一種克隆胚胎構(gòu)建的改進方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆胚胎構(gòu)建的改進方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 動物克隆是指動物不經(jīng)過有性生殖的方式而直接獲得與親本具有相同遺傳性狀 后代的過程，包括孤雌生殖、卵裂球分離與培養(yǎng)、胚胎分割以及細胞核移植等。目前，廣為人 知的動物克隆技術(shù)實際上就是指細胞核移植技術(shù)。傳統(tǒng)的細胞核移植技術(shù)通常是指通過 顯微操作的方法，將供體細胞的細胞核注入預先去核的成熟卵母細胞或早期合子內(nèi)，形成 一個新的重構(gòu)胚，重構(gòu)胚經(jīng)過融合激活后發(fā)生發(fā)育程序重編，經(jīng)細胞分裂、分化并在代孕母 體內(nèi)發(fā)育成一個新的個體。包括卵母細胞去核、注供體細胞、融合供體細胞并激活、體外培 養(yǎng)、胚胎移植等一系列操作的復雜過程，每一個操作步驟都會影響到核移植的最終效率。自 1997年〃Dolly〃羊出生以來，研究者就不斷對核移植過程中的每個技術(shù)環(huán)節(jié)進行改進。手 工克?。╤andmade cloning，HMC)技術(shù)改進去核操作步驟，在體視顯微鏡下用特制的切割 刀直接切割去核，然后將兩個不含有細胞核的半卵與一個供體細胞靠近并施以直流電脈沖 使其融合，最后將重構(gòu)胚單個培養(yǎng)。整個過程不需要顯微操作儀，Vajta等（Vajta et al， 2001)將其稱之為手工克隆。杜玉濤（2011)研究表明與傳統(tǒng)的體細胞核移植相比，手工克 隆技術(shù)能大幅度提高體細胞核移植的囊胚率。
[0004] 將卵母細胞質(zhì)中的核去除掉，這個過程稱之為去核。卵母細胞的去核是體細胞核 移植技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，在去除盡量少胞質(zhì)的情況下同時保證去核干凈。若胞質(zhì)去除過 多，會使卵母細胞內(nèi)累積的蛋白質(zhì)，mRNA流失過多，影響供體細胞的重編程。若去核不完全 會導致重構(gòu)胚染色體非整倍性，造成多倍體，卵裂異常，發(fā)育受阻，胚胎早期死亡等。去核效 率的高低直接關(guān)系到所構(gòu)建克隆胚胎體外發(fā)育和受體移植妊娠率及產(chǎn)犢率的高低。
[0005] 傳統(tǒng)細胞核移植技術(shù)的去核方法有盲吸去核法，染色去核法和spindle-view法。 但是每種方法都存在一定的缺點，人們一直在尋求更好的方法。比如(劉東，2004)的擠壓去 核法，用玻璃針在極體附近透明帶刺穿一個切口，推擠卵母細胞，使第一極體連同其附近 的1/4~1/3胞質(zhì)溢出透明帶。（郭繼彤，2002)用蔗糖高滲溶液對牛卵母細胞進行短時培 養(yǎng)，大部分卵母細胞的紡錘體部位突出于卵膜表面，指示去核操作。這些都是在嘗試對卵 母細胞的去核操作方法進行改進。后來發(fā)展起來的手工克隆技術(shù)（Vajta 2007)直接用刀 切除一半卵，以達到去核干凈的目的。
[0006] 盲吸去核法（圖2)是根據(jù)成熟卵母細胞的特點，去除極體附近的約1/3胞質(zhì)，達到 去核目的，操作簡潔迅速，但是去核過程中會使卵母細胞第一極體的位置發(fā)生改變，影響去 核效果，去核效率相對較低，一般在70%。染色法去核利用DNA特異性染料H〇echeSt33342 將整個卵母細胞染色后，借助熒光顯微鏡顯示染色體去核的方法，可以去除少量胞質(zhì) 和保證100%去干凈，但是紫外線的照射會損傷胚胎活力（Tsunda，1988)。后來發(fā)展的 spindle-view法，是利用偏振光折射直接獲取紡錘體鏡像，不需要染色就能觀察到卵母細 胞內(nèi)的紡錘體，去核率可以達到95%以上，但是價格昂貴，不利于推廣應用。手工去核直接 用刀切，相對去除的胞質(zhì)更多（圖1)，然后再將2枚半卵融合彌補去除胞質(zhì)過多的情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種克隆 胚胎構(gòu)建的改進方法。
