一株冬蟲夏草菌株及冬蟲夏草菌絲體粉的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種冬蟲夏草菌株（Ophiocordyceps sinensis）以及冬蟲夏草菌絲體粉的制備方法。利用新分離得到的冬蟲夏草菌株在米培養(yǎng)基上生長，模擬冬蟲夏草自然生長培養(yǎng)物，獲得具有高蟲草酸含量的蟲草菌絲，實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的固體發(fā)酵，對替代日趨減少的冬蟲夏草野生資源和保護(hù)西部地區(qū)逐步惡化的生態(tài)環(huán)境具有不可估量的社會和經(jīng)濟(jì)效益。CCTCC：M 201604120160118
【專利說明】
一株冬蟲夏草菌株及冬蟲夏草菌絲體粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株生長良好的冬蟲夏草新菌株，并將其 接種到米培養(yǎng)基上，生長產(chǎn)生類似于野生蟲草的表面菌絲覆膜，具有較高的蟲草酸含量。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草，寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，屬于可食用 的真菌。冬蟲夏草是我國一種傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲 勞等多重功效。冬蟲夏草中含量最高的活性物質(zhì)是冬蟲夏草多糖，因其可以抗氧化、抗腫瘤 和增強(qiáng)免疫力等功效而受廣大人群青睞。蟲草酸(D-甘露醇)是蟲草的一個重要質(zhì)量指標(biāo)， 它不是蟲草特有的酸，而是甘露醇(C6H1406)，也是冬蟲夏草多糖（由甘露糖、半乳糖、阿拉伯 糖、葡萄糖、巖藻糖等組成的多聚糖）的主要組分之一，具有抗自由基、抗氧化的作用，其在 治療腦血栓、腦栓塞、血管痙攣、腦溢血、排除毒索、腎功能衰竭、促進(jìn)新陳代謝等方面具有 療效。冬蟲夏草中的另一主要活性成分是蟲草素，其有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞 等多種功效。
[0003] 冬蟲夏草由于分布地區(qū)狹窄、自然寄生率低、對生活環(huán)境條件要求苛刻，所以本身 資源比較有限。近年來又由于冬蟲夏草主產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境遭到人為嚴(yán)重破壞，大量盲目不合 理采挖致使資源日趨減少，產(chǎn)量逐年下降。保護(hù)和合理利用冬蟲夏草資源，尋求通過人為干 預(yù)促進(jìn)其生存繁衍的新途徑，以滿足不斷增長的保健與藥用的需求，已經(jīng)成為迫在眉睫的 任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明利用分離得到一株新的冬蟲夏草(0. sinensis)菌株在米培養(yǎng)基上生長，模 擬冬蟲夏草自然生長培養(yǎng)物，獲得高蟲草酸含量的蟲草菌絲，實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的固體發(fā)酵，對 替代日趨減少的冬蟲夏草野生資源和保護(hù)西部地區(qū)逐步惡化的生態(tài)環(huán)境具有不可估量的 社會和經(jīng)濟(jì)效益。
[0005] 本發(fā)明的一個目的提供一種冬蟲夏草菌株，該菌株于2016年1月18日保藏于中國 典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏編號為：CCTCC:M 2016041，菌株名稱為冬蟲夏草菌株 2013HY(0phiocordyceps sinensis 2013HY)，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)。菌落呈淺黃 色，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，用接種針易挑起，表面光滑，濕潤，較粘稠，易挑取，質(zhì)地均 勻。
[0006] 所述冬蟲夏草菌株的18s rRNA的序列包括以下SEQ.N0.1序列：
[0007] TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACTGGAGGGTGTGGTGGTT TCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCTACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCG CCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCCCCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGG GTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCA CTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCGACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGG GCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAACTGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGA GTGGTGACTCGATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTACTTCCA
