專利名稱：miR-199a-3p在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學材料技術領域。涉及一種miRNA的用途。
背景技術：
miRNA是約為22個核苷酸的內源性的小RNA，在幾乎所有已知的真核細胞中表 達，通過miRNA介導的RNA沉默途徑調節(jié)基因的表達，調節(jié)著細胞增殖、分化和凋亡；同 時miRNA還在調節(jié)病毒的復制和病毒基因的表達過程中起著重要作用。miR-122能夠提 高丙型肝炎病毒的復制(Jopling CL, et al. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by aliver-specific MicroRNA. Science 2005 ;309，1577-1581.)，而miR-32則 抑制靈長類泡沫病毒 1 型(PFV-I)的翻譯(Lecellier CH, . et al. A cellular microRNA mediates antiviraldefense in human cells. Science 2005 ;308,557-560.)。miRNA 也 可以調節(jié)HIV與宿主T細胞的相互作用，影響患者的HIV的潛伏或持續(xù)感染(Huang J， et al.Cellular microRNAscontribute to HIV-I latency in resting primary CD4+T lymphocytes. Nat Med. 2007 ；13,1241-1247 ；Chable-Bessia C, et al. Suppression of HIV-I replication by microRNAeffectors. Retrovirology 2009;6，26·)。由于 RNA 沉默 (或RNA干擾，RNAi)在植物、真菌和動物中起著天然的抗病毒的作用，所以感染的病毒也 引發(fā)細胞miRNA的變化或產生病毒miRNA (vmiRNA)以對抗細胞的抗病毒活性，此外，一些被 細胞miRNA攻擊的病毒可以通過合成特異的病毒蛋白或病毒RNA分子影響細胞miRNA的水 平(de Vries W,Berkhout B. RNAisuppressors encoded by pathogenic human viruses. Int J Biochem Cell Biol 2008 ；40, 2007-2012.) HIV-I Tat 蛋白通過抑制 Dicer 活 性來抑制RNAi, HIV-I TAR發(fā)夾可以飽和TRBP使RNAi受到抑制(Bennasser Y，Jeang, KT. HIV-I Tat interaction with Dicer-requirement for RNA. Retrovirology 2006 ； 3,95 ；Bennasser Y, et al. HIV-I TAR RNAsubverts RNA interference in transfected cells through sequestration of TARRNA-binding protein TRBP. J Biol Chem 2006 ； 281,27674-27678.)。研究miRNA在病毒增殖和基因表達過程中的作用將有助于理解宿主 與病原間的相互作用，同時為解釋病毒的組織嗜性，潛伏感染，和致瘤性提供新的理論依 據，并有助于發(fā)展抗病毒藥物。HBV為嗜肝性的部分雙鏈的DNA病毒，其基因組包含4個重疊的開放讀碼框架，編 碼乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、DNA多聚酶和X蛋白，慢性HBV感染是肝纖維化 的主要原因，最終導致肝硬化和肝細胞癌。目前HBV持續(xù)性感染的機制以及宿主與HBV之 間的作用機制尚未完全闡明。在HBV復制過程中，miRNA作為一種有效的轉錄后基因表達調控方式，也發(fā)揮著調 節(jié)病毒蛋白表達及病毒增殖的作用。確定抑制HBV增殖的宿主miRNA可能為今后開發(fā)抗 HBV的藥物或手段提供新的分子基礎或靶位點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供miR-199a-3p在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應用。本發(fā)明的技術方案概述如下miR-199a-3p在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應用，所述miR-199a-3p為序列表 SEQ IDNO :1所述的核苷酸序列。實驗結果表明miR-199a-3p能有效地降低HBsAg表達，但不影響H印G2 2. 2. 15 細胞的增殖。實時PCR對HBV DNA定量顯示miR-199a-3p抑制病毒的復制。生物信息 學分析表明在HBsAg編碼區(qū)有miR-199a-3p的結合位點，通過熒光報告載體實驗驗證了 miR-199a-3p對HBV轉錄產物的影響，同時用實時PCR和Western blot檢測進一步證實 miR-199a-3p對HBsAg的表達有抑制作用。這些結果提示，miR-199a_3p在調節(jié)和控制HBV 的復制發(fā)揮重要作用，并能制備成抗HBV的藥物。


