專利名稱：一種高純度石杉堿甲的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用高速逆流色譜法(HSCCC)從石杉屬植物千層塔中制備天然生物堿的方法，特別是一種高純度石杉堿甲的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著社會人口的老齡化，老年性癡呆癥發(fā)病率相對上升，目前65歲以上的癡呆癥患病率為5％～10％，而且仍在增長之中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)今世界有5000多萬老年人患有不同程度的老年性癡呆癥。我國60歲以上人口預(yù)計(jì)到2010年將占總?cè)丝诘?5.7％，癡呆癥問題同樣是我們所面臨的不可回避的問題。因此尋找治療老年性癡呆病的有效藥物已受到各國的高度重視，成為當(dāng)務(wù)之急。老年癡呆病中50％～60％為阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)，它是一種以記憶力喪失和認(rèn)知功能障礙為主要特點(diǎn)的原發(fā)性灰質(zhì)腦病。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性癡呆，其病因尚不明確，假說有多種，如神經(jīng)遞質(zhì)缺陷、炎癥、自由基損傷、淀粉樣蛋白、神經(jīng)毒作用、激素缺乏、細(xì)胞凋亡等。治療AD的目的是改善認(rèn)知功能障礙，提高病人的生活能力。70年代，研究主要集中在乙酰膽堿與AD的關(guān)系；80年代，主要是研究膽堿酯酶抑制劑對AD的影響；90年代，研究不僅有乙酰膽堿受體激動(dòng)劑，還包括了雌激素、消炎藥、影響自由基代謝的藥物及抑制淀粉樣蛋白沉積的藥物。但由于種種原因，到目前為止，AD的臨床治療仍然是一個(gè)有待攻破的世界性難題。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在應(yīng)用天然藥物有效成分治療老年癡呆病方面做了大量的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究，由于腦中膽堿能系統(tǒng)與人的學(xué)習(xí)、記憶功能是密切相關(guān)的。早期的研究發(fā)現(xiàn)AD病人的腦膽堿能系統(tǒng)受到了損害，導(dǎo)致突觸部位乙酰膽堿含量的下降，從而對病人的學(xué)習(xí)、記憶能力產(chǎn)生影響。因此，針對提高AD病人腦中的乙酰膽堿含量，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)功能的藥物應(yīng)運(yùn)而生?，F(xiàn)在這類藥物的研究集中于膽堿酯酶抑制劑和毒蕈堿M1受體激動(dòng)劑。石杉堿甲(huperzine A)為我國首創(chuàng)的可逆性強(qiáng)效乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑，是近年來從石杉屬植物千層塔Huperzia serrata(Thunb.)Tre v.中分離到的一種新的生物堿。目前進(jìn)行的臨床研究表明它在膽堿能神經(jīng)突觸處對AChE的抑制作用強(qiáng)于他克林(tacrine)。動(dòng)物行為學(xué)研究顯示石杉堿甲可提高動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力，治療指數(shù)高于他克林、毒扁豆堿和加蘭他敏。在臨床為期8周的雙盲試驗(yàn)中，口服0.2mg/d，每日2次，有58％的病人顯著改善了所有被測記憶、認(rèn)知和行為能力參數(shù)P＜0.05，且未出現(xiàn)嚴(yán)重的反應(yīng)，因此石杉堿甲是一種很有發(fā)展前途的治療AD的藥物。對老年性癡呆癥，單純記憶障礙以及重癥肌無力癥治療有顯著療效，且藥效持續(xù)時(shí)間長，無嚴(yán)重不良反應(yīng)，是國內(nèi)外上述病癥最有效的藥物，深受關(guān)注，國內(nèi)已批準(zhǔn)上市。在國際上已被列為第二代膽堿酯酶的抑制劑之一。
石杉堿甲的結(jié)構(gòu)式如下 化學(xué)名稱為(5R，9R，11E)-5-氨基-11-乙叉基-5，6，9，10-四氫-7-甲基-5，9-甲撐環(huán)辛并(b)吡啶-2(1H)酮石杉堿甲(Hup A)在自然界中存在量極低，且含有大量雜質(zhì)，至今國內(nèi)外有大量研究人員正在探索尋找理想的分離辦法。曾有人利用溶劑萃取、硅膠柱層析等方法進(jìn)行分離，雖然能獲得少量產(chǎn)品，但終因費(fèi)時(shí)，得率低而難于規(guī)?；a(chǎn)。而人工合成品難于獲得理想的療效。逆流色譜分離制備方法可以達(dá)到純度高，得率高而優(yōu)于傳統(tǒng)的柱色譜等分離方法。高速逆流色譜技術(shù)(High-SpeedCountercurrent Chromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，其原理是利用螺旋柱在行星運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時(shí)保留其中的一相(固體相)，利用恒流泵連續(xù)輸入另一相(流動(dòng)相)，隨流動(dòng)相進(jìn)入螺旋柱的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的次序，被依次洗脫。在流動(dòng)相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固體相中分配比例大的后被洗脫。它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的各種問題——樣品容易被吸附、損耗和變性，使其它液相色譜技術(shù)進(jìn)行制備量分離時(shí)，其分配效率會明顯降低，溶劑消耗量大，HSCCC保證較高峰型分辨度，分離量大、樣品無損耗、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑。高速逆流色譜儀能直接進(jìn)大量粗提物樣品或合成混合物，分離結(jié)果能夠達(dá)到相當(dāng)高的純度，甚至能直接接質(zhì)譜儀等儀器，已廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域化學(xué)物質(zhì)的制備分離和純化。因此，HSCCC具有操作簡便，理論回收率為100％，重現(xiàn)性好和分離效率高、分離量較大的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服傳統(tǒng)分離技術(shù)的缺陷，采用高速逆流色譜法(HSCCC)，提供一種高純度石杉堿甲的制備方法。