專利名稱：應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及法庭科學(xué)DNA檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化DNA的方法。
背景技術(shù)：
目前在法庭科學(xué)領(lǐng)域，對(duì)微量疑難生物檢材(微量血痕、唾液斑跡、毛發(fā)、骨骼、附有人體脫落細(xì)胞的觸摸物等)的DNA檢測(cè)既是行業(yè)重點(diǎn)，也是行業(yè)難點(diǎn)，有時(shí)DNA檢測(cè)結(jié)果直接影響案件偵破進(jìn)程。而微量疑難生物檢材DNA檢測(cè)成功與否在于是否能獲得足夠的可用模板DNA，為達(dá)到有效制備可用于擴(kuò)增的核酸的目的，許多學(xué)者一直在探索各種DNA的提取方法，已經(jīng)有許多提取基因組DNA的方法，如傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法、Chelex-IOO法、硅珠法、磁珠法等。但是，這些方法在提取微量疑難生物檢材都存在如下不足
1、傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法屬于經(jīng)典技術(shù)，但操作比較繁瑣，需要多步轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移過(guò)程中易造成污染和DNA損耗，尤其是當(dāng)僅有少量檢材分析或樣本中DNA含量較低時(shí)，傳統(tǒng)的DNA提取方法尤其不適用。另外，酚、氯仿等有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染，有害操作者的健康。2、Chelex-IOO法操作簡(jiǎn)單快速，但提取的DNA純度低，該法受生物檢材本身?xiàng)l件限制較多，不適合微量、疑難生物物證DNA檢測(cè)。3、硅珠法是近年來(lái)常見(jiàn)的方法，是以二氧化硅在高離子強(qiáng)度、低pH值條件下吸附 DNA，用洗滌液洗掉吸附在二氧化硅表面的其它雜質(zhì)，再用低離子強(qiáng)度、高pH值緩沖液洗脫吸附在二氧化硅表面上的DNA分子，獲得模板DNA。這種方法避免了使用酚-氯仿抽提，但需反復(fù)的洗滌和洗脫，步驟比較煩瑣。DNA在洗脫過(guò)程中的損失使獲得的DNA量減少，不適用DNA含量較少的檢材。4、磁珠法提取DNA也是近年出現(xiàn)的新方法，利用磁珠吸附DNA后，在磁場(chǎng)作用下分離。此方法可運(yùn)用磁珠直接吸附DNA，利用磁場(chǎng)分離可以得到較純的DNA，但DNA在洗脫過(guò)程中的損失使獲得的DNA量減少，不適用DNA含量較少的檢材。因此，上述方法用于提取微量疑難生物檢材的DNA時(shí)在純度、產(chǎn)率、對(duì)操作者的健康、易操作性上都存在不足。特別是上述方法獲得的用于擴(kuò)增的DNA都是溶解在液體中的 DNA溶液，使本來(lái)量少的DNA又進(jìn)行了稀釋。因此，建立一種新的DNA提取純化方法用于檢測(cè)微量生物檢材很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種DNA提純純度及產(chǎn)率高且便于操作、無(wú)環(huán)境污染的應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化DNA的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的其特征是a、首先將不同消化裂解液液體加熱后離心，收集上清液，棄沉淀；b、然后將該上清液加入免疫膠體金，室溫振蕩孵育10-45分鐘，當(dāng)上清液體積在Iml以下，則加入5-15 μ 1免疫膠體金，膠體金顆粒直徑15-30nm ；c、用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀；d、加入3%FCS (小牛血清)500-1000 μ 1，混勻懸浮沉淀，用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀；e、加入純水 500-1000 μ 1，混勻懸浮沉淀，用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀，此步驟至少1次，得到DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀。得到的DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀加入PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)液中直接擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用于檢測(cè)。上述所說(shuō)的不同消化裂解液包含Chelex法液體、DNA提取緩沖液、CTAB法上清液、 市售提取純化試劑盒中起到消化裂解細(xì)胞作用的緩沖液、DNA水溶液、DNA TE緩沖液。本發(fā)明的技術(shù)效果是
1、能夠提取高純度可用于PCR反應(yīng)的模板DNA。本發(fā)明根據(jù)免疫反應(yīng)所具有的專一性和特異性等特點(diǎn)設(shè)計(jì)了操作流程，免疫膠體金顆粒只針對(duì)消化裂解液中的微量DNA分子具有極高的捕獲能力，且捕獲的DNA片段在 IOObp以上。對(duì)蛋白質(zhì)、RNA、嚴(yán)重降解的小片段DNA、色素、細(xì)菌等影響PCR反應(yīng)的抑制劑均不吸附。因此提取的DNA純度極高。2、具有無(wú)可比擬的超級(jí)濃縮能力。用本發(fā)明純化的用于PCR反應(yīng)的模板DNA是以DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀的形式存在。該復(fù)合物沉淀可直接用于PCR反應(yīng)，不需要將DNA從膠體金顆粒上洗脫下來(lái)制成DNA溶液。最后一次洗滌離心后，將上清液全部棄去，在實(shí)際操作中僅剩余1-2微升水。