專利名稱：輪枝擬青霉菌株及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體來說涉及輪枝擬青霉菌株，同時還涉及其用途。
背景技術：
蟲草菌素(cordyc印in)是一類首次從蛹蟲草中分離出來的核苷類抗菌物，具有 多種生物活性值，蛹蟲草可以作為冬蟲夏草的替代品，2009年通過了新食品的認證。隨著市 場對蟲草菌素的需求越來越多，而野生的蛹蟲草中蟲草菌素含量不高，一般在0. 或者更 低，很難滿足商業(yè)蟲草菌素含量要達2%的要求。隨著野生的冬蟲夏草的價格一路上漲，目 前已經(jīng)漲至每公斤20萬元左右，使野生蛹蟲草受到瘋狂采摘。所以從資源保護方面考慮， 尋找能夠產(chǎn)蟲草菌素的蛹蟲草替代菌株，擴大蟲草菌素的藥源，是極需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點而提供的一種菌株容易培養(yǎng)保存及工業(yè)化生產(chǎn)， 能夠產(chǎn)蟲草菌素的輪枝擬青霉菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供該輪枝擬青霉菌株在產(chǎn)蟲草菌素方面的用途。該菌種已于2009年12月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國武漢 武漢大學)，名稱為輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatusGZ)，保藏號CCTCC NO =M 209302。本發(fā)明的輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)，具有以下微生物學特 性1、形態(tài)學特性輪枝擬青霉GZ查氏培養(yǎng)基上，25°C，14天，菌落直徑35_55mm，隆 起，白色絨毛狀，呈不規(guī)則形；背面白色。菌絲寬約1. 2-1. 8 μ m,可形成長約9. 6-19. 8 μ m的 分生孢子梗，多數(shù)瓶梗柱狀或錐形，常輪生或互生和對生于氣生菌絲上，向上逐漸變細或突 然變細，7. 8-14. 4X1. 2-2. 4 μ m，頸部纖細，約對輪枝擬青霉，有時是基部的1. 2倍長。分生 孢子透明，光滑，明顯有大小不同的兩種孢子，大孢子梭形，橢圓型，1. 8-3.0X1. 8-2. 4 μ m， 小孢子近球形、橢圓形，1. 2-1.8X0. 6-1. 2 μ m，成直鏈或聚成團。2、培養(yǎng)學特性輪枝擬青霉GZ在沙氏培養(yǎng)基上，25°C，14天，菌落直徑35-40mm，平 展，中間隆起，白色，氈狀，具有3-5條不規(guī)則的深溝紋，邊緣不規(guī)則；背面呈淺黃色。菌絲 寬0.5-1.5μπι，分隔，透明，光滑。分生孢子梗短或無；輪生體由3-5個瓶梗組成。瓶?；?部柱狀或梭形膨大，向上逐漸或突然變細；頸部寬小于0.5 μ m。分生孢子透明，光滑，近球 形至卵圓形，1. 5-2. 5X1. 2-2. 5 μ m，排列成長鏈。輪枝擬青霉GZ在PDA固體培養(yǎng)基上，菌落直徑約55mm左右，平展，致密毯狀，灰白 色；背面淺黃色。3、生理學特性于PH 5 7，20至30°C下能正常生長。4、菌學特性根據(jù)Brown & Smith(1957)的分類標準以及擬青霉屬菌落形態(tài)特征 菌絲發(fā)育良好，分生孢子成串，分生孢子梗頂端不膨大，孢子梗頂端輪軸狀分枝，頂端的輪軸狀分枝大小不等，孢子近于球形。分生孢子和帚狀枝外無膠質(zhì)覆被。分生孢子壁薄，基部 無環(huán)狀加厚，瓶形小梗排列不規(guī)則，頂細長而彎曲，孢子叢不呈綠色。分生孢子梗和分枝比 青霉屬的更加分散。拮抗菌株鑒定為擬青霉(Paecilomyces spp)。對輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)產(chǎn)蟲草菌素的培養(yǎng)方法如下輪枝擬青霉(Paecilomycesverticillatus GZ)菌株于 PDA 斜面上，27°C，7d，活 化3次，接入到PDA液體種子培養(yǎng)基中，140rpm, 26°C，搖瓶培養(yǎng)3d，得液體母種，以0. 04 (ν/ ν)接種量接入到白砂糖2%、麥芽糖1%、牛肉膏2%、酵母膏3%的發(fā)酵培養(yǎng)基中，140rpm， 27°C，搖瓶培養(yǎng)7d,得到待測液，進行HPLC測定蟲草菌素含量。本發(fā)明主要以篩選得到的輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)為基 礎，進行完整的發(fā)酵過程，結果證明輪枝擬青霉發(fā)酵可以產(chǎn)生蟲草菌素，這可以一定程度上 緩解人們對蟲草菌素的需求。
