專利名稱：特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科中的一員，它會(huì)引發(fā)急性和慢性肝炎。世界人口中大約3. 5億人，尤其在韓國(guó)和中國(guó)5-8%的人口是慢性HBV患者，而且HBV是肝病和肝癌的主因。雖然抗HBV疫苗的發(fā)展使預(yù)防乙型肝炎成為可能，但仍有很多人由于HBV感染而患上慢性肝炎。HBV感染會(huì)引起肝炎、肝硬化和肝癌，而且在慢性肝炎患者中肝癌的發(fā)生率比正常人高300倍，WHO (世界衛(wèi)生組織)透露大約80%的肝癌是通過(guò)HBV感染由慢性乙型肝炎引起的。目前可用的乙型肝炎治療藥物包括核苷酸類似物，如拉米夫定(Iamivudine)Ja德福韋酯(adefovir dipivoxil)以及其它核苷酸類似物，已知它們能夠抑制HBV的DNA聚合酶。但是，施用該類藥物三年后，在75%的患者中出現(xiàn)了抗性病毒，導(dǎo)致療效降低，因此將它們與乙型肝炎抗體制劑聯(lián)合應(yīng)用以預(yù)防垂直傳播和肝移植后的感染。目前應(yīng)用的乙型肝炎抗體制劑是采用高技術(shù)純化和病毒滅活的方法，以具有抗-HBV抗體的人血為來(lái)源制備的，但由于具有高抗-HBV抗體的昂貴人血漿可用性低以及滅活似乎可行的人血漿來(lái)源的病毒成本高，這種方法不能滿足日益增長(zhǎng)的需要。盡f'i;K0hler和Milstein (1975)建立了制備單克隆抗體(mAb)的方法,源于小鼠的單克隆抗體已主要用于診斷或一些治療。然而，由于以治療目的施用于人體時(shí)，可能產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，該鼠抗體不能施用。為了解決HAMA的問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了嵌合的和人源化的抗體。嵌合抗體含有鼠mAb的可變區(qū)(Fv片段)，其構(gòu)成了整個(gè)抗體分子的約30%。相比之下，人源化抗體含有鼠mAb的CDRs (互補(bǔ)決定區(qū))，其構(gòu)成了整個(gè)抗體的約10%。雖然這類嵌合的和人源化的抗體明顯降低了 HAMA反應(yīng)，但在治療需要長(zhǎng)期和持續(xù)施用的慢性病如慢性肝炎時(shí)，采用人抗體可能更好。本發(fā)明致力于開(kāi)發(fā)新的改進(jìn)抗體(improved antibodies),并發(fā)現(xiàn)這類抗體可通過(guò)結(jié)合HBV表面抗原而用于滅活HBV。發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原的新抗體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供分別編碼所述抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA,以及包括其的表達(dá)載體。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療乙型肝炎的藥物組合物，其包括所述抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體，其包括a)具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；b)具有SEQ ID N0:2、3和4所示氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的輕鏈可變區(qū)；c)重鏈恒定區(qū)；以及d)輕鏈恒定區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供編碼具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)或具有SEQ ID NO: 2、3和4所示氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的輕鏈可變區(qū)的DNA,以及包括其的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明提供用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)的方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療乙型肝炎的藥物組合物，其包括所述抗體。


結(jié)合附圖從本發(fā)明下面的描述中，本發(fā)明的上述和其它目的及特性將更加明顯，圖中分別顯示如下 圖I :電泳(1%瓊脂糖凝膠)分析的圖像結(jié)果，顯示PCR合成的分別編碼本發(fā)明的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的DNA;圖2 :包括本發(fā)明抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的噬菌體展示載體PKS4H的圖譜；圖3 :說(shuō)明利用淘選技術(shù)(the panning technique)從抗體庫(kù)篩選抗體過(guò)程的簡(jiǎn)圖；圖4 :從抗體庫(kù)篩選出的本發(fā)明抗體的單鏈可變片段(scFv)的氨基酸序列；圖5 :表達(dá)本發(fā)明的人抗體的重鏈HB48-33-重-pRC13、HB48-35-重-pRC13或HB48-59-重-pRC13的表達(dá)載體的圖譜；圖6、7和8 :分別為表達(dá)本發(fā)明的人抗體的輕鏈HB48-33-輕-pKC12、HB48-35-輕-pKC12和HB48-59-輕-pKC12的表達(dá)載體的圖譜；圖9 :從轉(zhuǎn)化子表達(dá)的重鏈和輕鏈的SDS-PAGE分析；圖10 :人抗體(HB48-33、HB48-35和HB48-59)對(duì)HBV表面抗原的相對(duì)親和力；圖11 :通過(guò)插入HBV DNA序列而由pcDNA3. I制備的載體pHBVl. 