乙型肝炎病毒前s1抗原定量測定試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種微粒子化學(xué)發(fā)光法乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法。試劑盒由測PreS1磁微粒、測PreS1示蹤結(jié)合物、校準(zhǔn)品、分析緩沖液、樣本稀釋液組成，本發(fā)明還公開了該定量測定試劑盒的制備方法，其采用的是微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，比ELISA具有更高的靈敏度和特異性，適合于臨床乙肝的輔助診斷，填補(bǔ)了國內(nèi)微粒子化學(xué)發(fā)光法檢測前S1抗原檢測試劑生產(chǎn)的空白。
【專利說明】乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫診斷技術(shù)，具體地說是一種磁微粒作為載體的乙型肝炎病毒 前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國是個肝炎大國，發(fā)病人數(shù)眾多，僅乙型肝炎病毒感染者就達(dá)1. 2億。約占我國 總?cè)丝诘?0%，乙型肝炎病程遷延，如得不到及時有效的治療，將會發(fā)展為肝硬化甚至肝癌， 即人們通常所說的"乙肝發(fā)展三部曲"。有資料顯示，全球每年有100萬人因感染乙肝病毒 而死亡，占全球疾病死亡原因的第九位，可見乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。
[0003] 完整的乙肝病毒為直徑42nm的球形顆粒，又稱為Dane顆粒，是1970年Dane發(fā)現(xiàn) 的；病毒含有雙層衣殼，外衣殼由脂質(zhì)雙層與蛋白質(zhì)構(gòu)成，HBsAg鑲嵌于此層中，內(nèi)衣殼含 有HBcAg，HBcAg在酶的作用下降解，而釋放出HBeAg ;在內(nèi)衣殼內(nèi)部為病毒的核心部分，含 有DNA和DNA多聚酶；DNA為雙股環(huán)狀，正股較短，負(fù)股較長，且有一缺口。負(fù)股DNA鏈上有 4個開放讀碼框，分別稱之為S、C、P、X區(qū)：S區(qū)中有S基因，pre-Sl基因和pre-S2基因，分 別編碼HBsAg、PreSl抗原、PreS2抗原；C區(qū)編碼HBcAg ;P區(qū)編碼多聚酶。
[0004] 乙型肝炎病毒至少有三種不同的抗原，而每種抗原物質(zhì)都能刺激人體產(chǎn)生相應(yīng)的 抗體，就是說抗原與抗體是配對的，乙型肝炎常見的有三對抗原和抗體。三對抗原抗體分別 是乙肝表面抗原和抗體，乙肝e抗原和抗體，乙肝核心抗原和抗體，但因核心抗原在血清 中一般不易檢出，僅其余兩對半在血液中可檢測出，故俗稱"兩對半"。近年來，前S1抗原 檢測要比HBeAg更反映 HBV復(fù)制情況。因此，前S1抗原作為HBV病毒感染、復(fù)制的指標(biāo)比 HBeAg敏感，有獨立檢測的價值，是對HBV "五項(二對半)"標(biāo)志物檢測起重要補(bǔ)充作用。
[0005] 前S1抗原在病毒侵入肝細(xì)胞過程中起重要作用，它主要存在于Dane顆粒和管型 顆粒上。前S1抗原在病毒感染、裝配、復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等方面起有十分重要 的作用。前S1抗原主要存在于血清中HBV表面，提示機(jī)體內(nèi)含有HBV就有前S1抗原。前 S1抗原與HBV-DNA，HBeAg檢測率高度符合是一項十分重要的病毒復(fù)制指標(biāo)，提示前S1抗 原可作為HBeAg和HBV-DNA檢測的補(bǔ)充和對照?？笻BeAb ( + )慢性乙型肝炎(約占患者的 30%左右）和HBV慢性無癥狀攜帶者中，前S1抗原（+ )可表示病毒的復(fù)制，提示臨床上只檢 測"乙肝五項"是不夠的，補(bǔ)充前S1抗原的測定是十分重要的，可彌補(bǔ)因病毒變異和其它原 因造成的HBeAg陰性的"誤尋"。病毒附著于肝細(xì)胞上，最重要的介導(dǎo)部位是前S1抗原的 氨基酸(AA) 21-47片段，變異的病毒只要這一區(qū)段完好就有傳染性。急性乙型肝炎患者前 S1抗原陰轉(zhuǎn)越早，預(yù)后越好，是病毒清除的最早跡象，反之，前S1抗原持續(xù)陽性，將發(fā)展至 慢性肝炎。因此它是HBV的感染與復(fù)制狀況的重要指標(biāo)。同時可作為預(yù)后及藥物療效的判 斷指標(biāo)。