該方法具有回收率高，分離量大和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟采用高速逆流色譜制備方法，它包括制備構(gòu)成固體相，流動(dòng)相的溶劑體系先用固定相存滿逆流色譜儀柱子，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速，將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)監(jiān)測器紫外圖譜接收目標(biāo)成分。首先選擇一個(gè)溶劑體系的兩相組合，溶劑體系由三個(gè)組分構(gòu)成，A組分可選自正庚烷、正己烷、正戊烷等正構(gòu)烷烴，B組分可選自甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮，C組分為水，優(yōu)先選擇正己烷—正丁醇—水體系。
根據(jù)溶解度常數(shù)，在不破壞體系平衡的情況下，調(diào)節(jié)A，B，C，三組分的體積比依次為1-5∶0.1-2∶1-5。例如2∶1∶2；5∶1∶4；20∶8∶20等；上述體系上相為固定相，下相為流動(dòng)相。且經(jīng)一次分離得到石杉堿純品，純度在99％以上。
實(shí)驗(yàn)條件適合溫度20-30℃，在上述溫度范圍內(nèi)，溫度較高時(shí)，出峰時(shí)間略有提前，分離效率變化不大，對峰形無多大影響。
主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速需控制在一定范圍內(nèi)，按體積比將溶劑體系置于分液漏斗中，搖勻靜置分層。待平衡一定時(shí)間后，將上相和下相分開，采用TBE-300A高速逆流色譜儀，該機(jī)型柱體積為300ml，進(jìn)樣圈為20ml，配有AKTA Prime泵，監(jiān)測器和記錄儀。進(jìn)樣前，先用固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為600-1000rpm，以0.5-4mL/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)。
由于石杉堿甲的不穩(wěn)定性，分離和收集到的目標(biāo)成分，馬上餾分濃縮蒸干進(jìn)行結(jié)晶得到單體。
本發(fā)明方法采用了高速逆流色譜分離技術(shù)，是一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它克服了固態(tài)支持體或載體不可逆吸附、損耗和變性，使被分離物回收率高，理論達(dá)100％，本發(fā)明實(shí)際達(dá)到95％以上。又因?yàn)椴捎脙?yōu)選的溶劑體系，控制實(shí)驗(yàn)條件溫度、調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速和流速的工藝條件，可以高效率的分離，獲得高純度石杉堿甲單體(達(dá)到99％以上)。本發(fā)明方法適合從各種工藝途徑制備的不同含量石杉堿甲粗品中分離制備高純度的石杉堿甲單體。使用于用各種型號的逆流色譜儀分離制備石杉堿甲單體，能直接進(jìn)大量粗提樣品或合成混合物，分離結(jié)果能達(dá)到相當(dāng)高的純度，保證較高峰型分辨度，分離量大、回收率高、分離環(huán)境緩和，節(jié)約溶劑，操作簡便。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1選取正己烷—正丁醇—水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。先按5∶1∶5體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為200ml，AKTAPrime泵、檢測器和記錄儀。稱取200mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進(jìn)樣前，先用固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為950rpm，以3.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到99％左右。
實(shí)施例2選取正己烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度25℃，先按2∶1∶4體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為200ml，AKTAPrime泵、檢測器和記錄儀。稱取150mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進(jìn)樣前，先用固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為750rpm，以4.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到99％左右。
實(shí)施例3選取正己烷-乙醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度30℃，先按2∶1∶4體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取150mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進(jìn)樣前，先用固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為750rpm，以4.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到99％左右。
實(shí)施例4選取正庚烷-丙酮-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度22℃，先按4∶1∶3體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為200ml，AKTA Prime泵、檢測器和記錄儀。稱取150mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進(jìn)樣前，先用固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為650rpm，以3.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到99％左右.