3-MBRI的圖譜，該載體用于制備急性乙型肝炎小鼠模型；圖12 :顯示本發(fā)明人抗體HB48-33、HB48-35和HB48-59的中和能力的曲線圖，HB48-33、HB48-35和HB48-59是利用急性乙型肝炎小鼠模型通過(guò)體內(nèi)效力試驗(yàn)篩選出的。已證實(shí)注射圖11的質(zhì)粒24小時(shí)后表達(dá)了 HBV表面抗原(HBsAg)，經(jīng)施用本發(fā)明抗體后表面抗原減少。表面抗原米用Genedia HBsAg ELISA 3. O (Green Cross MS,韓國(guó))測(cè)定。發(fā)明詳述以下將詳述本發(fā)明。本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗體，其包括a)具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；b)具有SEQ ID NO: 2、3和4所示氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的輕鏈可變區(qū)；c)重鏈恒定區(qū)；以及d)輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的抗體的特征在于，通過(guò)特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原以滅活HBV，有效預(yù)防或治療乙型肝炎。特異性結(jié)合HBV表面抗原的抗體可通過(guò)改良的曬菌體展示方法(a phage displaymethod) (Smith,科學(xué)(Science), 228, 1315-1317，1985 ;以及 Hoogenboom&Chames,今日免疫學(xué)(Immunol Today), 21, 371-378, 2000)而優(yōu)選地篩選。在噬菌體展示方法中，編碼絲狀噬菌體(如M13、Fd或Fl)表面蛋白的基因(基因III)與編碼目標(biāo)抗體的基因融合，以生成具有以抗體-曬菌體形式暴露在表面的融合抗體(a fused antibody)的病毒顆粒。隨后，通過(guò)生物淘選技術(shù)，利用該抗體的高特異性和親和性以及該噬菌體的高感染性可從噬菌體庫(kù)中篩選目標(biāo)抗體(Burton&Barbas,免疫學(xué)前沿(Adv. Immunol.), 57, 191-280, 1994 ；Winter 等，免疫學(xué)年度評(píng)論(Annu. Rev. Immunol. )，12，433-455，1994 ;以及 Hoogenboom 等，免疫技術(shù)(Imunotechnology)，4，1-20，1998 ;Kim 等，HybridHybridomics, 21，385-392，2002)。噬菌體展示載體可以為 pKS4H(見(jiàn)韓國(guó)專利 No. 0635370)或 pCANTAB5E，優(yōu)選 pKS4H。本發(fā)明人已經(jīng)從噬菌體庫(kù)中篩選出三種人抗體(HB48-33、HB48-35和HB48-59)，并檢測(cè)了抗體的親和力和對(duì)于HBV表面抗原的中和能力(圖10和11)。另外，還分析了重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列，并分別證實(shí)所有重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2、3和4所示的氨基酸序列。 本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)與人抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)相同。本發(fā)明提供編碼具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)的DNA。優(yōu)選地，該DNA可以包括編碼SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的多聚核苷酸。本發(fā)明提供編碼具有SEQ ID NO: 2、3和4所示氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的抗體輕鏈可變區(qū)的DNA。優(yōu)選地，該DNA可以包括編碼SEQ ID NO: 2、3和4所示氨基酸序列的具有SEQ ID NO :6、7和8所不核苷酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的多聚核苷酸。本發(fā)明提供表達(dá)特異性結(jié)合HBV表面抗原的抗體的重鏈可變區(qū)的表達(dá)載體，其包括編碼該抗體的重鏈可變區(qū)的DNA。