[0006] 前S1抗原的傳統(tǒng)檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、膠體金法及化學(xué)發(fā)光檢測法，這些方 法雖然具有很多優(yōu)點，但在檢測的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等方面還有待進(jìn)一步提高。全自 動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析是在酶免疫分析基礎(chǔ)上結(jié)合了高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù) 和磁性微粒分離技術(shù)，與其他方法相比，這種方法有許多獨特的優(yōu)點，首先它用順磁性微粒 作為固相載體，由于顆粒體積小，表面積大，擴(kuò)大了反應(yīng)面積，大大提高了檢測靈敏度；其次 由于使用全自動儀器及配套試劑，使人為因素減至最低，提高了方法的穩(wěn)定性和結(jié)果的重 復(fù)性，同時也使得批內(nèi)差異與批間差異都較小。與放射免疫法相比，微粒子化學(xué)發(fā)光法除具 有高靈敏度、高精確度、高可靠性等優(yōu)點外，還具有如下優(yōu)點：a.無放射性污染，穩(wěn)定性好； b.特異性高；c.試劑可隨用隨取，測定方便迅速，可作為急診檢測項目。根據(jù)大量的實驗結(jié) 果以及臨床應(yīng)用資料，從實用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及其發(fā)展前景來看，該方法逐漸成為取代 放射性免疫分析和酶免疫分析的首選。但是目前國內(nèi)尚無生產(chǎn)用于前S1抗原定量檢測的 微粒子化學(xué)發(fā)光法診斷試劑，目前急需靈敏度和特異性較高的微粒子化學(xué)發(fā)光診斷試劑， 可以作為酶聯(lián)免疫試劑及膠體金等試劑的替代品，用于前S1抗原的診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有高靈敏度 和特異性，適合于臨床乙型肝炎病毒的輔助診斷的微粒子化學(xué)發(fā)光法前S1抗原定量測定 試劑盒及其制備方法。
[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是：一種乙型肝炎病毒前S1抗原定量 測定試劑盒，其包括測PreSl磁微粒、測PreSl示蹤結(jié)合物、校準(zhǔn)品、分析緩沖液、樣本稀釋 液。其特征是：所述測PreSl磁微粒為標(biāo)記有PreSl單克隆抗體的磁性微粒子；測PreSl示 蹤結(jié)合物為標(biāo)記有另一株P(guān)reSl單克隆抗體的異魯米諾；分析緩沖液、樣本稀釋液分別為 含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；校準(zhǔn)品為一低含量前S1抗原的溶液和一高含量前S1抗 原的溶液，用于測定儀內(nèi)儲存主曲線的校正。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒的制備方法，具體 步驟如下： (1) 制備測PreSl磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質(zhì)量比1 : 2,磁微粒與PreSl單克隆抗體的比例為每毫克 磁微粒標(biāo)記25 μ g的單抗，在22~26°C混勻的情況下進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后采 用甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達(dá)到25mM，反應(yīng)30分鐘，洗滌三次，加入磁微粒保存液 (含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng))，使之終濃度達(dá)到每20μ L測PreSl磁微粒中 含有80 μ g的磁微粒標(biāo)記抗體，2~8°C保存； (2) 制備測PreSl示蹤結(jié)合物 另一株P(guān)reSl單克隆抗體與異魯米諾的標(biāo)記，反應(yīng)體系為：戊二醛使用濃度為 1. 0%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，PreSl單抗與異魯米諾的質(zhì)量比為2 : 1，在22?26°C 反應(yīng)1. 