圖1為miR-199a_3p有效抑制HBsAg的表達和HBV的復制(圖中“*”表示P < 0. 05)。(A)轉染miRNA ASOs或對照ASO的!fepG22. 2. 15細胞，實時定量RT-PCR測定的 miR-199a-3p表達水平，以小核RNA U6的水平進行標準化；(B)miR-199a-3p 的 ASO 增加 HBsAg 的表達轉染 miRNA ASO 或對照 ASO 的!fepG2 2. 2. 15細胞培養(yǎng)上清液用ELISA測定HBsAg和HBeAg，MTS方法測定細胞活性；(C)miR-199a-3p的ASO增加HBsAg的復制，用實時定量PCR分析HBV DNA,將對照 組的HBVDNA水平設為1 ；(D)HepG2 2. 2. 15細胞轉染miRNA前體或載體對照，用實時定量PCR測定 miR-199a-3p表達水平，以小核RNA U6的水平進行標準化；(E，F)過表達miR-199a-3p 降低 HBsAg 的復制及 HBsAg 的表達，!fepG2 2. 2. 15 細胞 分別轉染miRNA前體或載體對照，轉染72小時后收獲上清，用ELISA (E)和實時定量PCR(F) 分析，將對照組的HBsAg表達水平和HBV DNA水平設為1。圖2為用EGFP熒光報告載體實驗證明HBsAg是miR-199a-3p的靶(圖中“*”表 示 P < 0. 05，“#”P > 0. 05)。(A,B)miR-199a-3p候選靶的“種子序列”㈧或突變形式⑶的互補序列，突變的 核苷酸用下劃線標明，HBV基因組與miR-199a-3p互補序列由公共數據庫獲得；(C) HepG2 2. 2. 15 細胞共轉染 EGFP 報告質粒(pcDNA3/EGFP_HBsAg，pcDNA3/ EGFP-HBsAg-mut,)和 RFP 表達質粒 pDsRedl_Nl 同時轉染 miRNA ASO 或對照 AS0，在 H印G2 2. 2. 15細胞中攜帶靶基因序列的報告質粒的EGFP表達受到內源性miRNA的抑制，miRNA ASO可以降低這種抑制作用；而攜帶靶基因序列的突變形式的miRNA ASO實驗組與對照組 沒有差別。將實驗組的熒光值設為1，直方圖顯示的是3次獨立實驗的標準化的平均熒光值 (士SD) (D)HepG2 2. 2. 15細胞共轉染EGFP報告質粒和pDsRedl_Nl質粒，同時轉染miRNA表 達載體或載體對照，在H印G2 2. 2. 15細胞中，由mR-199a-3p表達載體引起mR-199a_3p過 表達抑制了攜帶HBsAg編碼序列的EGFP表達，但對攜帶HBsAg編碼序列突變形式的EGFP 表達沒有影響，將實驗組的熒光值設為1，直方圖顯示的是3次獨立實驗的標準化的平均熒
4光值(士 SD)圖3為過表達miR-199a-3p降低HBsAg基因的mRNA和蛋白的表達(圖中“*”表 示P < 0. 05)。(A) HepG2 2. 2. 15細胞分別轉染miRNA的ASO或miRNA前體，轉染后48小 時用實時定量PCR測定HBsAg的mRNA水平，用β -actin表達水平做標準化，數據代表平均 值(士SD)，將實驗組的表達水平設為1。(B)Western blot測定轉染后的IfepG2 2. 2. 15細胞的HBsAg蛋白水平上部的圖顯示Western blot定量的結果，所顯示的數據為3次獨立實驗的平均值 (士 SD)
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例11.細胞培養(yǎng)H印G2 2. 2. 15和HEK293細胞株分別在DMEM和MEM- α (GIBCO, USA)基礎培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)基均添加10%的胎牛血清，20mM HEPES, 2mM谷氨酰胺，100單位/ml青霉 素和100μ g/ml鏈霉素，所有細胞均置含5% CO2的37°C培養(yǎng)箱內，2-3天傳代一次。2.細胞轉染與人成熟miRNA完全互補的2’甲氧基(2’ -OMe)修飾的反義寡核苷酸(ASO)由 IDT公司合成，細胞以IO4/孔接種于96孔板，次日以50nM miRNA的2，-0Me_AS0或以5ng/ μ L miRNA表達載體的劑量用Lipofectamine 2000轉染細胞，每組實驗做3個復孔，按本實 驗室常規(guī)方法并參照說明書進行。48小時后換新的培養(yǎng)基，24小時后，收集細胞上清液用 來檢測HBsAg、HBeAg和HBV DNA。每組實驗至少重復3次。3.