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體可以為“HB48-33-重-pRC13”、“HB48-35-重-pRC13” 或 “HB48-59-重-pRC13”，其圖譜如圖 5 所示。具體地，該載體可以通過(guò)將用淘選法篩選出的抗體的VH片段(HB48VH)插入到合適的載體，如PRC13載體(保藏編號(hào)No. KCLRF-BP-00054 ;韓國(guó)專利No. 523732)來(lái)制備。本發(fā)明提供表達(dá)特異性結(jié)合HBV表面抗原的抗體的輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體，其包括編碼抗體輕鏈可變區(qū)的DNA。優(yōu)選地，該表達(dá)載體可以為其圖譜如圖6所示出的“HB48-33-輕_pKC13”、其圖譜如圖7所示出的“HB48-35-輕-pKC13”或其圖譜如圖8所示出的 “HB48-59-輕-pKC13”。具體地，該載體可以通過(guò)將用淘選法篩選出的抗體的各VL片段(HB48-33VL、HB48-35VL或HB48-59VL)插入到合適的載體，如pKC12載體(保藏編號(hào)No. KCLRF-BP-00054 ;韓國(guó)專利 No. 523732)來(lái)制備。本發(fā)明提供一種用表達(dá)本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞系。該動(dòng)物細(xì)胞系可以是CH0(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)、HEK 293或NSO細(xì)胞系，優(yōu)選CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞系。本發(fā)明的抗體可通過(guò)將重鏈和輕鏈的可變區(qū)相互連接來(lái)制備。可通過(guò)諸如競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法(Kim等，Hybridoma, 20，265-272，2001)測(cè)定本發(fā)明抗體對(duì)抗原的親和力。如圖10所示，在本發(fā)明的人抗體中，HB48-35的親和力最高，而HB48-59和HB48-33的親和力分別比HB48-35低約I. 3倍和4倍。此外，通過(guò)將HBV DNA高壓水注射至C57BL6小鼠以誘導(dǎo)乙型肝炎樣癥狀(高壓水注射(Hydrodynamic injection)；Liu等，基因治療(Gene Therapy)，6，1258-1266，1999)而制備HBV小鼠模型，在該HBV小鼠模型中，HB48-33、HB48-35和HB48-59抗體顯示出對(duì)HBV的中和能力，其中小鼠血液中抗體將HBV的表面抗原降低到基準(zhǔn)水平(圖12)。因此，本發(fā)明的抗體可通過(guò)結(jié)合HBV表面抗原來(lái)滅活HBV，用于預(yù)防或治療乙型肝炎?？紤]到該結(jié)果，本發(fā)明提供一種預(yù)防或治療乙型肝炎的藥物組合物，其包括所述抗體。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法制成藥物制劑。制劑過(guò)程 中，優(yōu)選將抗體與載體混合或用載體稀釋，或裝入容器形式的載體中。當(dāng)載體作為稀釋劑時(shí)，其可以為固體、半固體或液體，用作用于抗體的囊泡、賦形劑或培養(yǎng)基。因此，制劑可以是片劑、丸劑、粉劑、袋裝齊 、膠囊、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣溶膠、軟和硬明膠膠囊、注射用無(wú)菌溶液、無(wú)菌粉劑等形式。合適的載體、賦形劑或稀釋劑的實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。制劑還可以包括填充劑、抗凝血?jiǎng)?rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的抗體組合物還可以進(jìn)一步包括與抗體協(xié)同作用的干擾劑、抗-HBV單克隆抗體、抗-HBV多克隆抗體、核苷類似物、DNA聚合酶抑制劑、siRNA制劑或用作抗病毒劑的治療用疫苗。通過(guò)向包括人的哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明組合物，可預(yù)防或治療HBV感染和HBV相關(guān)疾病。組合物中抗體的劑量取決于對(duì)象、病癥嚴(yán)重程度、施用頻率和醫(yī)生的決定。作為有效成分的抗體可以每天以約O. OOl-lOmg/kg體重,優(yōu)選O. 005-lmg/kg體重的有效劑量,通過(guò)非腸道途徑單劑量或分劑量地施用于哺乳動(dòng)物。在某些情況下，相對(duì)于上述劑量，小劑量或大劑量可能是合適的，而大劑量可以每天分為小劑量施用。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而非旨在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I :RNA的分離為篩選出特異性結(jié)合HBV表面抗原的抗體，建立了人抗體庫(kù)。采用來(lái)自人骨髓、人胸腺、人脾臟和人類B細(xì)胞的RNA混合物。