粉狀擬青霉菌1、菌種制作采用鮮蠶蛹(或蠶蛹粉)10g、蛋白胨8g、奶粉8g、葡萄糖10g、磷酸二鉀氫1.5g、磷酸二氫鈉1.0g、硫酸鎂500ng、水1000ml、PH5.8配制成培養(yǎng)基。
將鮮柞蠶蛹攪碎(蠶蛹粉加500ml水)加500ml水，煮沸10分鐘，過濾，用此濾液溶解蛋白胨、奶粉、葡萄糖，取另一容器放入磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鎂元素，加入適量水溶解，合并藥液，定容1000ml。充分?jǐn)嚢韬蠓盅b在500ml三角瓶內(nèi)。每瓶250ml。將瓶口封好，置于滅菌鍋內(nèi)，在1.2Pa下滅菌30分鐘。取出，置于潔凈工作臺上，冷卻后接入黃豆粒大小的粉狀擬青霉菌種一塊，瓶口按原樣封好。
2、菌種培養(yǎng)將上述制備好的菌種置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)溫度23℃±2℃。靜止培養(yǎng)12小時，然后間歇振蕩培養(yǎng)，每隔6小時振動培養(yǎng)20-30分鐘。培養(yǎng)4-5天約100小時左右開始接種柞蠶蛹。
3、柞蠶蛹的選擇和消毒處理將活柞蠶蛹從繭殼中取出。選擇無病、健壯、不發(fā)育的柞、家蠶活蛹，首先用流水沖洗干凈，然后放入75％酒精溶液內(nèi)浸泡3分鐘，取出。移入5℃無菌室備用。(儲備時間不超過6小時)。
4、接種柞蠶蛹將菌種和柞蠶蛹移入無菌室內(nèi)工作臺上，在無菌條件下，用注射器吸取菌液注入蛹體內(nèi)柞蠶蛹0.2ml左右；接種后的蠶蛹擺放在培養(yǎng)盤中培養(yǎng)。
5、培養(yǎng)僵蛹培養(yǎng)溫度15-18℃，培養(yǎng)時間5-10天。將已僵化的蠶蛹放入潔凈培養(yǎng)瓶內(nèi)，柞蠶蛹每瓶7個，瓶口用塑料膜封好。移入高溫室培養(yǎng)孢梗束。
6、培養(yǎng)擬青霉孢梗束
23-25℃高溫?zé)o光條件下培養(yǎng)3天，侍菌絲從蛹體上發(fā)出時，進(jìn)行降溫光照培養(yǎng)光照強(qiáng)度為500勒克斯，溫度18℃±2，濕度90％以上。培養(yǎng)時間約25天。整個培養(yǎng)時間(從培養(yǎng)僵蛹到孢梗束長成)35天左右。
7、采收干制侍孢梗束從蛹體上長高2-7cm時，將其從培養(yǎng)瓶內(nèi)取出，裝入干燥盤中，陰干或冷凍燥。
8、包裝儲存為防止孢梗束從蛹體上脫落，采用真空包裝，在-2℃度下避光保存。保存時間為3-5年。
用本發(fā)明方法接種柞蠶蛹2萬個培養(yǎng)出蠶蛹粉狀擬青霉子實體18700個詳見表1
實施例2用實施例1的方法，只是在接種菌種選擇時選用孢子粉多的菌種，孢子粉的獲取方法將蠶蛹冷凍干燥后，將其放入篩中篩取。其它培養(yǎng)方法同實施例1的培養(yǎng)方法。
試驗結(jié)果2000年5月-2001年5月采用上述方法共制培養(yǎng)柞蠶蛹5000個，獲純孢子粉200g詳見下表2
實施例3蠶蛹粉狀擬青霉菌膠囊將冷凍干燥(或室溫下陰干)的人工培養(yǎng)的蠶蛹粉狀擬青霉或擬青霉孢子粉，進(jìn)行超微粉碎或粉碎后過120目篩后，直接插入膠囊或加入輔料充分混合后裝入膠囊。每粒025g一日三次、每次4-6粒。溫水或黃酒送服。治療腫瘤和惡性腫瘤，鎮(zhèn)痛、安神。
實施例4粉狀擬青霉孢子粉加入靈芝孢子粉膠囊取粉擬青霉孢子粉500g、靈芝孢子粉500g、攪拌均勻，裝入膠囊，每粒重05g每粒含粉擬青霉孢子粉和靈芝孢子粉各025克。主治各種腫瘤和惡性腫瘤，治療白血病、風(fēng)濕病痛等癥。