實(shí)施例5選取正戊烷-甲醇-水體系在半制備型逆流色譜儀上來分離純化石杉堿甲。實(shí)驗(yàn)條件適合溫度20℃，先按2∶1∶1體積比將上述溶劑組分配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開。采用半制備型逆流色譜儀，配有聚四氟乙烯柱，20ml進(jìn)樣閥，柱容積為200ml，AKTAPrime泵、檢測器和記錄儀。稱取180mg石杉堿甲粗樣溶解于20ml固定相中待用。進(jìn)樣前，先用固定相存滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為1000rpm，以3.0ml/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測器紫外圖譜，接收目標(biāo)成分。得到石杉堿甲餾份，濃縮蒸干后進(jìn)行結(jié)晶，其HPLC純度達(dá)到99％左右。
權(quán)利要求
1.一種高純度石杉堿甲的制備方法，它包括制備構(gòu)成固體相，流動(dòng)相的溶劑體系先用固定相存滿逆流色譜儀柱子，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速，將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)紫外圖譜監(jiān)測器接收目標(biāo)成分，其特征在于所述的溶劑體系由正構(gòu)烷烴，和脂肪醇或脂肪酮，和水組成，三組分的體積比依次為1-5∶0.1-2∶1-5，上相為固體相，下相為流動(dòng)相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的正構(gòu)烷烴是正庚烷、正己烷、或正戊烷，所述的脂肪醇是甲醇、乙醇、或正丁醇，所述的脂肪酮是丙酮。
3.一種高純度石杉堿甲的制備方法，它包括制備構(gòu)成固體相，流動(dòng)相的溶劑體系先用固定相存滿逆流色譜儀柱子，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速，將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系建立動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)監(jiān)測器接收目標(biāo)成分，其特征在于實(shí)驗(yàn)條件溫度為20-30℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的主機(jī)轉(zhuǎn)速正轉(zhuǎn)為600-1000rpm，所述的流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為0.5-4mL/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的正構(gòu)烷烴為正己烷，所述的脂肪醇為正丁醇，在正己烷-正丁醇-水體系中，三組分的體積比依次為所述的體積比5∶1∶5，主機(jī)轉(zhuǎn)速正轉(zhuǎn)950rpm，流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為3ml/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的溶劑體系是正庚烷-丙酮-水，用量體積比依次為4∶1∶3，所述的主機(jī)轉(zhuǎn)速正轉(zhuǎn)650rpm，所述的流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為3ml/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的正構(gòu)烷烴為正戊烷，所述的脂肪醇為甲醇，在正戊烷-甲醇-水體系中，用量體積比依次為2∶1∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的正構(gòu)烷烴為正己烷-乙醇-水，所述的脂肪醇為乙醇，在正己烷-乙醇-水體系中，用量體積比依次為2∶1∶4，所述的主機(jī)轉(zhuǎn)速正轉(zhuǎn)750rpm，所述的流動(dòng)相泵入柱內(nèi)的流速為4ml/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的一種高純度石杉堿甲的制備方法，其特征在于所述的正構(gòu)烷烴為正己烷，所述的脂肪醇為甲醇，在正己烷-甲醇-水體系中，用量體積比依次為2∶1∶4，所述的實(shí)驗(yàn)條件溫度為25℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用高速逆流色譜法(HSCCC)從石杉屬植物千層塔中分離高純度石杉堿甲的制備方法。它包括制備上相固體相，下相流動(dòng)相的溶劑體系正構(gòu)烷烴如正庚烷、正己烷、或正戊烷；脂肪醇是甲醇、乙醇、或正丁醇、或丙酮和水組成，三組分的體積比依次為1－5∶0.1－2∶1－5。條件溫度20℃－30℃，用固定相存滿柱子，主機(jī)轉(zhuǎn)速600－1000rpm，以0.5－4mL/min的流速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待體系動(dòng)態(tài)平衡后，進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)監(jiān)測器接收目標(biāo)成分。餾分濃縮蒸干后結(jié)晶，得到石杉堿甲單體。本方法適用各種型號高速逆流色譜儀和各種含量石杉堿甲制備，具有分離量大，回收率高，操作簡便的特點(diǎn)。
文檔編號C07D221/00GK1587260SQ200410052688
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月9日
發(fā)明者王少珍, 鄧秋云 申請人:上海同田生化技術(shù)有限公司