除了人類B細(xì)胞RNA外，其它RNA均購(gòu)自Clontech(美國(guó))，人類B細(xì)胞RNA按如下分離將取自健康成人的50mL血液通過(guò)與50mL PBS混合進(jìn)行稀釋。將3mLFicoll-Paque PLUS(通用醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare),美國(guó))放入15mL試管中，并向其中加入4mL稀釋的血液。將混合物在3000rpm離心以分離白血球。將2mL分離的白血球與6mL PBS混合，以IOOXg離心10分鐘。將100 μ L白血球與ImL三唑(Trizole)(生命科技公司(Life Technology),美國(guó))混合以分離RNA。同時(shí)，分離的RNA用蒸餾水稀釋，測(cè)定260nm處的吸收度來(lái)計(jì)算其數(shù)量(I. 8 μ g/μ L;Ultraspec 2000UV-VIS分光光度計(jì)，GE，美國(guó))。詳細(xì)過(guò)程如下將ImL三唑(trizole)加入到IOOyL白血球中，充分搖勻，室溫(15°C -30°C )放置5分鐘。然后加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。隨后，將混合物在2^80C的條件下，15，OOOrpm離心15分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的試管。加入500 μ L異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘。隨后，將混合物在2 8°C的條件下，15，OOOrpm離心5分鐘以去除上清液。向其中加入ImL 75%乙醇，將混合物在2、°C的條件下，15，OOOrpm離心5分鐘以除去乙醇，將RNA團(tuán)塊在室溫干燥5分鐘，向其中加入150 μ L蒸餾水以懸浮RNA團(tuán)塊，在260nm處測(cè)定懸浮液的吸收度。剩余物在-20°C保存。實(shí)施例2 :抗體基因的擴(kuò)增將I μ g實(shí)施例I分離的RNA和I μ L pd(T) 12_18(0. 5 μ g/ μ L)與蒸餾水混合使終體積為12. 5 μ L0使混合物在70°C反應(yīng)2分鐘并在冰中冷卻。然后，向其中加入5X反應(yīng)緩沖液、IOmM dNTP mix、重組RNase抑制劑和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Clontech，美國(guó))，使終體積為20 μ L，隨后在42 °C反應(yīng)I小時(shí)并在95°C反應(yīng)5分鐘以合成cDNA。用LiquiMixQM Premix, Magenta (Neurotics Inc, 韓國(guó))進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，4 μ L cDNA 為模板，19 μ L 蒸懼水，以及I μ L(25pmol/y L)引物設(shè)計(jì)為scFv區(qū)、重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(k (kappa)和 λ (lambda))分別為[ScFv:SEQ ID N0:9 (正向)，10 (反向-κ )和 11 (反向-λ );重鏈可變區(qū)SEQ ID 勵(lì):12(正向-￥!11)，13(正向-￥!12)，14(正向-￥!13)，15(正向-￥!14)，16(正向-￥冊(cè))，17(正向-￥冊(cè))，18(正向-￥!17)，19(反向)；輕鏈可變區(qū)κ鏈SEQ ID NO 20 (正向-VK1/3A)，21 (正向-VK1/3B)，22 (正向-VK2)，23 (正向-VK4)，24 (正向-VK5)，25 (正向-VK6)，26 (反向-JK-A)，27 (反向-JK-B)和28 (反向-JK-C);輕鏈可變區(qū)λ鏈SEQ IDNO :29 (正向-VLl 3-A)，30 (正向-VLl 3-B)，31 (正向-VL4)，32 (正向-VL5)，33 (正向-VL6)，34 (正向-VL7)，35 (正向-VL8)，36 (正向-VL9)，37 (正向-VL10)，38 (反向-JL-A)和 39(反向-JL-B)。PCR反應(yīng)條件為95°C 5分鐘，95°C I分鐘，55 °C 2分鐘，72 °C 2分鐘，30個(gè)循環(huán)，最后7TC 15分鐘。通過(guò)在I. 2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳來(lái)鑒定擴(kuò)增的抗體DNA (圖I)，采用Qiagen試劑盒(Qiagen，德國(guó))進(jìn)行純化。如圖I所示，獲得了對(duì)應(yīng)于重鏈和輕鏈可變區(qū)U和入)的350bp DNA帶。圖I中,M是指分子量標(biāo)記(size marker), VH :重鏈可變區(qū)(I道1型重鏈可變區(qū)；2道11型重鏈可變區(qū)；3道111型重鏈可變區(qū)；4道VI型重鏈可變區(qū)；5道V型重鏈可變區(qū)；6道VI型重鏈可變區(qū)；以及7道VII型重鏈可變區(qū))，而VL是指輕鏈可變區(qū)(9道1/3 κ輕鏈可變區(qū)；10道2 κ輕鏈可變區(qū)；11道4 κ輕鏈可變區(qū)；12道5κ輕鏈可變區(qū)；13道6 κ輕鏈可變區(qū)；15道f 3 λ輕鏈可變區(qū)；16道4 λ輕鏈可變區(qū)17道5 λ輕鏈可變區(qū)；18道6λ輕鏈可變區(qū)；19道7λ輕鏈可變區(qū)；20道8 λ輕鏈可變區(qū)；21道9 λ輕鏈可變區(qū)；以及22道10 λ輕鏈可變區(qū))。