5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進(jìn)行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放； 最終將異魯米諾標(biāo)記抗體用示蹤結(jié)合物稀釋液(含20%小牛血清的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng))按 照1 : 3000的稀釋比例稀釋成測PreSl示蹤結(jié)合物； (3) 制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (4) 制備樣本稀釋液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (5)校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品1和校準(zhǔn)品2,其中校準(zhǔn)品1為低含量前S1抗原的溶液，校準(zhǔn)品 2為高含量前S1抗原的溶液。
[0010] 本發(fā)明的原理是利用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，采用雙抗體夾心法定量測定 人血清/血漿中乙型肝炎病毒前S1抗原的含量。在磁性微粒子上共價標(biāo)記PreSl單克隆 抗體，加入待測樣本和分析緩沖液，溫育后，再加入異魯米諾標(biāo)記的另一株P(guān)reSl單克隆抗 體，形成磁微粒標(biāo)記抗體-抗原-異魯米諾標(biāo)記抗體復(fù)合物，充分洗滌后，加入激發(fā)液發(fā)光， 相對發(fā)光強(qiáng)度（RLU)與血清/血漿中PreSl含量呈正相關(guān)，樣本的含量可以利用該批號試 劑盒已設(shè)定的曲線，通過全自動化學(xué)發(fā)光測定儀自動計算出來。
[0011] 本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點是采用了微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，比ELISA具有更高 的靈敏度和更好的特異性，填補(bǔ)了國內(nèi)前S1抗原定量檢測的微粒子化學(xué)發(fā)光法診斷試劑 生產(chǎn)的空白。

【具體實施方式】
[0012] 本發(fā)明試劑盒采用微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，檢測血清或血漿中是否存在前 S1抗原。下面具體描述前S1抗原定量測定試劑盒及其制備方法。
[0013] 一種乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒，其包括測PreSl磁微粒、測PreSl 示蹤結(jié)合物、校準(zhǔn)品、分析緩沖液、樣本稀釋液。所述測PreSl磁微粒為標(biāo)記有PreSl單克 隆抗體的磁性微粒子；測PreSl示蹤結(jié)合物為標(biāo)記有另一株P(guān)reSl單克隆抗體的異魯米諾； 分析緩沖液、樣本稀釋液分別為含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；校準(zhǔn)品為一低含量前S1 抗原的溶液和一高含量前S1抗原的溶液，用于測定儀內(nèi)儲存主曲線的校正。
[0014] 本發(fā)明上述前S1抗原定量測定試劑盒的制備方法，其具體步驟如下： (1) 制備測PreSl磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質(zhì)量比1 : 2,磁微粒與PreSl單克隆抗體的比例為每毫克 磁微粒標(biāo)記25 μ g的單抗，在22~26°C混勻的情況下進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后采 用甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達(dá)到25mM，反應(yīng)30分鐘，洗滌三次，加入磁微粒保存液 (含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng))，使之終濃度達(dá)到每20μ L測PreSl磁微粒中 含有80 μ g的磁微粒標(biāo)記抗體，2~8°C保存； (2) 制備測PreSl示蹤結(jié)合物 另一株P(guān)reSl單克隆抗體與異魯米諾的標(biāo)記，反應(yīng)體系為：戊二醛使用濃度為 1. 