實時定量PCRmiRNAs 的定量用 SYBR Green-based real-time RT-PCR 檢測取 IOng 總 RNA 為模板，與逆轉錄引物混合進行逆轉錄；逆轉錄之后，取Ιμ cDNA用SYBR Premix Ex Taq (TakaRa, Japan)進行 PCR 反應，其過程為 94°C 3min,以后進行 94°C 30 秒，50°C 30 秒 和72°C 40秒的40個循環(huán)，反應在ABI 7500 Real-time PCR系統(tǒng)進行。進行數據處理分 析，將所得數據標準化后比較各組之間目的基因的變化，用TO做內參。HBV DNA拷貝數的檢測取轉染后H印G2 2. 2. 15細胞上清液50 μ 1，按照 Diagnostic Kitfor Quantification of Hepatitis B virus DNA(PCR-Fluorescence Probing)試劑盒的說明書進行操作，數據的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成 Real-time PCR，然后進行數據處理分析。4. MTS 實驗HepG2 2. 2. 15細胞以10，000/孔的密度接種于96孔細胞板內，次日轉染寡核苷酸 或miRNA前體，轉染72小時后，每孔加入20 μ 1 MTS/PMS混合液(MTS和PMS的最終濃度分 別為 333 μ g/ml 和 25 μ M)，CO2 培養(yǎng)箱 37°C孵育 4 小時，用 μ Quant Universal Microplate 分光光度計(Bio-tek，Germany)在490nm下測定吸光度。5. ELISA 檢測 HBsAg 和 HBeAg轉染后72小時，！fepG2 2. 2. 15培養(yǎng)上清，用PBS 1 5稀釋，用ELISA檢測試劑盒按照說明書方法測定HBsAg和HbeAg。6.質粒構建將包含預測的miR-199a-3p結合位點的HBV轉錄物的片段用PCR法擴增，所用的 引物HBsAg sense5’ CGGAATTCTTCCTCTTCATCCTGCTGCT 3’HBsAg antisense 5’ CAGTCCTCGAGACATAGAGGTTCCTTGAGCAG 3’ ；擴增的片段克隆到pcDNA3. 1 (+) /EGFP上的EGFP CDS下游的EcoR I和XhoI酶切 位點上，構建的質粒命名為pcDNA3/EGFP-HbsAg，類似的，將含有突變的miR-199a-3p結合 位點的片段克隆到pcDNA3. 1 (+)/EGFP的相同位點，命名為pcDNA3/EGFP-HBsAg-mut。為構建表達miRNA前體的質粒，用PCR擴增HEK293基因組中帶有miRNA前體的 DNA片段，其引物為pri-miR-199a-3p sense 5’ GGAGATCTTGAGCCCAGAAGCCACGATC 3’pri-miR-199a-3p antisense 5’ CGGAATTCGCCACCCTCTTAGATGCC 3’將擴增的pri-miR-199a_3p片段克隆到pcDNA3B的Bgl II與EcoR I酶切位點上7.熒光報告載體實驗HepG2 2. 2. 15和HEK293細胞分別接種到48孔板，次日分別先轉染寡 核苷酸或miRNA前體，然后再轉染已構建的不同的熒光報告載體，RFP表達載體 PDsRed2-Nl (Clontech, USA)用于數值的標準化，40小時收獲蛋白，用熒光分光光度計 F-4500 (HITACHI, Japan)檢測 EGFP 和 RFP 的熒光強度。8. Western blotting24孔板培養(yǎng)轉染寡核苷酸或質粒的H印G2 2. 2. 15細胞，細胞成片后每孔加入 ΙΟΟμ 1RIPA，置于4°C裂解25min ；收集裂解液反復吹打，4°C 12000rpm，離心lOmin，收集上 清；馬司亮藍G-250法測定蛋白含量，各樣品均取出50μ g進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳； 至目的蛋白有效分離后停止電泳，取出聚丙烯酰胺凝膠進行硝酸纖維素膜電轉移；4°C， 100mA，轉移過夜；出硝酸纖維素膜，置于Blotto封閉液中，室溫下封閉3h ；加入兔抗HBsAg 抗體，室溫下孵育2h ；TBST清洗4次，每次5min ；加入二抗(羊抗兔IgG抗體)，室溫下孵育 Ih ；TBST清洗4次，每次5min ；按照使用說明加入增強化學發(fā)光試劑，作用3min，曝光，然后 進行顯影、定影處理；觀察結果，以β -actin作為參照，膠片用LabWorks 凝膠成像及分析 系統(tǒng)進行攝像，分析蛋白條帶的亮度值。本發(fā)明用H印G2 2. 2. 15細胞(穩(wěn)定轉染完整HBV基因組的H印G2細胞，它可組成 性地表達乙型肝炎病毒的表面抗原、核心抗原和e抗原，并可進行整個HBV的復制)來研 究miRNA對HBV復制的調節(jié)作用中發(fā)現，向！fepG2 2. 