實(shí)施例3 :抗體DNA的限制件酶切分別用限制性內(nèi)切酶Sfil/BspEI和BspEI/Notl對(duì)實(shí)施例2制備的VH和VL (K和λ)進(jìn)行酶切，酶切片段從I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用Qiagen試劑盒純化。實(shí)施例4 :抗體DNA的連接(LiRation)和庫(kù)的制備采用限制性內(nèi)切酶Sf iI/BspEI酶切噬菌體展示載體pKS4H (株式會(huì)社綠十字(Green cross Corp.)，韓國(guó)，見(jiàn)韓國(guó)專利No. 0635370)，利用I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，隨后采用Qiagen試劑盒純化。將40 μ gpKS4H與10 μ g實(shí)施例3制備的VH混合，向其中加入T4DNA連接酶(Iigase) (New England BioLabs,美國(guó))，隨后在25 °C反應(yīng)過(guò)夜。連接混合物采用Qiagen試劑盒純化，并通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli)XLl-blue (Stratagene,美國(guó))中，轉(zhuǎn)化體在IOOmL培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜,并分離質(zhì)粒。該質(zhì)粒被命名為 “pKS4H-VH- Δ VL”。
用限制性內(nèi)切酶BspEI/Notl對(duì)質(zhì)粒pKS4H_VH- Δ VL進(jìn)行酶切，并如上所述進(jìn)行純化。然后，將40 μ g pKS4H-VH- Δ VL質(zhì)粒與10 μ g實(shí)施例3制備的VL PCR DNA以及T4DNA連接酶(New England BioLabs,美國(guó))混合,在25 反應(yīng)過(guò)夜。連接混合物采用Qiagen試劑盒純化，并通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli)XLl-blue (Stratagene,美國(guó))中。轉(zhuǎn)化體在IOOmL含有羧芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)2小時(shí)。隨后，如Engberg等人(Mol. Biotechnol.，6，287-310，1995)的報(bào)道，將 Μ13 輔助噬菌體(Stratagene,美國(guó))接種到培養(yǎng)基中并培養(yǎng)16小時(shí)以制備噬菌體庫(kù)。同時(shí),從大腸桿菌分離質(zhì)粒并命名為“PKS4H-VH-VL”，該質(zhì)粒圖譜在圖2示出。實(shí)施例5 :篩選結(jié)合HBV表面抗原的抗體結(jié)合HBV表面抗原的抗體通過(guò)改良的淘選技術(shù)(Engberg等，Mol.Biotechnol.，6，287-310，1996 ；以及 Kim 等，基因(Gene)，241，19-25，2000)來(lái)篩選。具體地，將HBV表面抗原(株式會(huì)社綠十字(Green cross Corp.),韓國(guó))用PBS稀釋，并用稀釋的抗原包被每個(gè)免疫管(NUNC，丹麥)。然后將實(shí)施例4制備的噬菌體庫(kù)加入到包被的免疫管，并在37°C孵育2小時(shí)。采用O. IM甘氨酸緩沖液(pH 2. O)洗提結(jié)合HBV的噬菌體。 隨后，用噬菌體感染大腸桿菌(E. Coli)XLl-blue并加入輔助噬菌體。將該大腸桿菌孵育過(guò)夜并向其中加入PEG溶液(20%PEG8，000和15%NaCl)。然后，收集沉淀的噬菌體(噬菌體挽救(phage rescue))，并使噬菌體與HBV表面抗原包被的免疫管再次進(jìn)行反應(yīng)，上述過(guò)程重復(fù)4次。從該過(guò)程中篩選出三個(gè)結(jié)合HBV表面抗原的人抗體，并命名為HB48-33、HB48-35和HB48-59。圖3說(shuō)明了采用噬菌體展示庫(kù)篩選人抗體的過(guò)程。根據(jù)常規(guī)方法(Kim等，基因(Gene), 241，19-25，2000)，使來(lái)自第4次淘選的各個(gè)菌落在2mL培養(yǎng)基中生長(zhǎng),通過(guò)IPTG (異丙基-β -D-I-硫代半乳批喃糖苷(isopropylβ -D-l-thiogalactopyranoside))處理以誘導(dǎo)抗體表達(dá)。通過(guò) ELISA 法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè))采用包被HBV表面抗原的96孔板測(cè)定抗體的表達(dá)。實(shí)施例6 :篩詵出的抗體的序列分析將分泌實(shí)施例5篩選出的人抗體HB48-33、HB48-35和HB48-59的菌落在含有50 μ g/mL羧芐青霉素的IOmLLB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，并采用Qiagen質(zhì)粒微型試劑盒(Qiagen, Valencia, CA,美國(guó))從中分離質(zhì)粒。