一種淡紫擬青霉的液體發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種淡紫擬青霉的發(fā)酵方法，具體的涉及一種淡紫擬青霉液體發(fā)酵方 法，屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 淡紫擬青霉屬于內(nèi)寄生性真菌，是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能夠寄生于卵， 也能侵染幼蟲和雌蟲，可明顯減輕多種作物根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危 害。該屬主要特征是分生孢子梗呈瓶狀或近球形(瓶梗），在菌絲端或短枝上輪生，分生孢子 單孢鏈狀，至今該屬報道有近50個種，皆為昆蟲病原菌和線蟲病原菌。
[0003] 淡紫擬青霉廣泛分布于世界各地，具有功效高、寄主廣、易培養(yǎng)等優(yōu)點，特別在控 制植物病原線蟲方面功效卓著。半個多世紀以來，國內(nèi)外許多專家學(xué)者對此菌進行了廣泛 而深入的研究，在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、大量培養(yǎng)、控害效能與田間應(yīng)用等方面取得了一系列研 究成果。
[0004] 但對淡紫擬青霉的發(fā)酵方法研究還不是非常成熟，實驗室的培養(yǎng)方法，在實際生 產(chǎn)中并不能同比例放大，在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵液的菌含量等指標明顯降低，無法大規(guī)模生產(chǎn)。
[0005] 專利CN201110274968.X公開了一種淡紫擬青霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，但其制備的 淡紫擬青霉發(fā)酵液的孢子、菌體的含量都不高，且其采用的培養(yǎng)方法為搖床培養(yǎng)，并不適用 于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
[0006] 現(xiàn)有的淡紫擬青霉液體發(fā)酵技術(shù)具有以下缺陷：（1)淡紫擬青霉發(fā)酵液的孢子含 量低；（2)淡紫擬青霉發(fā)酵液的孢子萌發(fā)率較差；（3)淡紫擬青霉發(fā)酵液的菌體含量不高； (4)制備的淡紫擬青霉防治植物病蟲害的效果不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種淡紫擬青霉液體發(fā)酵方法，以實現(xiàn) 以下發(fā)明目的： 1、 提高淡紫擬青霉發(fā)酵液的孢子含量，使孢子含量為4.1 X 109~4.4 X 109個/g; 2、 提高淡紫擬青霉發(fā)酵液的孢子萌發(fā)率，使孢子萌發(fā)率為98.9~99.5%; 3、 提高淡紫擬青霉發(fā)酵液的菌體含量，使菌體含量為89~96 g/L; 4、 使本發(fā)明制備的淡紫擬青霉對荔枝蝽蟓、大豆孢囊線蟲、薊馬、褐飛虱具有明顯的防 效； 5、 使本發(fā)明制備的淡紫擬青霉具有明顯的抑制玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病 菌、棉花枯萎病的作用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案： 一種淡紫擬青霉液體發(fā)酵方法，所述的發(fā)酵方法包括菌種活化、菌種擴培和發(fā)酵步驟。
[0009] 以下是對上述技術(shù)方案的進一步改進： 所述發(fā)酵步驟:采用的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下原料組分:棉籽餅粉、硅藻土、酵母浸出粉、 紅薯粉、白砂糖、魚蛋白胨、橄欖油、甘露醇、硫酸鎂、硫酸銅、吐溫20、磷酸氫f丐、硼酸、牛膽 鹽、酪氨酸、二氧化錳、去離子水。
[0010] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的原料重量份配比為： 棉籽餅粉:硅藻土:酵母浸出粉:紅薯粉：白砂糖:魚蛋白胨:橄欖油:甘露醇:硫酸鎂:硫 酸銅：吐溫20:磷酸氫鈣：硼酸：牛膽鹽:酪氨酸：二氧化錳:去離子水=450~520: 90~105: 198~250: 280~350: 140~160: 45~53: 0.3~0.6: 0.8~1.1: 4~6: 4~6: 3.5~ 4.5: 18~22: 4~6: 0.8~1.2: 1.8~2.2: 1.8~2.3:30000〇