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供冬蟲夏草菌絲體粉的制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)提供一株冬蟲夏草菌株;所述蟲草菌株的保藏號為CCTCC:M 2016041;
[0010] (2)接種入固體培養(yǎng)基，黑暗條件下20°C下培養(yǎng)5~10天；
[0011] (3)接種至液體培養(yǎng)基，20°C發(fā)酵培養(yǎng)6~8天得蟲草菌液；
[0012 ] (4)將步驟(3)中的蟲草菌液接種到米培養(yǎng)基中，25 °C下，24h光照培養(yǎng)7天，得菌絲 體，菌絲體經(jīng)抽濾、烘干粉碎后得冬蟲夏草菌絲體粉。
[0013] 進(jìn)一步地，步驟2固體培養(yǎng)基按葡萄糖:酵母粉:蛋白胨:瓊脂為4:1:1:1~1.5的重 量比例配制，菌種接種量為1~5%。
[0014] 步驟3液體培養(yǎng)基為SDB液體培養(yǎng)基，含葡萄糖4%、酵母粉1 %、蛋白胨1 %，余量為 水。
[0015] 本發(fā)明通過蟲草菌在米培養(yǎng)基上的生長情況，對影響其生長的因素進(jìn)行了最優(yōu)篩 選，結(jié)果得到，本菌種在米培養(yǎng)基上的最適生長條件為24h光照，培養(yǎng)溫度25°C。
[0016]步驟4中米培養(yǎng)基的制備方法為：取稻米加入足量沸水浸泡30min;用水沖洗4~5 次，瀝干；12?Γ、15π?η滅菌處理后冷卻至室溫，將已滅菌的大米加入SDB培養(yǎng)液，攪拌后將 大米均勻的鋪在培養(yǎng)皿中。
[0017]蟲草菌液接種方法包括:取干燥潔凈的15mL離心管，加入培養(yǎng)所獲得的蟲草菌液， 7000rpm離心3min，去上清，加入10mL無菌水混勾清洗，7000rpm離心5min后再次去除上清， 向沉淀菌體中加入0.01 % Tween80溶液，輕輕混勾成懸池狀態(tài)待噴霧用，取制作好的米培養(yǎng) 基，使噴霧器的噴頭與培養(yǎng)基表面呈90°角垂直噴灑，蟲草菌液與米培養(yǎng)基的體積重量比為 1:1〇
[0018]冬蟲夏草蟲草酸、蟲草素活性物質(zhì)的含量分別采用下述方法測定:Nash試劑法測 定蟲草酸(D-甘露醇)含量;液相色譜法測定蟲草素含量。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用分離得到一株新的冬蟲夏草菌株（CCTCC Μ 2016041)在米培養(yǎng)基上生長，模擬冬蟲夏草自然生長培養(yǎng)物，獲得具有高蟲草酸含量的蟲 草菌絲，可實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的固體發(fā)酵。在米培養(yǎng)基中生長得到的蟲草菌株的甘露醇含量為 8.42±0.45mg/g，顯著高于各類蟲草產(chǎn)品（甘露醇含量一般在1.1~1.3mg/g)，取得了意料 不到的技術(shù)效果。說明本發(fā)明所篩選得到的蟲草菌株在米基礎(chǔ)培養(yǎng)基上仍保有較高的蟲草 酸含量，為進(jìn)一步制備冬蟲夏草系列產(chǎn)品的提供保障，對替代日趨減少的冬蟲夏草野生資 源和保護(hù)西部地區(qū)逐步惡化的生態(tài)環(huán)境具有不可估量的社會和經(jīng)濟(jì)效益。
【附圖說明】
[0020] 圖1是測定蟲草菌米培養(yǎng)第三天、第六天、第九天的菌增重量示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明所述冬蟲夏草菌株的保藏說明：保藏菌株名稱為冬蟲夏草菌株2013HY (Ophiocordyceps sinensis 2013HY)，該菌株已于2016年1月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢武漢大學(xué)。保藏編號為:CCTCC:Μ 2016041。
[0022]實(shí)施例1冬蟲夏草菌的分離
[0023] 其菌種的分離采用組織分離法采集未成熟的新鮮冬蟲夏草。洗凈，用無菌水多次 沖洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分鐘，用滅菌蒸餾水洗去升汞。在無菌條件下，切去外皮， 避開腸道，切取白凈組織，剪碎，接于分離培養(yǎng)基表面，至于5~20°C溫度條件下培養(yǎng)。上述 方法使用的分離培養(yǎng)基的配方為SDB液體培養(yǎng)基。所述SDB液體培養(yǎng)基包括葡萄糖4 %、酵母 粉1 %、蛋白胨1 %。
[0024] 實(shí)施例2冬蟲夏草的新菌株的純化鑒定
[0025]中國冬蟲夏草真菌菌種的鑒定，發(fā)現(xiàn)菌落斑、形態(tài)、大小一致，并通過顯微鏡對菌 絲進(jìn)行鏡檢，菌種單純無雜菌污染。菌落呈淺黃色，菌落與培養(yǎng)基結(jié)合不緊密，用接種針易 挑起，表面光滑，濕潤，較粘稠，易挑取，質(zhì)地均勻。可采用液體發(fā)酵方法加快菌絲的培養(yǎng)，獲 得的人工蟲草菌絲經(jīng)分子生物學(xué)18s rRNA鑒定為Ophiocordyceps sinensis。
[0026] 本發(fā)明所述人工冬蟲夏草真菌菌株(CCTCC:M 2016041)的18s rRNA的序列包括以 下序列（SEQ.N0.1):