將質(zhì)粒用Sfil/Notl酶切，并在瓊脂糖凝膠中電泳以鑒定抗體片段的插入。分析插入質(zhì)粒中的scFv的DNA序列,用Genotech(Daejeon,韓國(guó))的SEQ ID NO:40所示的測(cè)序引物p033分析scFv的核苷酸序列。米用基于網(wǎng)絡(luò)的程序(www. expasy. org:DNA_蛋白質(zhì)翻譯工具(DNA to Proteintranslate tool))將人抗體 ΗΒ48_33、ΗΒ48_35 和 ΗΒ48-59 的 scFv 的 DNA 序列翻譯成氨基酸。翻譯的氨基酸序列見(jiàn)圖4。如圖4所示，人抗體HB48-33、HB48-35和HB48-59具有以相同氨基酸序列表示的重鏈可變區(qū)和不同氨基酸序列表示的輕鏈可變區(qū)。實(shí)施例7 :表汰載體的構(gòu)建為了將抗體片段轉(zhuǎn)化為完整的免疫球蛋白，采用抗體表達(dá)載體PRC13和pKC12 (見(jiàn)韓國(guó)專利 No. 523732 ;保藏號(hào)KCLRF-BP_00054)。重鏈表達(dá)載體pRC13是其中抗體的VH片段易于插入HindIII和ApaI位點(diǎn)的載體。如圖5的示例，采用SEQ ID N0:41(正向)和42(反向)所示的引物在95°C I分鐘、55°C 2分鐘、72°C 2分鐘的條件下，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼人抗體HB48-33、HB48-35和HB48-59的重鏈可變區(qū)的DNA，用Hindlll/Apal酶切，并插入至經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pRC13中。重組載體被命名為 “HB48-33-重-pRC13”、“HB48-35-重-pRC13” 或“HB48-59-重-pRC13” (見(jiàn)圖5)。同時(shí)，輕鏈表達(dá)載體pKC12是其中抗體的VL片段易于插入NheI和ApaI位點(diǎn)的載體。如圖6、7和8的示例，采用SEQ ID NO:43 (正向)和44(反向)所示的引物在95°C I分鐘、55°C 2分鐘、72°C 2分鐘的條件下，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼人抗體HB48-35和HB48-59的κ輕鏈可變區(qū)的DNA，采用SEQ ID NO:43 (正向)和45 (反向)所示的引物在95°C I分鐘、55°C 2分鐘、72°C 2分鐘的條件下，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼人抗體HB48-33的λ輕鏈可變區(qū)的DNA。用Nhel/Apal酶切擴(kuò)增的DNA，并插入至經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pKC12中。重組載體被分別命名為 “HB48-33-輕-pKC12”, “HB48-35-輕-pKC12” 和 “HB48-33-輕-pKC12” (見(jiàn)圖6、7 和 8)。實(shí)施例8 :分泌抗體的動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建在轉(zhuǎn)染前，在5%C02、37°C的孵育箱中，使2X105CH0(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞在裝有包括10%FBS(生命科技公司(Life Technologies)，美國(guó))的a-MEM培養(yǎng)基(生命科技公司，美國(guó))的Τ-25瓶(NUNC，丹麥)中生長(zhǎng)24小時(shí)，直至達(dá)到50%融合(confIuency)。然后，將30 μ g脂質(zhì)體(Iipofectin)(生命科技公司，美國(guó))加入至I. 5mL的opti_MEM(生命科技公司，美國(guó))并在室溫靜置90分鐘。同時(shí)將8ygHB48-33-重-pRC13&7ygHB48-33-輕-pKC12、8 μ gHB48-35-重-pRC13&7 μ gHB48_35-輕-pKC12 和 8 μ gHB48_59-重-pRC13&7 μ gHB48-59-輕-pKC12分別混合，加入到15mL opti-MEM中，然后室溫靜置90分鐘。90分鐘后，將含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基與含有HB48-33-重-pRC13&HB48-33-輕-pKC12、HB48-35-重-pRC13&HB48-35-輕-pKC12 和 HB48-59-重-pRC13&HB48_59-輕-pKC12 的培養(yǎng)基分別混合，室溫孵育15分鐘。反應(yīng)過(guò)程中，將培養(yǎng)基從細(xì)胞中移除，將細(xì)胞用PBS沖洗三次用于轉(zhuǎn)染。將反應(yīng)混合物加入至洗過(guò)的細(xì)胞中并孵育6小時(shí)。6小時(shí)后，移除反應(yīng)混合物，加入a-MEM培養(yǎng)基并孵育48小時(shí)。然后用胰蛋白酶(trypsin)(生命科技公司，美國(guó))處理該細(xì)胞以脫離燒瓶，用a-MEM培養(yǎng)基稀釋并在96-孔板(NUNC，丹麥)進(jìn)行次培養(yǎng)。