因此，本發(fā)明可以使DNA提取液從Iml以上大體系濃縮成1-2微升，被濃縮的DNA產(chǎn)率極高，足以達(dá)到超微量分析的標(biāo)準(zhǔn)。3、DNA_免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀直接用于PCR反應(yīng)，創(chuàng)造性的發(fā)展了 PCR技術(shù)， 極大的提高了 DNA檢測(cè)靈敏度。用本發(fā)明得到的產(chǎn)物是DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀。該復(fù)合物沉淀加入PCR 反應(yīng)液直接擴(kuò)增。在進(jìn)行微量生物檢材檢測(cè)時(shí)，可將消化裂解液中的微量DNA最大限度的富集，全部用于PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明可提高DNA檢測(cè)靈敏度3-4個(gè)數(shù)量級(jí)，使PCR的敏感性大幅提高。4、本發(fā)明適合多種消化裂解液中DNA的提純，適用范圍廣。針對(duì)不同的生物物證采用不同的裂解方法，本方法專門針對(duì)不同裂解液建立純化方法，能有效純化DNA。因此本法適用各類生物檢材的消化裂解液的純化，適用范圍廣泛。5、本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、能夠快速提純DNA，易于推廣。傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法從消化裂解液中提純DNA需要重復(fù)萃取、沉淀、重復(fù)洗滌、溶解后制成溶液等4個(gè)部分。硅珠法和磁珠法從消化裂解液中提純DNA需要吸附、重復(fù)洗滌、 洗脫制成溶液等3個(gè)部分。而本發(fā)明僅需捕獲、重復(fù)洗滌后制成沉淀復(fù)合物等2個(gè)部分即可進(jìn)行PCR反應(yīng)。因此本法操作簡(jiǎn)便，易于掌握，便于推廣。并且整個(gè)提取過(guò)程不需使用有機(jī)溶劑，避免了環(huán)境污染。6、本發(fā)明使用的免疫膠體金分為兩類抗-DNA單克隆抗體免疫膠體金和抗-DNA 多克隆抗體免疫膠體金。研究證明，這兩類免疫膠體金在純化DNA方面無(wú)明顯差異?？?DNA 單克隆抗體免疫膠體金價(jià)格較貴，抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金制備簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，這為本發(fā)明在全國(guó)法庭科學(xué)領(lǐng)域大范圍推廣應(yīng)用提供了條件。綜上，本發(fā)明創(chuàng)造性的發(fā)展了利用免疫反應(yīng)直接捕獲人體DNA分子的技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了從不同消化裂解液中純化DNA的方法，為微量疑難生物檢材DNA檢測(cè)建立了全新而又簡(jiǎn)單實(shí)用的方法，填補(bǔ)了法庭科學(xué)領(lǐng)域的空白。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做以詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式實(shí)例1 從Chelex法液體環(huán)境下純化DNA 一、免疫膠體金的制備
本實(shí)施方式以25-30nm大小膠體金顆粒為載體，將抗-DNA單克隆抗體標(biāo)記到膠體金顆粒上，制備成免疫膠體金。二、提純 DNA
1、采用中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/T 383-2002)中“6. 2 Chelex法”處理血痕、煙頭、人體脫落細(xì)胞等生物物證。2、將上述方法提取液13000rpm離心3min，收集上清液于0. 5ml離心管中，棄沉淀。3、將上清液加入免疫膠體金10 μ 1，室溫振蕩孵育10分鐘。4、13000rpm離心;3min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀。5、加入3%FCS (小牛血清)500 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清， 保留沉淀。6、加入滅菌純水500μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，保留沉淀。三、檢測(cè)提純效果
將沉淀加入PCR反應(yīng)液中，直接進(jìn)行擴(kuò)增(采用AB公司ID試劑盒)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI 3IOOAvant Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用Genetyper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。實(shí)例2 從DNA提取緩沖液中純化DNA 一、免疫膠體金的制備
本實(shí)施方式以25-30nm大小膠體金顆粒為載體，將抗-DNA單克隆抗體標(biāo)記到膠體金顆粒上，制備成免疫膠體金。二、提純 DNA
1、采用中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/T 383-2002)中“6. 1有機(jī)溶劑法”中“6. 1. 1中f) DNA提取緩沖液”處理血痕、煙頭、人體脫落細(xì)胞等生物物證。2、將上述方法提取液加熱(100°C，8分鐘)后，13000rpm離心3min，收集上清液于 0. 5ml離心管中，棄沉淀。3、將上清液加入免疫膠體金10 μ 1，室溫振蕩孵育10分鐘。4、13000rpm離心;3min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀。5、加入3%FCS (小牛血清)500 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，