0%-2. 0%，其最佳使用濃度為1. 25%，PreSl單抗與異魯米諾的質(zhì)量比為2 : 1，在22?26°C 反應(yīng)1. 5小時，用pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進(jìn)行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放； 最終將異魯米諾標(biāo)記抗體用示蹤結(jié)合物稀釋液(含20%小牛血清的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng))按 照1 : 3000的稀釋比例稀釋成測PreSl示蹤結(jié)合物； (3) 制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (4) 制備樣本稀釋液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； (5)校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品1和校準(zhǔn)品2,其中校準(zhǔn)品1為低含量前S1抗原的溶液，校準(zhǔn)品 2為高含量前S1抗原的溶液。
[0015] 本發(fā)明上述各種原材料的選擇要求如下： 1、磁微粒標(biāo)記用PreSl單克隆抗體的選擇 首先就抗體的外觀、濃度、純度、效價進(jìn)行驗證，結(jié)果抗體為微帶乳光的澄清液體，無肉 眼可見異物，無搖不散的沉淀，用紫外吸收法檢測其蛋白含量應(yīng)不低于2. Omg/mL，效價應(yīng)不 低于標(biāo)示效價且不低于1 :10000, SDS-PAGE檢測純度應(yīng)主帶清晰，無明顯雜帶，研究結(jié)果表 明PreSl單克隆抗體完全可用于本發(fā)明試劑盒的制備。
[0016] 2、異魯米諾標(biāo)記用另一株P(guān)reSl單克隆抗體的選擇 首先仍就抗體的外觀、濃度、純度、效價進(jìn)行驗證，結(jié)果抗體為微帶乳光的澄清液體，無 肉眼可見異物，無搖不散的沉淀，用紫外吸收法檢測其蛋白含量應(yīng)不低于2. Omg/mL，效價應(yīng) 不低于標(biāo)示效價且不低于1 :10000, SDS-PAGE檢測純度應(yīng)主帶清晰，無明顯雜帶，研究結(jié)果 表明另一株P(guān)reSl單克隆抗體也完全可用于本發(fā)明試劑盒的制備。
[0017] 3、磁微粒的選擇 通過對磁微粒的外觀，標(biāo)記蛋白的比率，磁響應(yīng)性，磁微粒吸附一致性等方面進(jìn)行分 析，經(jīng)過多次分析研究，將磁微粒混勻，在燈光下觀察，易分散，無聚集，無異物；將蛋白采用 不同的方法進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記率應(yīng)大于90% ;將磁微粒置370-380特斯拉的磁鐵上，觀察磁微 粒的聚集速度，分散均勻的磁微粒在10秒鐘內(nèi)完全聚集；磁微粒吸附一致性CV < 10%。研 究結(jié)果表明直徑為〇. 90-1. 10 μ m的磁微粒，含有羧基基團(tuán)，標(biāo)記率最高，可用于本發(fā)明診 斷試劑盒的制備。
[0018] 4、異魯米諾的選擇 將異魯米諾用DMS0 (二甲基亞砜）進(jìn)行溶解，用純化水進(jìn)行稀釋至1. 2 X 1(T5M/L的量， 加入10 μ L異魯米諾液體，各加入200 μ L激發(fā)液，測定其發(fā)光值，發(fā)光值應(yīng)> 160000,經(jīng)過 研究，符合要求的異魯米諾可作為發(fā)光的原料。
[0019] 本發(fā)明前S1抗原定量測定試劑盒檢測樣品中前S1抗原的檢測方法是：首先取出 濃縮洗液，用純化水按照倍數(shù)進(jìn)行稀釋。而后取出激發(fā)Α液和Β液，放置全自動化學(xué)發(fā)光測 定儀合適的位置。激發(fā)A液為含有4%NaOH的緩沖液，激發(fā)B液為含有0. 12%H202的緩沖液。 接著將試劑盒從冰箱中取出后，放于儀器試劑區(qū)至少混勻30分鐘后方可使用，并嚴(yán)格按照 設(shè)定的程序進(jìn)行加樣和溫育。