[0027] TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACTGGAGGGTGTGGTGGTT TCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCTACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCG CCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCCCCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGG GTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCA CTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTT GAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCGACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGG GCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAACTGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGA GTGGTGACTCGATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTACTTCCA。
[0028]實(shí)施例3液體菌絲的發(fā)酵
[0029] 將實(shí)施例2中鑒定得到的菌種Ophiocordyceps sinensis(菌種保藏編號為CCTCC: M2016041)接種入固體培養(yǎng)基，黑暗條件下20°C下培養(yǎng)5~10天后轉(zhuǎn)接種到SDB液體培養(yǎng)基 (葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%)上，裝量為100ml/250ml三角瓶，培養(yǎng)溫度20°C， 150rpm。培養(yǎng)6~8天。
[0030] 實(shí)施例4米培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0031] (1)米培養(yǎng)基的制作
[0032]稱取200g大米放入燒杯中，加入足量的沸水，攪勻，浸泡30min后用水沖洗4~5遍， 用紗布徹底濾干后放入60 °C烘箱中烘干15~30min。取出后用錫箱封好放入高壓滅菌鍋121 °C，15min滅菌。將已滅菌的大米均勻分開后加入上述SDB培養(yǎng)液15mL，充分?jǐn)嚢枋沟门囵B(yǎng)液 和大米混勻。再將大米均勻的鋪在9cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)基加10g滅過菌的大米。
[0033] (2)米基蟲草菌株的接種方法
[0034] 取3支干燥潔凈的15mL離心管，依次加入5mL，10mL，15mL上述培養(yǎng)所獲得的蟲草菌 液，7000rpm離心3min，去上清，加入10mL無菌水混勾清洗，7000rpm離心5min后再次去除上 清，向沉淀菌體中加入13mL 0.01 %TWeen80溶液，用槍頭輕輕混勻成懸濁狀態(tài)待噴霧用。取 制作好的上述米培養(yǎng)基，使噴霧器的噴頭與培養(yǎng)基表面呈90°角垂直噴灑，每個培養(yǎng)基噴灑 1.5mL，每一種濃度處理9重復(fù)。
[0035]米蟲草菌生長最優(yōu)條件篩選的正交試驗(yàn)設(shè)計見表1。
[0036] 表1正交試驗(yàn)設(shè)計表
[0037]
[0038]圖1顯示了測定蟲草菌米培養(yǎng)第三天、第六天、第九天的菌增重量結(jié)果。由表2可 知，極差分析結(jié)果可得就第三天的增重量數(shù)據(jù)正交分析的試驗(yàn)號5與其余幾組有明顯差異， 試驗(yàn)號為5的培養(yǎng)條件為24h光照，培養(yǎng)溫度25 °C，10mL的菌接種量。第六天的菌增重量，以 試驗(yàn)號5，6，9的數(shù)據(jù)顯著性差異最多。到第九天時蟲草菌幾乎覆蓋米表面，各組實(shí)驗(yàn)所得的 菌增重量都沒有顯著性的差異。所以可得出結(jié)論，培養(yǎng)蟲草菌的最是條件為24h光照，培養(yǎng) 溫度25°C和10mL的菌接種量，即1:1 (mL: g)的菌米接種體積重量比。
[0039]表2各因素在第三天，第六天及第九天所得的極差值比較：
[0040]
[0041]實(shí)施例5米培養(yǎng)基蟲草菌蟲草酸(D-甘露醇)的含量測定 [0042] (1)甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定
[0043]稱取lg的甘露醇于大燒杯中，量取1L去離子水配制成lmg/mL的甘露醇溶液，取6支 試管分別編號為1~6,向其中加入0. lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL的lmg/mL的甘露醇溶 液，再加入去離子水，使格試管中的甘露醇濃度分別為10yg/mL、20yg/mL、30yg/mL、40yg/ mL、50yg/mL、0yg/mL。將配置得到的溶液分別取lmL至新的試管，試管對應(yīng)標(biāo)記1~6。再向各 試管中加入lmL高碘酸鈉溶液，室溫放置lOmirulOmin后向其中加入2mL0.01%L-鼠李酸，最 后加入1 mL的Na s h試劑，5 3 °C水浴加熱15m i η。