保留沉淀。6、加入滅菌純水500μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，保留沉
淀。此步驟3次。
三、檢測(cè)提純效果
將沉淀加入PCR反應(yīng)液中，直接進(jìn)行擴(kuò)增(采用AB公司ID試劑盒)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI 3IOOAvant Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用Genetyper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。實(shí)例3 從CTAB法上清液中純化DNA 一、免疫膠體金的制備
本實(shí)施方式以25-30nm大小膠體金顆粒為載體，將抗-DNA單克隆抗體標(biāo)記到膠體金顆粒上，制備成免疫膠體金。二、提純 DNA
1、采用中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/T 383-2002)中“6. 4 CTAB法”處理骨骼、牙齒等生物物證。保留此法中“6. 4. 2. 1中b)上清液”。2、將上述方法提取液加熱(100°C，15分鐘)后，IOOOOrpm離心5min，收集上清液于 1.5ml離心管中，棄沉淀。3、將上清液加入免疫膠體金15 μ 1，室溫振蕩孵育15分鐘。4、13000rpm離心5min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀。5、加入3%FCS (小牛血清)1000 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心5min，吸棄上清，
保留沉淀。6、加入滅菌純水ΙΟΟΟμ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心5min，吸棄上清，保留沉淀。此步驟3次。三、檢測(cè)提純效果
將沉淀加入PCR反應(yīng)液中，直接進(jìn)行擴(kuò)增(采用AB公司ID試劑盒)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI 3IOOAvant Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用Genetyper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。實(shí)例4 從市售提取純化試劑盒中起到消化裂解細(xì)胞作用的緩沖液中純化DNA 一、免疫膠體金的制備
本實(shí)施方式以25-30nm大小膠體金顆粒為載體，將抗-DNA單克隆抗體標(biāo)記到膠體金顆粒上，制備成免疫膠體金。二、提純 DNA
1、采用QIAGEN公司的EZl DNA Tissue試劑盒中的G2緩沖液消化裂解血痕、煙頭、人體脫落細(xì)胞等生物物證。2、將上述方法提取液加熱(100°C，8分鐘)后13000rpm離心3min，收集上清液于 0. 5ml離心管中，棄沉淀。3、將上清液加入免疫膠體金10 μ 1，室溫振蕩孵育10分鐘。4、13000rpm離心;3min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀。5、加入3%FCS (小牛血清)500 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，
保留沉淀。6、加入滅菌純水500μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，保留沉淀。
6
三、檢測(cè)提純效果
將沉淀加入PCR反應(yīng)液中，直接進(jìn)行擴(kuò)增(采用AB公司ID試劑盒)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI 3IOOAvant Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用Genetyper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。實(shí)例5 從DNA水溶液中純化DNA 一、免疫膠體金的制備
本實(shí)施方式以25-30nm大小膠體金顆粒為載體，將抗-DNA單克隆抗體標(biāo)記到膠體金顆粒上，制備成免疫膠體金。二、提純 DNA
1、將DNA水溶液13000rpm離心3min，收集上清液于0. 5ml離心管中，棄沉淀。3、將上清液加入免疫膠體金10 μ 1，室溫振蕩孵育10分鐘。4、13000rpm離心;3min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀。5、加入3%FCS (小牛血清)500 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清， 保留沉淀。6、加入滅菌純水500 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，保留沉淀。三、檢測(cè)提純效果
將沉淀加入PCR反應(yīng)液中，直接進(jìn)行擴(kuò)增(采用AB公司ID試劑盒)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI 3IOOAvant Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用Genetyper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。實(shí)例6 從DNA TE緩沖液中純化DNA 一、免疫膠體金的制備
本實(shí)施方式以25-30nm大小膠體金顆粒為載體，將抗-DNA單克隆抗體標(biāo)記到膠體金顆粒上，制備成免疫膠體金。二、提純 DNA