此時(shí)，a -MEM培養(yǎng)基不含核糖核苷和脫氧核糖核苷，但包含10%透析的FBS (生命科技公司，美國(guó))和550 μ g/mL G418 (Sigma,美國(guó))。每?jī)商煊眯迈r培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基。收集培養(yǎng)物上清液形成的菌落進(jìn)行ELISA分析，將篩選的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至12孔板。當(dāng)細(xì)胞在12孔板長(zhǎng)好后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板,當(dāng)細(xì)胞在6孔板也長(zhǎng)好后,用甲氨蝶呤(MTX, ChoongwaePharma Corporation,韓國(guó))處理細(xì)胞。MTX的初始濃度為20nM，然后依據(jù)細(xì)胞的適應(yīng)能力增加到80nM，320nM和I μ Μ。篩選出在I μ M的濃度存活的并具有大量抗體分泌物的細(xì)胞系。篩選的細(xì)胞系用轉(zhuǎn)瓶和無(wú)血清培養(yǎng)基在孵育箱中，以65rpm、5%C02和37°C大量培養(yǎng)。在裝有IOOmL無(wú)血清培養(yǎng)基的250mL燒瓶中培養(yǎng)IO8細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量變成初始接種的兩倍，以1，OOOrpm離心5分鐘收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞再在裝有200mL培養(yǎng)基的500mL燒瓶中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量變成初始接種的兩倍，以1，OOOrpm離心5分鐘收集細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到裝有IL培養(yǎng)基的3L轉(zhuǎn)瓶中。向其中加入丁酸鈉(Aldrich，美國(guó))直至終濃度為2mM，將細(xì)胞培養(yǎng)5天,從培養(yǎng)基中收集上清液。從轉(zhuǎn)瓶收集的上清液中采用蛋白A-瓊脂糖柱(proteinA-agarose column) (Amersham Pharmacia Biotech,美國(guó))純化抗體并用 SDS-PAGE 分析。
如圖9所示,觀測(cè)到約50kDa的重鏈帶和25kDa的輕鏈帶,顯示抗體已正確合成。實(shí)施例9 :抗體親和力的測(cè)暈采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法(Kim 等，Hybridoma, 20，265-272，2001)測(cè)定實(shí)施例 8 得到的抗體對(duì)HBV表面抗原的親和力，結(jié)果如圖10所示，簡(jiǎn)要過(guò)程如下
(I)抗體最佳濃度的確定A.板的準(zhǔn)備將以PBS稀釋的100 μ L 2 μ g/mL HBV表面抗原(株式會(huì)社綠十字(Green crossCorp.),韓國(guó))加入酶標(biāo)板(ELISA plate)的各孔并在4°C孵育過(guò)夜。板上的各孔均用PBST沖洗一次，向各孔中均加入300 μ L P/oBSA-PBS溶液，并在室溫孵育I小時(shí)。B.第一次反應(yīng)向板上的每個(gè)孔中加入100 μ L各純化的抗體(O. 5 μ g/mL)，在室溫孵育2小時(shí)，并用PBST沖洗四次。C.第二次反應(yīng)將在1%BSA-PBS中以1:5000稀釋的100 μ L羊抗人IgG(Fab特異的)-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物(perxoidase conjugate) (Sigma)加入各孔,在室溫孵育I小時(shí)，并用PBST沖洗四次。D.底物反應(yīng)將100 μ L TMB (3，3，，5，5，_四甲基聯(lián)苯胺，微孔過(guò)氧化物底物系統(tǒng)(Microwellperoxidase substrate system) (KPL, MD,美國(guó))加入到各孔中并在 405nm 處檢測(cè) 0. D.值。產(chǎn)生半最大結(jié)合值時(shí)的抗體濃度確定為最佳抗體濃度。(2)競(jìng)爭(zhēng)性 ELISAA.板的準(zhǔn)備將以PBS稀釋的100 μ L 2 μ g/mL HBV表面抗原(株式會(huì)社綠十字，韓國(guó))加入到酶標(biāo)板的各孔中并在4°C孵育過(guò)夜。每個(gè)孔均用PBST沖洗一次，向每個(gè)孔中均加入300 μ LP/oBSA-PBS溶液，并在室溫孵育I小時(shí)。B.第一次反應(yīng)將2 μ g HBV表面抗原連續(xù)經(jīng)兩倍稀釋，10 μ L該稀釋的HBsAg加入到板的各孔中。然后，將90yL稀釋至上述⑴中確定的最佳濃度的抗體加入到各孔中，在室溫孵育2小時(shí)，并用PBST沖洗四次。C.第二次反應(yīng)將在1%BSA-PBS中以1:5000稀釋的100 μ L羊抗人IgG(Fab特異的)-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物(Sigma)加入到各孔中，在室溫孵育I小時(shí)，并用PBST沖洗四次。