專利名稱：一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒藥物領(lǐng)域，具體涉及一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是嚴(yán)重危害國(guó)民身體健康的疾病之一。目前，對(duì)于乙型肝炎病毒(HBV)感染疾病的西藥主要是拉米夫定等核苷藥物及干擾素等生物類藥物，這些藥物都存在副作用大、容易產(chǎn)生耐藥性和治療后反跳等缺點(diǎn)。
葉下珠Phyllanthus urinaria L.為大戟科Euphorbiaceae葉下珠屬phyllanthus的全草，最早收載于《生草藥性備要》中，具有平肝清熱、利水解毒之效，用于治療腸炎、痢疾、尿路感染、無名腫痛等。葉下珠屬植物在全世界約有600多個(gè)品種，我國(guó)有6亞屬、7組、33種、4變種，葉下珠屬植物可為草本、灌木或喬木，廣泛分布于熱帶、亞熱帶與溫帶。印度學(xué)者Thyagarajan報(bào)告用苦味葉下珠(Phyllanthus amarus)治療乙肝病毒攜帶者，可使59％患者的乙肝表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)陰；王榮國(guó)(葉下珠抗乙肝病毒研究概況，中醫(yī)藥研究，2001，17(1)58-60)也做了葉下珠抗乙肝病毒相關(guān)方面的研究，證明其有抑制乙肝病毒復(fù)制的功效；羅德輝等(葉下珠治療慢性乙肝研究進(jìn)展，新疆中醫(yī)藥，2004，22(2)58-60)描述了葉下珠治療慢性乙肝方面所取得的進(jìn)展；國(guó)知局2002年8月14日公開了一項(xiàng)發(fā)明專利申請(qǐng)“利用葉下珠治療慢性炎性和纖維化過程”(公告號(hào)為CN1364085)公開了一種葉下珠提取物，該提取物具有預(yù)防和治療肝臟纖維化和維持還原性谷胱甘肽水平的作用；國(guó)知局1999年10月11日公開了一項(xiàng)“包含烏蘇里葉下珠和/或葉下珠之提取物的用于治療乙型肝炎的藥物組合物”(申請(qǐng)?zhí)朇N1234741)，該組合物具有治療乙型肝炎的作用。
苦味葉下珠經(jīng)臨床應(yīng)用研究結(jié)果顯示，其具有抑制乙肝病毒復(fù)制、改善肝功能和抗肝纖維化等療效。葉下珠對(duì)HBeAg陰轉(zhuǎn)率較高，但對(duì)HBsAg陰轉(zhuǎn)率不高。從臨床應(yīng)用情況看，肝康對(duì)慢性乙肝HBeAg、HBV-DNA陽(yáng)性的患者，具有促?gòu)?fù)制指標(biāo)陰轉(zhuǎn)的作用，能反映出其抗病毒效果，而對(duì)HBsAg陰轉(zhuǎn)率不高。
海鞘(Ascidia)是尾索動(dòng)物亞門(Uronordata)綱的尾索動(dòng)物，第一軍醫(yī)大學(xué)胡文軍碩士畢業(yè)論文“皺瘤海鞘抗乙肝病毒有效成分的研究”公開了兩種從皺瘤海鞘中分離出來的多肽具有抗乙肝病毒活性，這兩種多肽的氨基酸序列分別為L(zhǎng)ys-Gly-Lys-Ile-Glu-His和Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala，這兩種海鞘多肽對(duì)HBsAg陰轉(zhuǎn)率較高，但對(duì)HBeAg作用效果較弱，且保肝降酶等作用有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的抗乙肝病毒的藥物組合物。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物，該組合物由下述重量配比的組分組成海鞘多肽 0.001～0.01份葉下珠醇提物 5～8份其中，海鞘多肽的氨基酸序列為Ser Ser Leu Ser Lys Ala Ala(SEQ NO.1)，式中Ser是絲氨酸，Leu是亮氨酸，Lys是賴氨酸，Ala是丙氨酸。
本發(fā)明所述的葉下珠是Common Leafflower Herb Herba Phyllanthi Urinariae。
本發(fā)明所述的藥物組合物的制備方法是按配比將葉下珠醇提物和海鞘多肽混合即可。
所述的葉下珠醇提物的制備方法為公知的滲漉法(姜計(jì)劃，孫琦，高秀英.葉下珠提取工藝探討.中成藥.1999，211-2)，具體為將葉下珠打成粗粉，按滲漉法用55％乙醇提取滲漉液為藥材的6-8倍量，過濾，減壓回收乙醇并濃縮為1∶1，得葉下珠醇提物。