[0011] 所述菌種活化步驟:采用的菌種活化培養(yǎng)基包括以下原料組分:海藻多糖、山梨糖 醇、牛肉膏、天門冬酰胺、七水硫酸銅、二氧化錳、氯化鈉、氯化鈣、硼酸、檸檬酸鐵、甘露醇、 瓊脂、去離子水。
[0012] 所述菌種活化培養(yǎng)基的原料重量份配比為： 海藻多糖：山梨糖醇:牛肉膏:天門冬酰胺:七水硫酸銅:二氧化錳:氯化鈉:氯化鈣:硼 酸:檸檬酸鐵:甘露醇:瓊脂:去離子水=19~21: 14.5~15.5: 9~12: 0.02~0.04: 0.03 ~0.05: 0.04~0.05: 0.01~0.02: 0.03~0.05: 0.05~0.07: 0.02~0.04: 0.04~ 0.06: 18~23:1000。
[0013] 所述菌種擴培步驟:采用的菌種擴培培養(yǎng)基包括以下原料組分：玉米粉、山梨糖 醇、全脂奶粉、雞蛋清、天門冬酰胺、絡(luò)氨酸、二氧化錳、牛膽鹽、氯化鈣、硼酸、橄欖油、甘露 醇、硫銨、硫酸鎂、去離子水。
[0014] 所述菌種擴培培養(yǎng)基的原料重量份配比為： 玉米粉：山梨糖醇:全脂奶粉:雞蛋清:天門冬酰胺:絡(luò)氨酸:二氧化錳:牛膽鹽:氯化鈣： 硼酸:橄欖油:甘露醇:硫銨:硫酸鎂:去離子水=23~26: 6~9: 13~15: 9~10.5: 0.03~ 0.05: 0.01~0.03: 0.04~0.06: 0.02~0.03: 0.03~0.05: 0.05~0.06: 0.03~0.04: 0.04~0.06: 0.01~0.02: 0.01~0.02:1000。
[0015]所述菌種活化:培養(yǎng)溫度為29°C，培養(yǎng)時間為7天。
[0016] 所述菌種擴培：l〇〇r/min震蕩培養(yǎng)6天，控制溫度為26~28°C，濕度為35~45%。
[0017] 所述發(fā)酵步驟:接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的5%;控制攪拌轉(zhuǎn)速為60~70rpm，發(fā)酵 罐內(nèi)溫度為25~30°C，持續(xù)通入無菌空氣，發(fā)酵時間為7~10天。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 1、 本發(fā)明制備的淡紫擬青霉發(fā)酵液，孢子含量為4.1 X 109~4.4 X 109個/g; 2、 本發(fā)明制備的淡紫擬青霉發(fā)酵液，孢子萌發(fā)率為98.9~99.5%; 3、 本發(fā)明制備的淡紫擬青霉發(fā)酵液，菌體含量為89~96 g/L; 4、 本發(fā)明制備的淡紫擬青霉對荔枝蝽蟓、大豆孢囊線蟲、薊馬、褐飛虱具有明顯的防 效;將本發(fā)明制備的淡紫擬青霉發(fā)酵菌液制成孢子質(zhì)量含量為15%的菌懸液，對荔枝蝽蟓的 防效為93~95%，大豆孢囊線蟲的防效為94~97%，薊馬的防效為89~93%，褐飛虱的防效為 92~98%; 5、 本發(fā)明制備的淡紫擬青霉可明顯降低玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病菌、棉花 枯萎病的發(fā)病率； 6、 本發(fā)明淡紫擬青霉發(fā)酵方法可實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)，且含菌量穩(wěn)定，不易受雜菌污染。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1 一種淡紫擬青霉液體發(fā)酵方法 步驟1、菌種活化 (1)制備菌種活化培養(yǎng)基 所述菌種活化培養(yǎng)基為固體平板培養(yǎng)基，其制備方法為： 用電子天平準確稱取菌種活化培養(yǎng)基的原料組分，包括：海藻多糖19g、山梨糖醇 14.5g、牛肉膏9g、天門冬酰胺0.02g、七水硫酸銅0.03g、二氧化錳0.04g、氯化鈉 O.Olg、 氯化鈣0.03g、硼酸0.05g、檸檬酸鐵0.02g、甘露醇0.04g、瓊脂18g、去離子水lkg; 將上述菌種活化培養(yǎng)基原料加熱溶解，加熱至溫度70~75°C，持續(xù)加熱15~16min; 用NaOH和HC1調(diào)節(jié)pH=6后，倒至滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻至常溫，制得菌種活化培養(yǎng)基。