D.底物反應(yīng)將100 μ L TMB (3，3，，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺，微孔過(guò)氧化物底物系統(tǒng)(KPL, MD,美國(guó))加入到各孔中并在405nm處檢測(cè)0. D.值。將抑制50%最大結(jié)合值(沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)EGFR存在的0. D.值)的HBsAg濃度確定為Kd。如圖10所示，在本發(fā)明的人抗體中，HB48-35的親和力最高，而HB48-59和HB48-33的親和力分別比HB48-35的低約I. 3倍和4倍。實(shí)施例10 :采用急件乙型肝炎小鼠樽型的體內(nèi)效力試驗(yàn)
在C57BL6小鼠模型中比較ΗΒ48_33、ΗΒ48_35和ΗΒ48-59對(duì)HBsAg的中和能力，該小鼠模型通過(guò)高壓水注射HBV DNA來(lái)表現(xiàn)乙型肝炎樣癥狀。20只四周齡、體重約20克的雌性C57BL6小鼠購(gòu)自查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(CharlesLiver Laboratory) (MA,美國(guó))，如表I所示,分成四組,每組5只。〈表1>
權(quán)利要求
1.一種特異性結(jié)合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的人抗體，包括 a)具有SEQID NO: I所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)； b)具有SEQID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的輕鏈可變區(qū)； c)重鏈恒定區(qū)；以及 d)輕鏈恒定區(qū)。
2.一種編碼具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)的DNA。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA，其中所述DNA包括具有SEQID NO: 5所示核苷酸序列的多聚核苷酸。
4.一種編碼具有SEQ ID N0:2、3和4所示氨基酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的抗體輕鏈可變區(qū)的DNA。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA，其中所述DNA包括具有SEQID NO:6、7和8所示核苷酸序列中任何一個(gè)或多個(gè)的多聚核苷酸。
6.一種用于表達(dá)特異性結(jié)合HBV表面抗原的抗體的重鏈可變區(qū)的表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求2所述的DNA。
7.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其中所述載體為HB48-33-重-pRC13、HB48-35-重-pRC13 或 HB48-59-重-pRC13，其圖譜如圖 5 所示。
8.一種用于表達(dá)特異性結(jié)合HBV表面抗原的抗體的輕鏈可變區(qū)的表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求4所述的DNA。
9.如權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中所述載體為圖譜如圖6所示的HB48-33-輕-pKC13、圖譜如圖7所示的HB48-35-輕-pKC13或圖譜如圖8所示的HB48-59-輕-pKC13。
10.一種用權(quán)利要求6所述表達(dá)載體和權(quán)利要求8所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞系。
11.如權(quán)利要求10所述的動(dòng)物細(xì)胞系，其中所述動(dòng)物細(xì)胞系為CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)、HEK 293或NSO細(xì)胞系。
12.一種預(yù)防或治療乙型肝炎的藥物組合物，其包括權(quán)利要求I所述的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供特異性結(jié)合HBV表面抗原(HBsAg)的抗體，其可有效預(yù)防和治療乙型肝炎。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102906111SQ201080059324
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2010年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者金世鎬, 張基奐, 洪廣元, 辛庸源, 金敏洙, 李海元, 柳憬桓, 徐東赫, 金振晚, 辛龍男, 具善美, 林正愛(ài), 李美禎, 李妍京, 徐美先 申請(qǐng)人:株式會(huì)社綠十字