本發(fā)明所述的海鞘多肽的制備方法見國(guó)知局2006年7月19日公開的發(fā)明專利申請(qǐng)“一種海鞘多肽及其制備方法”(公開號(hào)為CN1803831)，具體為首先用與海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，將浸膏用2～3倍體積的水溶解，然后用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取，取水層，最后使用色譜法分離提純，取薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.2～0.3的洗脫液。其中，所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、環(huán)己烷其中一種或兩種以上；所述的色譜法為大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、SephadexLH-20色譜法其中一種或兩種以上，本發(fā)明所述色譜法最好是依次使用大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH-20色譜法；所述的薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
本發(fā)明所述的藥物組合物可以用于制備治療乙型肝炎的制劑，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)不同劑型的要求添加較味劑和賦型劑等輔料，制備成各種劑型，最好是口服液。
利用本發(fā)明所述的藥物組合制備的抗乙型肝炎病毒口服液，含有以下重量配比的組分海鞘多肽0.001～0.01份、葉下珠醇提物5～8份、防腐劑2～3份、甜味劑適量、水800～1000份。
上述組分中，甜味劑可以是甜蜜素或/和蔗糖，防腐劑可以是苯甲酸或/和尼泊金乙酯。
本發(fā)明所述的抗乙型肝炎病毒口服液，該口服液中還含有薄荷20～50份。
本發(fā)明抗乙型肝炎藥物組合物具有較高的抗乙肝病毒活性，其中所述的葉下珠醇提物具有抑制乙肝病毒復(fù)制、改善肝功能和抗肝纖維化等療效，對(duì)HBeAg陰轉(zhuǎn)率較高，但對(duì)HBsAg陰轉(zhuǎn)率不高；海鞘多肽具有抑制乙肝病毒復(fù)制，對(duì)HBsAg陰轉(zhuǎn)率都較高，但對(duì)HBeAg作用效果較弱；二者配伍后，對(duì)抑制HBeAg、HBsAg的分泌和乙肝病毒DNA的復(fù)制的藥理活性都有所提高，同時(shí)，還有抗癌、抗菌、抗纖溶和保肝降酶等作用。本發(fā)明藥物組合物可用于制備治療乙型肝炎的藥物。
下面將通過實(shí)驗(yàn)來說明本發(fā)明具有的效果。
下述實(shí)驗(yàn)中的海鞘多肽的氨基酸序列均為Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala(SEQ NO.1)1.體外血清學(xué)實(shí)驗(yàn)供試液A的制備取海鞘多肽(廣東大亞灣皺瘤海鞘)10mg，加生理鹽水至1000mL，配成濃度為10μg·mL-1的供試液。
供試液B的制備取葉下珠醇提物(陜西省苦味葉下珠)5g，加生理鹽水至1000mL，配成濃度為5mg·mL-1的供試液。
供試液C的制備取海鞘多肽10mg與葉下珠醇提物5g，加生理鹽水至1000mL，配成混合溶液。
取A、B、C供試液分別與備用血清在37℃條件下按體積比1∶2作用8h，然后取其中的小三陽(yáng)血清反應(yīng)液做ELISA測(cè)定HBsAg、取大三陽(yáng)血清反應(yīng)液做ELISA測(cè)定HBeAg，同時(shí)以正常人血清按相同條件與生理鹽水作用的反應(yīng)液為陰性對(duì)照，以生理鹽水為空白對(duì)照。操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行，但孵育時(shí)間延長(zhǎng)至60min。
HBsAg、HBeAg的檢測(cè) 采用ELISA測(cè)定盒進(jìn)行檢測(cè)。抑制率(％)＝[(對(duì)照孔P/N值-實(shí)驗(yàn)孔P/N值)/(對(duì)照孔P/N值-空白孔P/N值)]×100％。
表1供試品對(duì)血清中HBsAg及HBeAg抗原的抑制作用(n＝5，X±S)

各實(shí)驗(yàn)組與相應(yīng)的陰性對(duì)照組比較，P＜0.05。