具體實施例方式輪枝擬青霉菌株的篩選方法，包括下列步驟(1)菌株的分離方法a) 土壤樣品菌液的制備在實驗室內(nèi)，將采集回來自然條件下烘干的土壤樣品撿除枯枝敗葉、小石塊等雜 物，每份土壤土樣各稱取10g，分別溶解于裝有90mL無菌水并帶有玻璃珠的250mL三角瓶 中，充分振蕩20-30min，使土樣充分溶解后靜置20min，使土樣成為土壤菌液b) 土壤稀釋液的制備用一支無菌移液管從土壤菌液中吸取ImL 土壤菌液，加入 盛有9mL無菌水的試管中充分混勻，然后用無菌移液管從此試管中吸取ImL加入另一盛有 9mL無菌水的試管中，混合均勻，以此類按10倍法稀釋，稀釋在IiT1-IOAc)混菌法接種采用混菌法接種，吸取Iml懸液于直徑為9厘米的滅菌培養(yǎng)皿中， 然后傾注已熔化并冷卻到45°C的雙抗馬丁氏培養(yǎng)基，充分混勻，待凝固后倒置保溫培養(yǎng)。 25°C培養(yǎng)3到4天。(2)菌株的分離純化a)菌落標記待雙抗馬丁氏培養(yǎng)基中長出肉眼可見的大小不同的菌落，即在顯微 鏡下進行初篩觀察，對具有不同產(chǎn)孢結構的菌落標記。b)平板劃線法接種選用平整且圓滑的接種環(huán)在無菌的條件下挑取已經(jīng)進行菌 落標記的少量菌落孢子，并立即在雙抗馬丁氏培養(yǎng)基平板上A區(qū)劃3到4條連續(xù)的平行線， 劃完A區(qū)后立即燒掉接種環(huán)上的殘菌。將燒去殘菌后的接種環(huán)冷卻一下，并使B區(qū)轉(zhuǎn)到上 方，接種環(huán)通過A區(qū)(菌源區(qū))將菌帶到B區(qū)，隨即劃數(shù)條致密的平行線，劃完B區(qū)后立即 燒掉接種環(huán)上的殘菌，并作好A區(qū)和B區(qū)的標記，隨即將平板靜置20min，將劃線平板倒置于 恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫25°C培養(yǎng)3到4天。c)單菌落的純化選擇B區(qū)中典型的獨立的單菌落，移接至雙抗馬丁氏培養(yǎng)基平 板上，待培養(yǎng)基中長出肉眼可見的大小不同的菌落，即在顯微鏡下進行初篩觀察，將具有擬 青霉屬產(chǎn)抱結構的菌落標記，并立即移入馬丁氏平板上，恒溫培養(yǎng).直至純化后，轉(zhuǎn)移至斜 面試管保存。d)真菌的保存將單一菌落，移接至PDA斜面培養(yǎng)基上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，25°C培養(yǎng)3到4天，待觀察沒有污染后，移至于4°C的冰箱中保存?zhèn)溆谩?3)菌株的鑒定a)培養(yǎng)將固體培養(yǎng)基制成平板，以點接法接種，即用接種針尖沾取抑菌真菌少 量孢子點接在平板的中心位置，然后于25°C培養(yǎng)一定時間進行觀察，觀察時可用肉眼或借 助顯微鏡。b)標本的制作在潔凈載玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，用解剖針從霉菌 菌落的邊緣處取少許帶有孢子的菌絲于染液中，再細心地把菌絲挑成自然狀態(tài)，然后用蓋 玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。在溫暖干燥室內(nèi)放數(shù)日，讓水分蒸發(fā)一部分，使蓋玻片與載 玻片緊貼，即可封片。封片時，先用清潔的紗布或脫脂棉將蓋玻片四周擦凈，并在蓋玻片周 圍涂一圈加拿大樹膠或合成樹膠，風干后即成封閉標本，于油鏡下觀察產(chǎn)孢結構特征。c)顯微攝影照片在Motic數(shù)碼顯微鏡下，觀察并選取具典型性狀特征的視野拍 照、直接測量相關數(shù)據(jù)和進行描述記載。d)菌種的形態(tài)鑒定參考Raper (1965)以及Brown & Smith(1957)的分類系統(tǒng)和 分類標準，采用交叉選取特征，主要根據(jù)宏觀的培養(yǎng)性狀(菌落特征)，微觀的個體形態(tài)特 征及一些生物學特性進行經(jīng)典分類研究。研究相關文獻，綜合分析對比相關特征的異同，對 篩選的菌株進行形態(tài)鑒定。輪枝擬青霉菌株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)菌種活化將輪枝擬青霉(Paecilomycesverticillatus GZ)菌種接于 PDA 斜面上，26°C靜 置培養(yǎng)7天，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，保存于4°C冰箱備用。