[0020] (2)接種與活化 選取的菌種為淡紫擬青霉菌種，保藏號為ACCC30673,為市購商品； 將菌種轉(zhuǎn)接到菌種活化培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為29°C，培養(yǎng)時間為7天。 [0021 ] 步驟2、菌種擴培 將活化后的淡紫擬青霉菌株接種于裝有菌種擴培培養(yǎng)基的300ml的錐形瓶中； 每個錐形瓶內(nèi)裝有150ml菌種擴培培養(yǎng)基，接種量為lcm2菌種活化培養(yǎng)基上的菌種； 所述菌種擴培培養(yǎng)基的配方為： 玉米粉23g、山梨糖醇6g、全脂奶粉13g、雞蛋清9g、天門冬酰胺0.03g、絡(luò)氨酸 O.Olg、二氧化錳0.04g、牛膽鹽0.02g、氯化鈣0.03g、硼酸0.05g、橄欖油0.03g、甘露醇 0.04g、硫銨O.Olg、硫酸鎂O.Olg、去離子水lkg; 用NaOH和HC1調(diào)節(jié)菌種擴培培養(yǎng)基PH為6.5。
[0022]將錐形瓶置于搖床培養(yǎng)箱內(nèi)，100r/min震蕩培養(yǎng)6天；控制溫度為26°C，濕度為 35%； 將擴培得到的菌液放置在4~6°C的冰箱內(nèi)10~12小時，備用。
[0023]步驟3、發(fā)酵 (1)制備發(fā)酵培養(yǎng)基 將發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組分精確稱量后，加入發(fā)酵罐內(nèi)； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的原料組分包括:棉籽餅粉450g、硅藻土 90g、酵母浸出粉198g、 紅薯粉280g、白砂糖140g、魚蛋白胨45g、橄欖油0.3g、甘露醇0.8g、硫酸鎂4g、硫酸銅 48、吐溫20 3.58、磷酸氫鈣188、硼酸48、牛膽鹽0.88、酪氨酸1.88、二氧化錳1.88、去 離子水30kg; 開啟攪拌，80rpm攪拌30min，調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基的pH為5; 關(guān)閉發(fā)酵罐所有進出口，升溫，使發(fā)酵罐內(nèi)壓力達到〇.l〇5MPa，溫度達到121°C，滅菌25 ~30min; 降溫，使發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度為25~26°C。
[0024] (2)接種 將步驟2擴培得到的菌液，在無菌條件下，從接種口倒入發(fā)酵罐內(nèi)，接種量為發(fā)酵罐內(nèi) 發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量的5%;接種后迅速關(guān)閉接種口。
[0025] (3)發(fā)酵 控制攪拌轉(zhuǎn)速為60rpm，發(fā)酵罐內(nèi)溫度為25~26°C，持續(xù)通入無菌空氣，保證發(fā)酵罐內(nèi) 的無菌狀態(tài);發(fā)酵時間為7天，得到發(fā)酵菌液。
[0026] 實施例2 -種淡紫擬青霉液體發(fā)酵方法 步驟1、菌種活化 (1)制備菌種活化培養(yǎng)基 所述菌種活化培養(yǎng)基為固體平板培養(yǎng)基，其制備方法為： 用電子天平準確稱取菌種活化培養(yǎng)基的原料組分，包括:海藻多糖20g、山梨糖醇15g、 牛肉膏l(xiāng)〇g、天門冬酰胺〇.〇3g、七水硫酸銅0.04g、二氧化錳0.05g、氯化鈉0.02g、氯化 鈣0.04g、硼酸0.06g、檸檬酸鐵0.03g、甘露醇0.05g、瓊脂20g、去離子水lkg; 將上述菌種活化培養(yǎng)基的原料加熱溶解，加熱至溫度75~77°C，持續(xù)加熱17~18min; 用NaOH和HC1調(diào)節(jié)pH=6后，倒至滅菌后的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻至常溫，制得菌種活化培養(yǎng)基。 [0027] (2)接種與活化 選取的菌種為淡紫擬青霉菌種，保藏號為ACCC30673,為市購商品； 將菌種轉(zhuǎn)接到菌種活化培養(yǎng)基上，進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為29°C，培養(yǎng)時間為7天。 [0028] 步驟2、菌種擴培 將活化后的淡紫擬青霉菌株接種于裝有菌種擴培培養(yǎng)基的300ml的錐形瓶中； 每個錐形瓶內(nèi)裝有150ml菌種擴培培養(yǎng)基，接種量為lcm2菌種活化培養(yǎng)基上的菌種； 所述菌種擴培培養(yǎng)基的配方為： 玉米粉25g、山梨糖醇8g、全脂奶粉14g、雞蛋清10g、天門冬酰胺0.04g、絡(luò)氨酸 0.02g、二氧化錳0.05g、牛膽鹽0.02g、氯化鈣0.04g、硼酸0.06g、橄欖油0.03g、甘露醇 0.05g、硫銨O.Olg、硫酸鎂O.Olg、去離子水lkg;