結(jié)果經(jīng)體外血清學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，將供試液各組與相應(yīng)的陰性對(duì)照組作單項(xiàng)方差分析比較，HBsAg組中P＜0.05、HBeAg組中P＜0.05，表明供試品A、B、C均對(duì)血清中HBsAg及HBeAg抗原有一定的抑制作用；分析表1我們可以得出，抗HBV組合物C對(duì)血清中HBsAg及HBeAg抗原的抑制作用比其單方A、B都要好，從多點(diǎn)位的藥理功能發(fā)揮其較好的藥物協(xié)同作用，彌補(bǔ)了其單方的不足。
2.體外HepG2 2.2.15細(xì)胞抑制乙肝病毒(HBV)抗原分泌試驗(yàn)HepG2 2.2.15細(xì)胞(由南方醫(yī)院感染內(nèi)科贈(zèng))是將含有HBV基因組(2個(gè)HBV頭對(duì)尾二聚體，以尾對(duì)尾方向串聯(lián))的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，得到的克隆能HBsAg、HBeAg及Dane顆粒，可檢測(cè)到細(xì)胞DNA和RNA，但無cccDNA。
供試液A的制備取海鞘多肽(廣東大亞灣皺瘤海鞘)1mg，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1000mL，配成濃度為1μg·mL-1的供試液。
供試液B的制備取葉下珠醇提物(陜西省苦味葉下珠)0.5g，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1000mL，配成濃度為0.5mg·mL-1的供試液。
供試液C的制備取海鞘多肽1mg與葉下珠醇提物0.5g，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1000mL，配成混合溶液。
將2.2.15細(xì)胞接種至25cm培養(yǎng)瓶中，每瓶加入DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，10000u/ml青鏈霉素，200μg/ml G418)5ml，置37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱中，每隔3～4天傳代。
用0.25％胰蛋白酶將2.2.15細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，按3×104細(xì)胞/孔分種于96孔板，2天后換用含藥培養(yǎng)液，每個(gè)濃度加4孔。供試液A、B、C分別與細(xì)胞作用12天后，吸取細(xì)胞上清液，用ELISA法測(cè)定HBsAg、HBeAg滴度。實(shí)驗(yàn)以未加任何藥物的細(xì)胞作為細(xì)胞對(duì)照組。將藥物組試驗(yàn)數(shù)據(jù)與細(xì)胞對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照，考察其差異。
ELISA法測(cè)HBsAg、HBeAg每孔加入待測(cè)標(biāo)本50μl，設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照各2孔，并設(shè)空白對(duì)照1孔。每孔加入酶結(jié)合物50μl(除空白對(duì)照外)，充分混勻后封板，置37℃孵育半小時(shí)。手工洗板棄去孔內(nèi)液體，洗滌液儲(chǔ)滿各孔，靜置5秒后甩干，重復(fù)5次后拍干。每孔依次加入顯色劑A液、B液各50μl，充分混勻，封板，置37℃孵育15分鐘；每孔加入終止液50μl，混勻；用酶標(biāo)儀測(cè)定。取波長(zhǎng)450nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值，陰性對(duì)照OD值低于0.05作為0.05計(jì)算，高于0.05按照實(shí)際OD計(jì)算。

表2供試品對(duì)2.2.15細(xì)胞HBsAg及HBeAg抗原的抑制率(n＝5，X±S)

各組與相應(yīng)的陰性對(duì)照組比較，P＜0.05。
結(jié)果經(jīng)體外2.2.15細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，將供試品各組與相應(yīng)的陰性對(duì)照組作單項(xiàng)方差分析比較，HBsAg組中P＜0.05、HBeAg組中P＜0.05，表明供試品A、B、C均對(duì)2.2.15細(xì)胞中HBsAg及HBeAg抗原有一定的抑制作用；分析表2我們可以得出，抗HBV組合物C對(duì)2.2.15細(xì)胞中HBsAg及HBeAg抗原的抑制率比其單方A、B都要高，從多點(diǎn)位的藥理功能發(fā)揮其較好的藥物協(xié)同作用，彌補(bǔ)了其單方的不足。