[0008] 本發(fā)明所要解決的上述技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)： 一種克隆胚胎構(gòu)建的改進方法，包含如下步驟： 51. 將卵母細胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作； 52. 將去除細胞核的胞質(zhì)部分置于染色液滴中，直接在熒光鏡下觀察胞質(zhì)的著色情況， 然后將對應的去核干凈的卵母細胞備用； 53. 將去核干凈的卵母細胞放入操作液滴B中靜置，然后移放到含有供體細胞的操作 液滴C中，先將一枚卵母細胞與一枚供體細胞粘合，然后再與另一枚卵母細胞粘合在一起， 其排列順序為體細胞一卵細胞一卵細胞； 54. 將粘合好的體細胞一卵細胞一卵細胞先在融合激活液中靜置，再移到融合槽中進 行電融合，即得克隆胚胎。
[0009] 本發(fā)明所述的克隆胚胎構(gòu)建的改進方法，是發(fā)明經(jīng)過大量的實驗摸索而得到的， 該方法綜合了幾種現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點，摒棄了其缺點；如吸收了盲吸法（圖2)操作簡潔迅速 的優(yōu)點，克服了其去核效率相對較低的缺點；采用了改進的染色法，吸收了染色方法去核干 凈(去核率100%)且效率高的優(yōu)點，又避免了傳統(tǒng)方法中卵母細胞被紫外光照射，損傷胚胎 活力的缺點；最后結(jié)合改進的手工克隆技術(shù)，融合更多的胞質(zhì)，從而提尚效率。
[0010] 優(yōu)選地，所述的卵母細胞為豬卵母細胞；所述的供體細胞為豬供體細胞。
[0011] 優(yōu)選地，S1.中所述的操作液滴A由無鈣的H-NCSU-23和7. 5 y g/ml細胞松弛素B (CB)組成； 52. 中所述的染色液滴由無鈣的H-NCSU-23和10 y g/ml的Hoechst33342組成； 53. 中所述的操作液滴B由無鈣的H-NCSU-23和2mg/mL的植物凝集素（PHA)組成； S3.中所述的操作液滴C為無鈣的H-NCSU-23。
[0012] 優(yōu)選地，S2.中所述的在熒光鏡下觀察胞質(zhì)的著色情況的判斷方法為：若胞質(zhì)只 有1個點不發(fā)亮（圖4)，則證明去核不干凈；若胞質(zhì)有2點發(fā)亮（圖5)，則證明對應的卵母細 胞去核干凈。
[0013] 優(yōu)選地，S3.中所述的靜置時間為l~10s。
[0014] 優(yōu)選地，S4.中所述的靜置時間為l~5min。
[0015] 優(yōu)選地，S4.中所述的融合激活液含有如下組分：0? 25mol/LMannitol，0. lmmol/L CaC12 ? 2H20,0. lmmol/L Mg-C12 ? 6H20,0. 5mmol/L HEPES，0. 01% PVA(w/v)。
[0016] 優(yōu)選地，S4.中所述的電融合使用直流電進行，參數(shù)為：80V/mm，100 y s，脈沖次 數(shù)為2~3次。
[0017] 優(yōu)選地，在S4.中所述的融合槽中，卵母細胞胞質(zhì)緊挨電極的一端，體細胞位于融 合槽的中間。
[0018] 優(yōu)選地，S1.中所述的去核操作和S2.中所述的染色操作在操作盤內(nèi)完成操作；所 述的操作盤（圖3)做成4排，每排含5個液滴，其中一排含操作液滴，緊鄰 的一排含染色液滴。
[0019] 有益效果：本發(fā)明提供一種全新的克隆胚胎構(gòu)建方法，其具有操作簡潔迅速、去核 干凈且效率高、克隆效率高等優(yōu)點；此外，經(jīng)本發(fā)明方法得到的克隆胚胎可顯著提高胚胎體 外發(fā)育的囊胚率。
【附圖說明】
[0020] 圖1為手工去核技術(shù)示意圖。
[0021 ] 圖2為盲吸法去核技術(shù)示意圖。
[0022] 圖3為操作盤圖。
[0023] 圖4為焚光鏡下去核不干凈的胞質(zhì)圖（A白光；B焚光)。
[0024] 圖5為焚光鏡下去核干凈的胞質(zhì)圖（A白光；B焚光)。
[0025] 圖6為熒光顯微下鏡囊胚細胞計數(shù)圖。
【具體實施方式】
[0026] 以下結(jié)合具體實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例對本發(fā)明不做任何形式的限 定。
[0027]實驗研究所用試劑未經(jīng)特殊說明均購自SIGMA公司。胎牛血清（GIBC0)，生理鹽 水(紫光古漢集團衡陽制藥有限公司）；細胞培養(yǎng)相關(guān)耗材為Corning公司產(chǎn)品；卵母細胞 成熟及細胞、胚胎培養(yǎng)耗材為NUNC公司產(chǎn)品。洗卵液為DPBS+PVA液，操作液為無鈣的 H-N