[0020] 具體加樣方法如下：80 μ L血清/血漿樣本、10 μ L分析緩沖液以及20 μ L測PreSl 磁微粒在37°C的條件下反應(yīng)20分鐘，加入150 μ L測PreSl示蹤結(jié)合物，37°C反應(yīng)10分鐘， 再用稀釋后的洗液洗滌3次，最終分別加入200 μ L激發(fā)A液和激發(fā)B液，測定發(fā)光值。樣 本的含量可以利用該批號試劑盒已設(shè)定的曲線，通過發(fā)光儀自動計算出來。
[0021] 本發(fā)明質(zhì)量控制要求是：試劑盒第一次操作，必須采用校準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)，每間隔 10天用校準(zhǔn)品對試劑盒的主曲線進(jìn)行修正，按照修正的主曲線對樣本進(jìn)行定量。
[0022] 本發(fā)明試劑盒檢測PreSl企業(yè)內(nèi)控品，檢測的結(jié)果顯示：該試劑盒的陰、陽性參考 品符合率、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、線性、穩(wěn)定性等各項質(zhì)量指標(biāo)均符合企業(yè)要求。陰性符
【權(quán)利要求】
1. 一種乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒，包括 (1) 測PreSl磁微粒：標(biāo)記有PreSl單克隆抗體的磁性微粒子； (2) 測PreSl示蹤結(jié)合物：標(biāo)記有另一株P(guān)reSl單克隆抗體的異魯米諾； (3) 校準(zhǔn)品：一低含量前S1抗原的溶液和一高含量前S1抗原的溶液； (4) 分析緩沖液：含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液； (5) 樣本稀釋液：含牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
2. -種制備權(quán)利要求1乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒的方法，其特征是具體 步驟如下： (1) 制備測PreSl磁微粒 將帶羧基磁微粒與EDC按質(zhì)量比1 : 2,磁微粒與PreSl單克隆抗體的比例為每毫克 磁微粒標(biāo)記25 μ g的單抗，在22~26°C混勻的情況下進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時間1小時，標(biāo)記后采用 甘氨酸封閉多余的位點，使之濃度達(dá)到25mM，反應(yīng)30分鐘，洗滌三次，加入磁微粒保存液， 所述磁微粒保存液為含1%牛血清白蛋白的0. 01M PBS緩沖系統(tǒng)，使之終濃度達(dá)到每20 μ L 測PreSl磁微粒中含有80 μ g的磁微粒標(biāo)記抗體，2~8°C保存； (2) 制備測PreSl示蹤結(jié)合物 另一株P(guān)reSl單克隆抗體與異魯米諾的標(biāo)記，反應(yīng)體系為：戊二醛使用濃度為 1. 0%-2. 0%，PreSl單抗與異魯米諾的質(zhì)量比為2 : 1，在22?26 °C反應(yīng)1. 5小時，用 pH7. 2-7. 4的0. 01M PBS進(jìn)行透析，透析后加入等體積甘油-20°C存放；最終將異魯米諾標(biāo) 記抗體用示蹤結(jié)合物稀釋液，所述示蹤結(jié)合物稀釋液為含20%小牛血清的0. 01M PBS緩沖 系統(tǒng)，按照1 : 3000的稀釋比例稀釋成測PreSl示蹤結(jié)合物； (3) 制備分析緩沖液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1. Og/L，按上述配方配制稀釋液； (4) 制備樣本稀釋液 磷酸二氫鈉〇.39g/L、磷酸氫二鈉2.68g/L、氯化鈉8.50g/L、牛血清白蛋白10g/L、硫 柳汞1.0g/L，按上述配方配制稀釋液； 校準(zhǔn)品包括校準(zhǔn)品1和校準(zhǔn)品2,其中校準(zhǔn)品1為低含量前S1抗原的溶液，校準(zhǔn)品2為 高含量前S1抗原的溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙型肝炎病毒前S1抗原定量測定試劑盒的制備方法，其特征在 于：步驟（2)中戊二醛使用濃度為1. 25%。
【文檔編號】G01N33/532GK104090108SQ201410347050
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】蒙紅勝, 劉京偉, 林芳芳, 王凌凌, 趙海英 申請人:威海威高生物科技有限公司