一種添加前體物天冬氨酸提高石杉堿甲含量的蛇足石杉離體葉狀體的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用前體物天冬氨酸提高石杉堿甲含量的蛇足石杉離體葉狀體 的培養(yǎng)方法，即離體培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體添加天冬氨酸提高有用成分石杉堿甲累積量的培 養(yǎng)方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛇足石杉Huperz ia serrate，又名千層塔，石杉科Huperz iaceae，石杉屬 Huperzia，是一種矮小的多年生蕨類植物，有清熱解毒，生肌止血，散瘀消腫功效。自1972年 國內(nèi)首次報(bào)道該植物中的生物堿一石杉堿甲（hupenine A，Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以 后深入研究發(fā)現(xiàn)該生物堿是一種強(qiáng)效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量 Hup-A下對改善記憶力，治療中老年癡呆及重癥肌肉無力具有良好的療效且副作用小。自然 狀態(tài)下，蛇足石杉生長緩慢，孢子需要15年才能萌發(fā)，加之長期掠奪式地采挖，野生蛇足石 杉銳減;此外，人工大量栽培蛇足石杉難度較大，人工合成難以得到高光學(xué)活性的石杉堿 甲，導(dǎo)致石杉堿甲價(jià)格昂貴，每公斤在世界市場上高達(dá)五十萬美元。
[0003] 自2012年本發(fā)明人離體培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體成功以來，深入廣泛研究，發(fā)明了"一 種產(chǎn)石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法"和"一種產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型 蛇足石杉離體葉狀體克隆系"；本發(fā)明人系論文作者近年還報(bào)道了"蛇足石杉離體葉狀體是 產(chǎn)生石杉堿甲的最好形態(tài)"，和"葉狀體具有累積與原植物相同的有效成分石杉堿甲的能 力"。在上述專利和研究的基礎(chǔ)上又發(fā)明了 "一種添加前體物天冬氨酸提高石杉堿甲含量的 蛇足石杉離體葉狀體的培養(yǎng)方法"，利用本發(fā)明應(yīng)用于大規(guī)模離體培養(yǎng)，可獲得植物源的蛇 足石杉葉狀體轉(zhuǎn)化的有用成分石杉堿甲，將產(chǎn)生及其重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種添加前體物天冬氨酸提高石杉堿甲含量的蛇足石杉 離體葉狀體的培養(yǎng)方法。它解決了蛇足石杉野生資源匱乏、蛇足石杉野生植株及其離體培 養(yǎng)物葉狀體合成石杉堿甲含量較低的嚴(yán)重問題，這個(gè)問題阻礙了石杉堿甲藥物劑型研發(fā)和 社會(huì)運(yùn)用。因此，本發(fā)明突破了利用生物技術(shù)開發(fā)植物源石杉堿甲再生新途徑的一項(xiàng)重大 技術(shù)難關(guān)。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述方法步驟如下：
[0006] (1)所用材料:材料為本發(fā)明人離體建立的蛇足石杉葉狀體培養(yǎng)物，該材料制備方 法已申請專利(專利號ZL201210005499.6,專利名稱"一種產(chǎn)石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀 體誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)方法"）和"蛇足石杉離體培養(yǎng)產(chǎn)生石杉堿甲研究"論文報(bào)道，上述專利 的發(fā)明人和論文作者均為本專利的發(fā)明人；
[0007] (2)葉狀體培養(yǎng)物分割:在無菌條件下，將離體繁殖的葉狀體組織塊分割成0. Οδ-Ο. 1 克鮮重 的小塊備用；
[0008] (3)將分割好的葉狀體小塊接種到培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶中， 每瓶接種4小塊，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0009] (4)接種的葉狀體培養(yǎng)30-40天時(shí)，在無菌條件下，用一次性注射器取已滅菌的前 體物天冬氨酸〇.25m mol/L - lm mol/L的溶液5毫升添加到葉狀體培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)40- 50天，收獲葉狀體培養(yǎng)物；
[0010] (5)收獲的葉狀體于50°C溫度的烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末，用于制備石杉堿 甲提取物，以高效液相色譜法檢測提取物的石杉堿甲含量(ug/g);
[0011] 所述培養(yǎng)基按下列成分組成配制和處理：