(2)孢子懸液的制備將活化好的菌株，用無菌吐溫生理鹽水洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的無菌三角瓶 中，振蕩，充分打散孢子，用4層無菌鏡頭紙過濾除去菌絲，制成均一孢子懸液。(3)種子液的制備將孢子懸液，以5% (ν/ν)接種量接種于種子培養(yǎng)液中，26°C，140rpm，搖瓶培養(yǎng)三天。(4)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液5% (ν/ν)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中白砂糖2%、麥芽糖1%、牛肉膏2%、酵 母膏3 %，140rpm, 26 °C，搖瓶培養(yǎng)7天。輪枝擬青霉菌株產(chǎn)蟲草菌素實驗(1)待測液A液的制備輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)發(fā)酵7天后，將發(fā)酵液和菌絲體 一起轉(zhuǎn)置離心管中，4000r/min離心20min，進行菌液分離，取其上清液經(jīng)0. 45um水相微濾 膜過濾除去雜質(zhì)后冷藏，待測。(2)待測液B液的制備輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)發(fā)酵7天后，將發(fā)酵液和菌絲體 一起轉(zhuǎn)置離心管中，4000r/min離心20min，進行菌液分離，去其上清液，用雙蒸水沖洗菌 絲，再離心，如此重復二次。得到基本無培養(yǎng)基的菌絲體，將其置于減壓真空干燥箱中，550C 烘干至恒重，研磨，過60目篩，得菌絲粉。精密稱取干菌絲粉0. IOg置于砂土管中，加入20%乙醇5ml，超聲處理30min，經(jīng)0. 45um水相微濾膜過濾，待測。(3)蟲草菌素標準液的制備精密秤取1. OOmg蟲草菌素，置于IOmL容量瓶中，用甲溶液溶解定容至刻度，即得 蟲草菌素標準溶液，置于冰箱內(nèi)備用。(4) HPLC 測定HPLC測定用Agilent 1100 HPLC分析檢測，通過紫外檢測儀，色譜柱采用 Kromasil cl8(4. 6mmx250mm,5ul praticle size,Scientific systems Inc. , AP,USA)；流 動相為0. 272gKH2P04溶于甲醇/雙蒸水(15 85)，柱溫40°C，流速為0. 8mL/min,檢測波 長為259nm，進樣量為IOul ；出峰時間為4. 60min左右。用HPLC測定的樣品出峰面積和已知蟲草菌素標樣的含量，根據(jù)以下公式計算出
待測樣品的濃度，再根據(jù)浸提的濃度和稀釋倍數(shù)算出蟲草菌素的相對含量。
C 樣=A樣 χ 0.10mg/ml/A標C樣為待測樣品的蟲草菌素濃度A樣為待測樣品的峰面積A標為蟲草菌素標樣的峰面積0. 10mg/ml為蟲草菌素標樣的濃度經(jīng)HPLC測定標準品(

圖1)和輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)(圖 2)及其蛹蟲草擬青霉(Peacilomyces militaris 08-01)(圖 3)的 HPLC 圖。
權利要求
一株輪枝擬青霉(Paecilomyces verticillatus GZ)CCTCC NOM209302。
2.如權利要求1所述的輪枝擬青霉在產(chǎn)蟲草菌素方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輪枝擬青霉菌株，在查氏培養(yǎng)基上，25℃，14天，菌落直徑35-55mm，隆起，白色絨毛狀，呈不規(guī)則形；背面白色。菌絲寬約1.2-1.8μm，可形成長約9.6-19.8μm的分生孢子梗，多數(shù)瓶梗柱狀或錐形，常輪生或互生和對生于氣生菌絲上，向上逐漸變細或突然變細，7.8-14.4×1.2-2.4μm，頸部纖細，約對輪枝擬青霉，有時是基部的1.2倍長。分生孢子透明，光滑，明顯有大小不同的兩種孢子，大孢子梭形，橢圓型，1.8-3.0×1.8-2.4μm，小孢子近球形、橢圓形，1.2-1.8×0.6-1.2μm，成直鏈或聚成團。本發(fā)明還公開了其用途，能通過發(fā)酵產(chǎn)蟲草菌素，且菌株容易培養(yǎng)和保存及工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK101942394SQ201010187300
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權日2010年9月28日
發(fā)明者任秀秀, 周禮紅, 李祝, 梁宗琦, 肖洋, 韓燕峰 申請人:貴州大學