一種固定化糖苷酶試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑，具體是一種固定化糖苷酶試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為最廣泛、最復(fù)雜、最重要的翻譯后修飾之一，蛋白質(zhì)糖基化修飾已經(jīng)被證明存在于一半以上的哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白中，其不僅影響著蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位，而且在分子識(shí)別、細(xì)胞通信、信號(hào)傳達(dá)等特定生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。根據(jù)糖基化位點(diǎn)的不同，糖蛋白可分為三大類:N-糖蛋白、O-糖蛋白和GPI錨定蛋白，其中又以N-糖蛋白分布最為廣泛，其含量的缺乏或結(jié)構(gòu)的異常變化與骨關(guān)節(jié)炎、囊性纖維變性、癌癥的多種疾病密切相關(guān)。因此，發(fā)展靈敏、準(zhǔn)確的針對(duì)糖基化修飾的高通量鑒定方法是研究糖蛋白在生理過程中作用的關(guān)鍵一步，同時(shí)，這也能為開發(fā)針對(duì)早期診斷和治療靶點(diǎn)的生物標(biāo)記物提供重要的理論支持。近年來(lái)，生物質(zhì)譜技術(shù)由于其高靈敏度和高準(zhǔn)確性，被廣泛應(yīng)用于糖基化修飾的研究中，特別是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜MALD1-T0F-MS，因?yàn)槠鋱D譜解析的便捷性已經(jīng)成為研究糖基化修飾的主要分析方法。
[0003]在利用生物質(zhì)譜對(duì)糖基化修飾的分析策略中，糖基化位點(diǎn)以及糖鏈結(jié)構(gòu)等信息主要通過糖蛋白酶解的糖肽產(chǎn)物分析所獲得，因此快速、高效、完全的糖蛋白酶解就成了糖基化修飾準(zhǔn)確、高通量分析研究中極其重要的環(huán)節(jié)。具體到N-糖蛋白，其N-糖鏈的酶解釋放最通用的方法是通過肽N-糖苷酶F的酶解作用，并且其酶解產(chǎn)物非常適合于質(zhì)譜檢測(cè)和鑒定。然而，傳統(tǒng)溶液酶解方法有諸如成本高、效率低、孵育時(shí)間長(zhǎng)以及酶解不完整等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足準(zhǔn)確、高通量的分析要求。
[0004]基于以上原因，固定化酶技術(shù)以其快速、高效、低成本、可回收等特點(diǎn)在糖蛋白鑒定領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前已經(jīng)開發(fā)的眾多固定化酶載體材料，諸如磁性納米顆粒，氧化石墨烯，聚合物膜，介孔材料等極大縮短了酶解所需要的反應(yīng)時(shí)間，但是基于這些固定化酶技術(shù)的酶解反應(yīng)都在復(fù)相條件下進(jìn)行，限制了酶解效率的提升。然而，具備環(huán)境響應(yīng)能力的磁流體載體材料不僅可以使被固定的酶與蛋白質(zhì)底物在均相的條件下進(jìn)行反應(yīng)同時(shí)可以利用其環(huán)境響應(yīng)能力方便地將固定化酶試劑進(jìn)行分離回收，這使其成為一種理想的固定化酶載體材料。
[0005]聚N-異丙基丙烯酰胺是一種被廣泛應(yīng)用的具有溫度響應(yīng)能力、良好生物相容性的高分子材料，同時(shí)它可以與其他多種具有反應(yīng)活性的功能單體進(jìn)行共聚合，并且可以通過原位引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法接枝到磁性納米顆粒表面，對(duì)磁性納米材料進(jìn)行表面修飾與功能化，為被固定的酶分子提供三維支撐以及環(huán)境響應(yīng)功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種酶解效率高、可靠性好的固定化糖苷酶試劑及其制備方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案: 一種固定化糖苷酶試劑，包括溫敏性磁流體載體材料和糖苷酶，所述糖苷酶固定在溫敏性磁流體載體材料上，所述溫敏性磁流體材料的原料包括溫敏性單體、具有能與糖苷酶結(jié)合活性官能團(tuán)的單體和帶有表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的磁性納米顆粒，所述溫敏性單體和具有能與糖苷酶結(jié)合活性官能團(tuán)的單體共聚合成聚合物鏈，共聚合而成的聚合物鏈與所述磁性納米顆粒通過配位鍵連接；聚合物鏈與所述糖苷酶通過碳氮鍵連接。
[0008]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述帶有表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的磁性納米顆粒是將表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑固定連接在所述磁性納米顆粒的表面而成；所述表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的一端是與鐵原子發(fā)生配位作用的偶聯(lián)劑，另一端是原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑。
[0009]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述溫敏性單體為丙烯酰胺類單體，具體為N-異丙基丙烯酰胺；所述具有能與糖苷酶結(jié)合活性官能團(tuán)的單體為具有烯醛類單體，具體為十一烯醛；所述糖苷酶為肽N-糖苷酶F。
[0010]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述偶聯(lián)劑為硅烷偶聯(lián)劑。