[0012]分割的蛇足石杉葉狀體接種的基本培養(yǎng)基：1/4MS+鹿糖25%+瓊脂粉0.6%;培養(yǎng) 基pH5.8-6.0，將培養(yǎng)基在0.1 MPa高溫高壓下滅菌25min處理后使用。分割的蛇足石杉葉狀 體先接種在基本培養(yǎng)基中生長30-40天，隨后再向培養(yǎng)瓶中添加無菌的前體物一天冬氨酸 0.25mmol/L-lm mol/L溶液，每50ml基本培養(yǎng)基的葉狀體培養(yǎng)瓶中添加5ml前體物一天冬 氨酸溶液，組成葉狀體生產(chǎn)石杉堿甲的培養(yǎng)基；
[0013] 所述培養(yǎng)條件如下：
[0014] 培養(yǎng)參數(shù):培養(yǎng)箱恒溫23±2°C，相對濕度50%-70%，光照強(qiáng)度為17001X，日照時(shí) 長15h/d〇
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)效果是:蛇足石杉離體培養(yǎng)葉狀體再生僅發(fā)明人有成功報(bào)道和授權(quán) 專利（ZL2012100005499.6)鑒于蛇足石杉離體培養(yǎng)是開發(fā)生產(chǎn)原植物源藥用石杉堿甲 (Hup-A)資源的重要技術(shù)，本發(fā)明添加前體物最適濃度天冬氨酸培養(yǎng)的蛇足石杉離體葉狀 體可使石杉堿甲含量達(dá)97.5ug/g以上，比加水對照的石杉堿甲含量76.3ug/g提高了 27.8% 以上。利用本發(fā)明的方法進(jìn)行蛇足石杉離體培養(yǎng)，可獲得大量蛇足石杉葉狀體藥用植物資 源，將該項(xiàng)技術(shù)擴(kuò)大規(guī)模離體培養(yǎng)葉狀體提取生產(chǎn)的藥物石杉堿甲（Hup-A)將產(chǎn)生極為重 大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說明】
[0016] 圖1示加水對照培養(yǎng)與添加天冬氨酸培養(yǎng)葉狀體生長情況；
[0017] 圖2中箭頭所示標(biāo)準(zhǔn)品40ug/ml石杉堿甲峰；
[0018] 圖3中箭頭所示添加天冬氨酸培養(yǎng)的葉狀體的提取物中石杉堿甲峰；
[0019] 圖4中箭頭所示加水對照培養(yǎng)的葉狀體的提取物中石杉堿甲峰；
[0020] 圖5中箭頭所示蛇足石杉原植株的枝提取物中石杉堿甲峰。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0022] 實(shí)施例1:
[0023] 〈一〉取本發(fā)明人離體建立的蛇足石杉葉狀體培養(yǎng)物；
[0024] 〈二〉在無菌條件下，將葉狀體培養(yǎng)物分割成約0.08克鮮重的小塊備用；
[0025] 〈三〉將分割好的葉狀體小塊接種到培養(yǎng)蛇足石杉葉狀體的基本培養(yǎng)基瓶中，每瓶 接種4小塊，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0026]〈四〉接種的葉狀體培養(yǎng)30天時(shí)，在無菌條件下，用一次性注射器添加已滅菌的前 體物天冬氨酸0.25m mol/L的溶液5毫升添加到培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)50天，收獲葉狀體培養(yǎng) 物；
[0027] 〈五〉收獲的葉狀體于50°C溫度烘箱中烘干至恒重，研磨成粉末，用于制備石杉堿 甲提取物，以高效液相色譜法檢測石杉堿甲含量(ug/g);
[0028] 〈六〉培養(yǎng)條件：
[0029] 1.培養(yǎng)基配方：
[0030]分割的蛇足石杉葉狀體接種的基本培養(yǎng)基：1/4MS+蔗糖25%+瓊脂粉0.6%;培養(yǎng) 基pH5.8-6.0，將培養(yǎng)基在0.1 MPa高溫高壓下滅菌25min處理后使用。分割的蛇足石杉葉狀 體先接種在基本培養(yǎng)基中生長30-40天，隨后再向培養(yǎng)瓶中添加無菌的前體物一天冬氨酸 溶液，每50ml基本培養(yǎng)基的葉狀體培養(yǎng)瓶中添加5ml前體物一天冬氨酸溶液，組成葉狀體生 產(chǎn)石杉堿甲的培養(yǎng)基；
[0031 ] 2.培養(yǎng)環(huán)境
[0032] 提供培養(yǎng)的環(huán)境:培養(yǎng)箱恒溫23 ± 2°C，相對濕度50%_70 %，光照強(qiáng)度為17001x， 日照時(shí)長15h/d;
[0033] 實(shí)施例2:
[0034] 取本發(fā)明人離體建立的蛇足石杉葉狀體培養(yǎng)物，在無菌條件下，將葉狀體培養(yǎng)物 分割成約0.08克鮮重的小塊，接種葉狀體小塊在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天，隨后在無菌條件 下，用一次性注射器添加已滅菌的前體物天冬氨酸0.25m mol/L的溶液5毫升添加到培養(yǎng)瓶 中，繼續(xù)培養(yǎng)45天收獲葉狀體培養(yǎng)物。其他與實(shí)施例1相同。
[0035] 實(shí)施例3:
[0036]取本發(fā)明人離體建立的蛇足石杉葉狀體培養(yǎng)物，在無菌條件下，將葉狀體培養(yǎng)物 分割成約0.08克鮮重的小塊，接種葉狀體小塊在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天，隨后在無菌條件 下，用一次性注射器添加已滅菌的前體物天冬氨酸0.25m mol/L的溶液5毫升添加到培養(yǎng)瓶 中，繼續(xù)培養(yǎng)40天收獲葉狀體培養(yǎng)物。其他與實(shí)施例1相同。
[0037] 實(shí)施例