[0044] (2)蟲草甘露醇含量的測定
[0045] 取培養(yǎng)完全的固體培養(yǎng)基上的蟲草菌置于一個干燥的滅過菌的培養(yǎng)皿中，放在60 °C的烘箱中烘干過夜。稱取烘干后的蟲草菌0.5g置于一個50mL的離心管中超聲15min，離心 取上清，再次離心后取上清置于一個5mL的離心管中，加入一定量的去離子水定容至5mL即 0.18/!1114寺用。取6支試管分別編號為1~6，向其中加入0.11^、0.21^、0.31^、0.41^、0.51^的 0. lg/mL的蟲草液，再加入去離子水，使各試管中的蟲草液濃度分別為lmg/mL、2mg/mL、3mg/ mL、4mg/mL、5mg/mL、Omg/mL。將配置得到的溶液分別取lmL至新的試管，試管對應(yīng)標(biāo)記1~6。 再向各試管中加入lmL高碘酸鈉溶液，室溫放置lOmin。lOmin后向其中加入2mL 0.01 %L-鼠 李酸，最后加入1 mL的Na s h試劑，5 3 °C水浴加熱15m i η。
[0046] 實(shí)驗(yàn)得甘露醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y = 66.367χ+0.0641，R2 = 0.9982在 將實(shí)驗(yàn)得到的蟲草菌的樣品中測得的0D值帶入到回歸方程中，甘露醇在本發(fā)明中的米基蟲 草菌株中的含量為8.42±0.45mg/g。
[0047] 實(shí)施例6米培養(yǎng)基蟲草菌蟲草素的含量測定
[0048] 采用液相色譜法進(jìn)行蟲草素的測定，色譜柱為incrtsilS〇DS-3(4.6mmX 250mm, 5μ m)，柱溫30°C。檢測器為二極管陣列紫外檢測器，檢測波長260nm。流動相乙腈:水= 80:20， 流速 0 · 8ml/min〇
[0049] 實(shí)施例7對液體發(fā)酵和米基固體培養(yǎng)菌絲體粉的蟲草酸和蟲草素與天然冬蟲夏草 進(jìn)行了比對，如下表3。
[0050] 表 3
[0051]
[0052]在本發(fā)明涉及的蟲草菌株CS141020,在米培養(yǎng)基中生長得到的蟲草菌株的甘露醇 含量為8.42±0.45mg/g，顯著高于各類蟲草產(chǎn)品（甘露醇含量一般在1.1~1.3mg/g)。
[0053]測定上述實(shí)施例液體培養(yǎng)的菌絲體粉的蟲草素含量為20.13±3.61(yg/g)和 19.85±4.95(yg/g);天然冬蟲夏草中蟲草素的含量為21.05±6.39(yg/g)，菌絲體粉比天 然冬蟲夏草中蟲草素含量差異不顯著。
【主權(quán)項】
1. 一種冬蟲夏草菌株，其特征在于，所述冬蟲夏草菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，菌種保藏編號為CCTCC:M 2016041。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草菌株，其特征在于，所述冬蟲夏草菌株的18s rRNA的 序列包括SEQ. N0.1序列。3. -種冬蟲夏草菌絲體粉的制備方法，包括以下步驟： (1) 提供一株冬蟲夏草菌株;所述蟲草菌株的保藏號為CCTCC: Μ 2016041; (2) 接種入固體培養(yǎng)基，黑暗條件下20°C下培養(yǎng)5~10天； (3) 接種至液體培養(yǎng)基，20°C發(fā)酵培養(yǎng)6~8天得蟲草菌液； (4 )將步驟(3 )中的蟲草菌液接種到米培養(yǎng)基中，25 °C下，24h光照培養(yǎng)7天，得菌絲體， 菌絲體經(jīng)抽濾、烘干粉碎后得冬蟲夏草菌絲體粉。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2固體培養(yǎng)基按葡萄糖:酵母粉： 蛋白胨:瓊脂為4:1:1: 1~1.5的重量比例配制，菌種接種量為1~5%。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3液體培養(yǎng)基為SDB液體培養(yǎng)基， 含葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%，余量為水。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟4中米培養(yǎng)基的制備方法為:取稻 米加入足量沸水浸泡30min;用水沖洗4~5次，瀝干；121°C、15min滅菌處理后冷卻至室溫， 將已滅菌的大米加入SDB培養(yǎng)液，攪拌后將大米均勻的鋪在培養(yǎng)皿中。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟4蟲草菌液接種方法包括:取干燥 潔凈的15mL離心管，加入培養(yǎng)所獲得的蟲草菌液，7000rpm離心3min，去上清，加入10mL無菌 水混勾清洗，7000rpm離心5min后再次去除上清，向沉淀菌體中加入0.01% Tween80溶液，輕 輕混勻成懸濁狀態(tài)待噴霧用，取制作好的米培養(yǎng)基，使噴霧器的噴頭與培養(yǎng)基表面呈90°角 垂直噴灑，蟲草菌液與米培養(yǎng)基的體積重量比為1:1。
【文檔編號】C12N1/14GK105838625SQ201610279820
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】陳春, 章樹桃, 謝昕, 顧菲丹
【申請人】中國計量大學(xué)