[0011]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述硅烷偶聯(lián)劑具體為3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷或γ-巰丙基三乙氧基硅烷。
[0012]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑為2-溴異丁酰溴、α -溴代異戊酰溴或α-溴丙酰溴；所述硅烷偶聯(lián)劑與所述原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑由酰胺鍵連接。
[0013]作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案:所述固定化糖苷酶試劑生產(chǎn)酶解液體的方法如下:在待酶解的糖蛋白中加入DTT，37°C水浴中還原，再加入IAA于暗處放置進(jìn)行烷基化從而進(jìn)行變性，得到變性的待酶解糖蛋白；將所述固定化酶與變性的待酶解糖蛋白在H=8.025-100mM碳酸氫銨溶液或pH=7.825-100mM的磷酸鹽緩沖液中混合均勻，超聲振蕩，加熱磁性分離，得酶解液。
[0014]所述固定化糖苷酶試劑的制備方法，具體步驟如下:
(1)表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的制備方法:將硅烷偶聯(lián)劑和質(zhì)子酸捕捉劑于冰浴中進(jìn)行反應(yīng)，再加入原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑，進(jìn)行反應(yīng)，即得，其中硅烷偶聯(lián)劑、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑和質(zhì)子酸捕捉劑的投料摩爾比為0.5-1:1:1 ;
(2)帶有表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的磁性納米顆粒的制備方法:將所述磁性納米顆粒進(jìn)行油酸包裹修飾，將其與表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑于溶劑中混勻發(fā)生配體交換反應(yīng)生成配位鍵，即得，所述溶劑為苯或甲苯正己烷，所述配體交換反應(yīng)的溫度為20-30°C，配體交換反應(yīng)的時(shí)間為l_72h ;述磁性納米顆粒與所述表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的質(zhì)量比為1:0.45-5.45 ;
(3)溫敏性磁流體載體材料的制備方法:將溫敏性單體、活性功能單體、催化劑、配體和溶劑混合，得到混合液A，將混合液A與所述帶有表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合的引發(fā)劑的磁性納米顆?；旌?，得混合液B，除去混合液B中的氧氣，引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基共聚合反應(yīng)，即得；所述催化劑為如下任意一種金屬的齒化物:Cu、Mo、Ru、Rh、Fe、Re、N1、Pd和Pb ;戶斤述配體為N，N，N’，N’ ’，N’ ’ -五甲基二乙烯基三胺、2，2’ -聯(lián)吡啶、四甲基乙二胺、1，1，4，7，10，10-六甲基三亞乙基四胺或三(2-二甲氨基乙基)胺；所述溶劑為甲醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、二甲基亞砜或四氫呋喃；所述溫敏性單體、活性功能單體、催化劑、配體的摩爾比為200:100-1:0.5-5:0.75-7.5 ；
(4)將所得溫敏性磁流體載體材料與糖苷酶混合，首先將糖苷酶溶于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入氰基硼氫化鈉得混合液，將混合液加入到所述溫敏性載體材料中，反應(yīng)，加熱引起溫敏性載體材料的溫度響應(yīng)，磁性分離，進(jìn)行糖苷酶的固定，引起溫敏性載體材料溫度響應(yīng)的溫度為18-40°C，所述糖苷酶與所述溫敏性載體材料的質(zhì)量比為1:10-10:1 ;
(5 )將固定了糖苷酶的溫敏性磁流體載體材料上剩余的功能基團(tuán)封閉，得到目的固定化糖苷酶，所述封閉的方法為用氨基乙醇的磷酸鹽緩沖液與步驟(I)得到的固定了糖苷酶的功能化載體混合，反應(yīng)即得；所述氨基乙醇在氨基乙醇的磷酸鹽緩沖液中的體積百分含量為5%-20%，所述功能基團(tuán)為能與所述糖苷酶結(jié)合的基團(tuán)，具體為醛基，所述功能基團(tuán)位于所述溫敏性載體材料的聚合物鏈上。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
(1)通過S1-ATRP法將溫敏性單體和活性功能性單體接枝在磁性納米顆粒表面，對(duì)其進(jìn)行表面修飾，制備成具有溫度響應(yīng)性和大量醛基官能團(tuán)的固定化酶載體材料。在適宜溫度下，聚合物鏈可以在反應(yīng)媒介中自由伸展，成為所固定糖苷酶的三位支架，同時(shí)保證糖苷酶的穩(wěn)定性和與糖蛋白底物接觸的自由性。因此，對(duì)比采用傳統(tǒng)單層的固定化酶制備方法，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案明顯增加了單位質(zhì)量固定化酶試劑的糖苷酶的固載量和固定化酶試劑的穩(wěn)定性；
(2)在載體材料的響應(yīng)溫度以下，溫敏性聚合物的親水性可以使固定化酶試劑完全分散在反應(yīng)溶劑內(nèi)并形成磁流體，實(shí)現(xiàn)與糖蛋白底物在均相反應(yīng)條件下進(jìn)行酶解，與傳統(tǒng)的復(fù)相固定化酶解方法相比，均相反應(yīng)極大提高了固定化糖苷酶與糖蛋白底物的碰撞幾率，從而顯著提高了酶解效率；
(3)對(duì)比傳統(tǒng)溶液酶解所需要12-20h的孵育時(shí)間，溫敏性磁流體固定化酶完成糖蛋白酶解所需時(shí)間極短，明顯提高了樣品處理效率；
(4)該酶解方法簡(jiǎn)化了糖蛋白酶解所需的操作步驟，酶解完成后只需加熱至溫敏性載體材料的響應(yīng)溫度然后磁性分離即可達(dá)到將酶解產(chǎn)物與固定化酶分離的目的；
(5 )對(duì)比傳統(tǒng)溶液酶解不可分離的缺點(diǎn)，該方法有效避免了酶