3.HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型利用廣州空軍醫(yī)院成功培育出的適合HBV研究應(yīng)用的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)分組及用藥取6周齡HBV轉(zhuǎn)基因小鼠32只，雌雄不限，隨機(jī)分為4組，每組8只，每只均單獨(dú)籠養(yǎng)。①空白對(duì)照組以普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)；②A海鞘多肽劑量組劑量為5mg·kg-1·d-1；③B葉下珠醇提物劑量組劑量為300mg·kg-1·d-1；④C本發(fā)明所述的組合物(制備例1所述的組合物)劑量組劑量為50mg·kg-1·d-1。
檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間為12周，分別于用藥前，用藥4周、8周、12周用熒光PCR檢測(cè)血清HBV DNA含量，并進(jìn)行療效評(píng)估。結(jié)果見表3。
表3用藥前后血清HBV DNA滴度變化情況(n＝8，X±S)

同一組處理前后比較(即與T0比較)，bP＜0.05，cP＜0.01；各治療組與對(duì)照組比較，fP＜0.01。
結(jié)果經(jīng)體內(nèi)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)各組經(jīng)治療后均呈現(xiàn)出了血清HBV DNA滴度降低的現(xiàn)象，重復(fù)測(cè)定方差分析顯示，A組經(jīng)治療后，從給藥第4周到第12周，其血清HBV DNA滴度與給藥前相比出現(xiàn)了顯著下降；B組經(jīng)治療后，從給藥第8周到第12周，其血清HBV DNA滴度與給藥前相比出現(xiàn)了顯著下降；C組經(jīng)治療后，從給藥第4周到第12周，其血清HBV DNA滴度與給藥前相比出現(xiàn)了顯著下降。分析表3-1可得出C組比其單方A、B組血清HBV DNA滴度下降更為明顯，從多點(diǎn)位的藥理功能發(fā)揮其較好的藥物協(xié)同作用，彌補(bǔ)了其單方的不足。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的海鞘多肽的氨基酸序列均為Ser-Ser-Leu-Ser-Lys-Ala-Ala。
制備例例1處方海鞘多肽1mg，葉下珠醇提物8g。
制備方法(1)將葉下珠打成粗粉，按滲漉法用55％乙醇提取滲漉液為藥材的8倍量，過濾，減壓回收乙醇并濃縮為1∶1，得葉下珠醇提物。
(2)用與海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，將浸膏用2倍體積的水溶解，然后用與水等體積的乙酸乙酯萃取，取水層，最后使用大孔樹脂色譜法分離提純，取薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，揮盡溶劑，得海鞘多肽。所述的薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
(3)取海鞘多肽1mg，葉下珠醇提物8g混合，即可。
例2處方海鞘多肽3mg，葉下珠醇提物7g。
(1)將葉下珠打成粗粉，按滲漉法用55％乙醇提取滲漉液為藥材的7倍量，過濾，減壓回收乙醇并濃縮為1∶1，得葉下珠醇提物。
(2)用與海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，將浸膏用3倍體積的水溶解，然后用與水等體積的氯仿萃取，取水層，最后使用硅膠色譜法分離提純，取薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，揮盡溶劑，得海鞘多肽。所述的薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
(3)取海鞘多肽3mg，葉下珠醇提物7g混合，即可。
例3
處方海鞘多肽6mg，葉下珠醇提物7g。
制備方法(1)將葉下珠打成粗粉，按滲漉法用55％乙醇提取滲漉液為藥材的6倍量，過濾，減壓回收乙醇并濃縮為1∶1，得葉下珠醇提物。
(2)用與海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，將浸膏用3倍體積的水溶解，然后用與水等體積的正丁醇萃取，取水層，最后依次使用硅膠色譜法和SephadexLH-20色譜法分離提純，取薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，揮盡溶劑，得海鞘多肽。所述的薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