1、采用中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/T 383-2002)中“TE緩沖液”溶解DNA。2、將DNA TE溶液13000rpm離心3min，收集上清液于0. 5ml離心管中，棄沉淀。3、將上清液加入免疫膠體金10 μ 1，室溫振蕩孵育10分鐘。4、13000rpm離心;3min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀。5、加入3%FCS (小牛血清)500 μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，
保留沉淀。6、加入滅菌純水500μ 1，混勻懸浮沉淀，13000rpm離心3min，吸棄上清，保留沉淀。三、檢測(cè)提純效果
將沉淀加入PCR反應(yīng)液中，直接進(jìn)行擴(kuò)增(采用AB公司ID試劑盒)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI 3IOOAvant Genetic Analyzer進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用Genetyper軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。備注不同消化裂解液包含Chelex法[1]液體、DNA提取緩沖液[2]、CTAB法[3]上清液、市售提取純化試劑盒中起到消化裂解細(xì)胞作用的緩沖液⑷』·水溶液[5]、DNA TE [(；]緩沖液。[IlChelex法指中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/T 383-2002)中 “6. 2 Chelex 法”。[2]指中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/ T 383-2002)中“6. 1有機(jī)溶劑法”中“6. 1. 1中f) DNA提取緩沖液”。[3]指中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/ T 383-2002)中 “6. 4 CTAB 法”中 “6. 4. 2. 1 中 b)上清液”。[4]指市售提取純化試劑盒中起到消化裂解細(xì)胞作用的緩沖液，諸如!Iomega公司的DNA IQ系統(tǒng)中的裂解緩沖液、QIAGEN公司的EZl DNA Tissue試劑盒中的G2緩沖液、寸寸。[5]指中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/ T 383-2002)中“雙蒸餾水”。[6]指中華人民共和國(guó)公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)-《法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范》(GA/ T 383-2002)中"TE 緩沖液”。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化DNA的方法，其特征是a、首先將不同消化裂解液液體加熱后離心，收集上清液，棄沉淀；b、然后將該上清液加入免疫膠體金，室溫振蕩孵育10-45分鐘，當(dāng)上清液體積在Iml以下，則加入5-15 μ 1免疫膠體金，膠體金顆粒直徑15-30nm ;c、用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀；d、加入 3%FCS (小牛血清)500-1000 μ 1，混勻懸浮沉淀，用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀；e、加入純水500-1000 μ 1，混勻懸浮沉淀，用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀，此步驟至少1次，得到DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化DNA的方法，其特征是上述所說(shuō)的不同消化裂解液包含Chelex法液體、DNA提取緩沖液、CTAB法上清液、 市售提取純化試劑盒中起到消化裂解細(xì)胞作用的緩沖液、DNA水溶液、DNA TE緩沖液。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化DNA的方法，其特征是得到的DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀加入PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)液中直接擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用于檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)從不同消化裂解液中純化DNA的方法。該方法是將消化裂解液離心，收集上清液，在上清液(體積1ml以內(nèi))中加入5-15μl免疫膠體金(膠體金顆粒直徑15-30nm)室溫振蕩孵育10-45分鐘，孵育形成DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物后離心洗脫保留沉淀。沉淀為吸附了DNA的免疫膠體金，加入3%FCS(小牛血清)500-1000μl，混勻懸浮沉淀，用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀；加入純水500-1000μl，混勻懸浮沉淀，用離心方法使免疫膠體金顆粒沉淀，吸棄上清，保留沉淀，得到DNA-免疫膠體金顆粒復(fù)合物沉淀?？芍苯佑糜赑CR反應(yīng)。本發(fā)明可以使DNA提取液從1ml以上大體系濃縮成1-2微升，被濃縮的DNA純度和產(chǎn)率極高，足以達(dá)到超微量分析的標(biāo)準(zhǔn)，便于操作、無(wú)環(huán)境污染，適用范圍廣。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102296061SQ20111014930
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月4日
發(fā)明者張曉東, 潘永峰, 牛青山, 辛陽(yáng), 鄭吉龍 申請(qǐng)人:中國(guó)刑事警察學(xué)院