2. 15細胞2，甲氧基miR-199a_3p和 miR-210的反義鏈(miR-199a-3p AS0)可促進HBsAg表達和HBV增殖(圖IB和圖1C)，推 測這是由于抑制H印G22. 2. 15細胞內源性miR-199a-3p的結果(圖1A)，故miR-199a_3p 可能具有抑制HBsAg表達和HBV增殖的作用。為了證實上述推測，將表達miR-199a-3p 的質粒(pcDNA3/pri-199a-3p)轉染到H印G2 2. 2. 15細胞使miR-199a_3p的表達提高 了 3倍(Fig. ID), ELISA和實時定量PCR檢測顯示=HBsAg表達量和HBV的復制水平均 降低30-40%，但對H印G2 2. 2. 15細胞的本身增殖沒有影響(Fig. IE and IF)。提示 miR-199a-3p在抑制HBV增殖中起者重要作用。
為了探討miR- 199a-3p抑制HBV復制的機制，通過靶位點預測數據庫預測了 miR-199a-3p可能的靶基因，預測顯示在HBsAg的編碼區(qū)含有miR-199a-3p的結合位點； miR-199a-3p與HBsAg結合及堿基互補如圖2A所示。由于miR-199a_3p在HBV HBsAg區(qū) 域都只有一個結合位點，本發(fā)明從HBV基因組的HBsAg編碼區(qū)擴增了 306bp的片段，含有 miR-199a-3p 一個推測的結合位點，克隆到pcDNA3. 1 (+)/EGFP上的增強型綠色熒光蛋白 (EGFP)編碼序列的下游區(qū)域作為報告載體，與此同時構建了含有在種子序列中帶有3個突 變的載體(圖2B)。HepG2 2. 2. 15細胞轉染報告載體和miRNA ASO或對照AS0，轉染紅色熒 光蛋白(RFP)表達載體pDsRed2-Nl的H印G22. 2. 15細胞用于標準化。轉染后48小時測定 EGFP和RFP活性，數值結果代表EGFP與RFP的標準化的比值。如圖2C所示，miRNA抑制組 的EGFP熒光強度顯著高于對照組，而轉染miRNA表達載體使miR-199a-3p過表達的H印G2 2.2. 15細胞，EGFP的水平顯著下降(圖2D)；當miRNA種子序列的結合位點突變時，報告載 體的表達與miR-199a-3p水平無關。為了進一步證實這miR-199a-3p對候選靶基因的直接 作用，將HEK293細胞共轉染EGFP報告質粒和相應miRNAASOs或相應miRNAs的前體，獲得 了果與在H印G2 2.2. 15細胞相同的結果。綜合這些觀察結果可以說明miR-199a-3p直接 靶定HBV基因的轉錄產物抑制HBsAg的表達。MiRNAs是通過轉錄后或降解靶基因的mRNA的方式來抑制靶基因的表達的，本發(fā) 明采用實時定量PCR來確定HBsAg mRNA是否受miR-199a-3p調控，結果表明與對照相比， 過表達miR-199a-3p的!fepG2 2. 2. 15細胞HBsAg mRNA水平顯著下降，而通過相應miRNA 的ASO敲低miR-199a-3p,則HBsAg mRNA水平顯著升高(圖3A)。同時Western blot實驗 表明miR-199a-3p也抑制HBsAg蛋白的翻譯(圖3B)；這些結果提示miR-199a_3p通過翻 譯抑制和mRNA降解兩種方式降低HBsAg的表達。
權利要求
miR 199a 3p在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應用，所述miR 199a 3p為序列表SEQID NO1所述的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了miR-199a-3p在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應用，miR-199a-3p為序列表SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。實驗結果表明miR-199a-3p能有效地降低HBsAg表達，但不影響HepG2 2.2.15細胞的增殖。實時PCR對HBV DNA定量顯示miR-199a-3p抑制病毒的復制。生物信息學分析表明在HBsAg編碼區(qū)有miR-199a-3p的結合位點，通過熒光報告載體實驗驗證了miR-199a-3p對HBV轉錄產物的影響，同時用實時PCR和Westernblot檢測進一步證實miR-199a-3p對HBsAg的表達有抑制作用。這些結果提示，miR-199a-3p在調節(jié)和控制HBV的復制發(fā)揮重要作用，并能制備成抗HBV的藥物。
文檔編號A61K48/00GK101954094SQ201010502949
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月11日 優(yōu)先權日2010年10月11日
發(fā)明者萬海英, 劉民, 劉濤, 李怡璇, 李欣, 湯華, 王芳, 章廣玲 申請人:天津醫(yī)科大學