(3)取海鞘多肽6mg和葉下珠醇提物7g混和即可。
例4處方海鞘多肽10mg，葉下珠醇提物5g。
制備方法(1)將葉下珠打成粗粉，按滲漉法用55％乙醇提取滲漉液為藥材的8倍量，過濾，減壓回收乙醇并濃縮為1∶1，得葉下珠醇提物。
(2)用與海鞘等重量95％乙醇浸泡海鞘2周，回收乙醇得到浸膏，將浸膏用3倍體積的水溶解，然后用與水等體積的正己烷萃取，取水層，最后依次使用依次使用大孔樹脂色譜法、硅膠色譜法、Sephadex LH-20色譜法分離提純，取薄層色譜紫外光檢識(shí)Rf為0.5～0.6的洗脫液，揮盡溶劑，得海鞘多肽。所述的薄層色譜條件展開劑是正丁醇∶水∶醋酸為4∶5∶1；顯色劑是5％硫酸乙醇液。
(3)取海鞘多肽10mg和葉下珠醇提物5g混和即可。
應(yīng)用例例5抗乙型肝炎病毒口服液海鞘多肽10mg，葉下珠醇提物8g，甜蜜素1g，蔗糖60g，薄荷40g，尼泊金乙酯0.5g，苯甲酸鈉2g，水加至1000g。
制備方法取制備例1所述的組合物加蒸餾水溶解，再加入尼泊金乙酯、苯甲酸鈉溶液，最后加入甜蜜素、蔗糖、薄荷攪拌使溶解，再加蒸餾水至全量，灌裝，滅菌即得。
例6抗乙型肝炎病毒口服液海鞘多肽7mg，葉下珠醇提物6g，蔗糖70g，尼泊金乙酯1g，水加至1000g。
制備方法取制備例2所述的組合物加蒸餾水溶解，再加入尼泊金乙酯攪拌溶解，最后加入蔗糖攪拌使溶解，再加蒸餾水至全量，灌裝，滅菌即得。
例7抗乙型肝炎病毒口服液海鞘多肽5mg，葉下珠醇提物5g，甜蜜素1.5g，薄荷30g，苯甲酸鈉2.5g水加至1000g。
制備方法取制備例3所述的組合物加蒸餾水溶解，再加入苯甲酸鈉溶液，最后加入甜蜜素、薄荷攪拌使溶解，再加蒸餾水至全量，灌裝，滅菌即得。
例8抗乙型肝炎病毒口服液海鞘多肽1mg，葉下珠醇提物5g，甜蜜素1.2g，蔗糖90g，薄荷25g，尼泊金乙酯1g，水加至1000g。
制備方法取制備例4所述的組合物加蒸餾水溶解，再加入尼泊金乙酯，最后加入甜蜜素、蔗糖、薄荷攪拌使溶解，再加蒸餾水至全量，灌裝，滅菌即得。
SEQUENCE LISTING<110>南方醫(yī)科大學(xué)<120>一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物及其制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>7<212>PRT<213>Ascidia<400>1Ser Ser Leu Ser Lys Ala Ala1 權(quán)利要求
1.一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物，該組合物由下述重量配比的組分組成海鞘多肽0.001～0.01份葉下珠醇提物5～8份其中，所述的海鞘多肽的氨基酸序列為Ser Ser Leu Ser Lys Ala Ala(SEQ NO.1)，式中Ser是絲氨酸，Leu是亮氨酸，Lys是賴氨酸，Ala是丙氨酸。
2.權(quán)利要求1所述的抗乙型肝炎病毒藥物組合物在制備治療乙型肝炎藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述的藥物是含有以下重量配比的組分的抗乙型肝炎病毒口服液海鞘多肽0.001～0.01份、葉下珠醇提物5～8份、防腐劑2～3份、甜味劑適量、水800～1000份。上述組分中，甜味劑是甜蜜素或/和蔗糖，防腐劑是苯甲酸或/和尼泊金乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗乙型肝炎病毒口服液，該口服液中還含有薄荷20～50份。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗乙型肝炎病毒的藥物組合物，該組合物由0.001～0.01重量份的海鞘多肽Ser－Ser－Leu－Ser－Lys－Ala－Ala和5～8重量份葉下珠醇提物混合而成，具有較高的抗乙肝病毒活性，可用于制備治療乙型肝炎的藥物。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101041061SQ20071002778
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者萬(wàn)新祥, 曾凡林 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)