實施例5粉擬青霉菌有效成分及有效部位群提取及其制劑將培養(yǎng)的粉擬青霉菌絲和子實體粉碎、加水浸泡2小時、煮沸提取或用50％乙醇回流提取有效成分部分，經(jīng)濃縮、干燥后再粉碎過120目，裝膠囊或壓片。
實施例6蠶蛹粉狀擬青霉飲料將蠶蛹粉擬青霉10g切成薄片，加水500ml煮沸、過濾、濃縮100ml、3度冰葙保存?？商岣邫C(jī)體免疫力、防止動脈硬化。
實施例7粉擬青霉酒將蠶蛹粉擬青霉75g切成溥片，加入500ml白酒中，浸泡一周，日服三次，每次20ml，抗疲勞，對神經(jīng)衰弱、風(fēng)濕痹痛有療效。
實施例8蠶蛹粉擬青霉化妝品配方為將蠶蛹粉擬青霉或孢子粉提取濃縮液滅菌后，冷卻至85度，然后將其加入到紅花油或其它潤膚劑中進(jìn)行乳化反應(yīng)，并不斷攪拌，然后通冷卻水，40度時加入香精，35度后停止攪拌，侍抽檢化驗合格后即可分裝。
本產(chǎn)品對皮膚有治療作用如斑、粉刺、防曬等。
權(quán)利要求
1.一種蠶蛹培養(yǎng)擬青霉菌方法，其特征在于以蠶蛹作為寄主，通過以下步驟制成擬青霉菌菌種制作、菌種培養(yǎng)、蠶蛹選擇、消毒處理、接種蠶蛹、培養(yǎng)僵蛹、培擬青霉霉菌、采收干制、包裝冷藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于擬青霉菌包括粉狀擬青霉菌、蟬擬青霉、細(xì)腳擬青霉、粉狀擬青霉孢梗束、粉狀擬青霉素孢子粉。
3.擬青霉菌在制備治療或預(yù)防腫瘤和惡性腫瘤疾病的藥物的應(yīng)用。
4.擬青霉菌在制備治療或預(yù)防癲癇、小兒驚癇疾病的藥物的應(yīng)用。
5.擬青霉菌在制備治療或預(yù)防動脈硬化、預(yù)防心、腦血管疾病的藥物的應(yīng)用。
6.擬青霉菌在制備治療或預(yù)防病毒性肝炎疾病的藥中應(yīng)用。
7.擬青霉菌在制備治療或預(yù)防免疫功能低下、抗疲勞、抗乏氧疾病的藥中應(yīng)用。
8.擬青霉菌在制備治療或預(yù)防性功能低下疾病藥物中的應(yīng)用。
9.擬青霉菌在制備食品中的應(yīng)用。
10.擬青霉菌在制備化妝品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用蠶蛹培養(yǎng)擬青霉菌的方法及藥用用途,以蠶蛹作為寄主,通過菌種制作－菌種培養(yǎng)－蠶蛹選擇－消毒處理－接種蠶蛹－培養(yǎng)僵蛹－培擬青霉霉菌(孢梗束、孢子粉)－采收干制－包裝－冷藏等工藝,在蛹期培養(yǎng)擬青霉菌。原料蠶蛹易購、耐儲、可進(jìn)行長年培養(yǎng),原料來源不受環(huán)境條件限制。本發(fā)明工藝在全自控?zé)o菌條件下接種,培養(yǎng)到采收包裝,整個培養(yǎng)過程約30左右天,寄生率高達(dá)98%以上,產(chǎn)品質(zhì)量好,無雜菌污染。本發(fā)明還公開了其藥用用途,用于治療或預(yù)防心腦血管、惡性腫瘤、性功能低下、癲癇、免疫功能低下、動脈硬化等疾病藥物中。
文檔編號C12N1/14GK1327047SQ0112794
公開日2001年12月19日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月19日
發(fā)明者徐哲, 徐道田, 苑桂華, 唐國鎮(zhèn), 金順姬, 王波 申請人:吉林東北虎藥業(yè)股份有限公司