專利名稱：乙型肝炎病毒基因工程e抗原在枯草桿菌中的表達(dá)的制作方法
一種乙型肝炎病毒基因工程e抗原的克隆、表達(dá)。所屬技術(shù)領(lǐng)域?yàn)樯锘蚬こ獭?br> 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，簡稱HBV)是世界性傳染性肝炎的病源體，流行極廣。據(jù)報(bào)導(dǎo)，全世界有2億乙肝病毒攜帶者，中國占1.1億，僅中國乙肝患者達(dá)4千萬。HBV主要通過血液傳播，還能通過胎盤屏障由帶毒孕婦傳染給胎兒，對人們的健康危害極大。
國外從1978年，我國從1983年開始進(jìn)行HBV基因工程研究，研究單位和人員遍布全世界。乙型肝炎病毒的基因組脫氧脫糖核酸(DNA)有s、c和p三個(gè)基因，HBV能產(chǎn)生s、c和e三種抗原。有關(guān)乙型肝炎的s基因和c基因克隆、表達(dá)的文獻(xiàn)資料浩如煙海，表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌，酵母和動(dòng)物細(xì)胞三種，有關(guān)e抗原和c抗原的報(bào)導(dǎo)極少，獲得e抗原的途徑一部分是從患者采血，另一途徑是將大腸桿菌表達(dá)的基因工程c抗原用化學(xué)處理方法轉(zhuǎn)化(王光榮等，《生物化學(xué)》2，(3)，1986);鄔光惠等，《生物工程學(xué)報(bào)》6(3)199-204，1990)報(bào)導(dǎo)，用鳥槍法克隆了e基因并在大腸桿菌中表達(dá)了e抗原。根據(jù)美國對話信息服務(wù)公司(DIALOG INFORMATION SERVICES，INC.)資料檢索，截止1992年7月1日，有關(guān)HBe基因克隆表達(dá)的文獻(xiàn)有3篇，即Loparev V.N.et al.[Mol.Gen.Microbiol Virusol Sep(9)3-6，1991，(USSR)]報(bào)導(dǎo)了乙肝HBe抗原以痘苗病毒重組株在真核細(xì)胞中表達(dá)HBe基因;Inada T et al(Virus Res Sep，14(1)27-47，1989)報(bào)導(dǎo)了HBe抗原在大腸桿菌中的表達(dá);Raney A.K.et al，(Virology Jan，168(1)31-39，1989)報(bào)導(dǎo)了HBe抗原在人體外表層纖維細(xì)胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞中的表達(dá)及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。
綜上所述，已報(bào)導(dǎo)的工作很局限在大腸桿菌和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)未能將HBe抗原分泌到細(xì)胞外，須破碎細(xì)胞后才能提取e抗原，由于破碎細(xì)胞后伴隨有細(xì)胞碎片殘存，給純化帶來困難。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)需加小牛血清，血清中的免疫球蛋白(IgG)與表達(dá)的e抗原結(jié)合給分離提純帶來了較大困難。
診斷乙肝多采用所謂兩對半試劑盒，即檢測s抗原和抗體、e抗原和抗體、c抗體五項(xiàng)指標(biāo)，檢查出s抗原陽性不一定是乙肝患者，而e抗原和抗體陽性則是HBV急性感染的早期指標(biāo)。因?yàn)閑抗原的存在表明了HBV中DNA聚合酶的活性即HBV中的DNA的完整存在，這是乙肝具有高度傳染性的標(biāo)志。因此，e抗原具有重大的臨床價(jià)值。由于e基因與c基因是一對重疊基因，位于c基因的+81～+450堿基對(簡稱bp)之間，克隆e基因十分困難。目前國內(nèi)所有的e抗原基因工程產(chǎn)品均與c抗原有交叉反應(yīng)，檢測時(shí)有假陽性出現(xiàn)。
本發(fā)明的目的是直截克隆e基因片段，利用分泌型的枯草桿菌受體菌株表達(dá)e抗原，使e抗原分泌到細(xì)胞外，與c抗原無交叉反應(yīng)，便于提取，從而得到高純的e抗原產(chǎn)品。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為1.表達(dá)載體的構(gòu)建枯草桿菌質(zhì)粒PNQ122(南開大學(xué)蔣如璋教授贈(zèng)送)缺乏強(qiáng)啟動(dòng)子，發(fā)明者以BamHI和HindⅢ消化這個(gè)質(zhì)粒，去掉一個(gè)300bp片段。另外，大腸桿菌表達(dá)載體PDR540有一個(gè)由色氨酸啟動(dòng)子(trp)和乳糖啟動(dòng)子(Lac)組成的雜合強(qiáng)啟動(dòng)子tac，其下端有一個(gè)BamHI位點(diǎn)，在5’端的質(zhì)粒部分具有HindⅢ位點(diǎn)。一旦消化后就可得到含有tac啟動(dòng)子的200bp BamHI、HindⅢ片段。由于它和PNQ122的大片段有相同粘性末端，很容易連接起來并能定向。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草桿菌Asl176原生質(zhì)體，在DM3平板上再生菌落，用卡那霉素平板篩選重組子，構(gòu)建成表達(dá)載體PNQ122-tac。
2.HBVe基因的克隆根據(jù)某些資料(Okamoto et al.，1986;Shafritz 1987)，HBVe基因編碼序列長369bp，產(chǎn)生123個(gè)氨基酸，分子量為15KD的e抗原，位于c基因的+81～+450bp之間。e基因沒有自己的啟動(dòng)子，但有ATG，兩側(cè)正好有兩個(gè)Bg1Ⅱ位點(diǎn)。故此，用Bg1Ⅱ消化HBV中的DNA，得到～2.8Kb和0.44Kb兩個(gè)片段，電洗脫，超速離心回收，與用BamHI消化的PNQ122-tac連接，使e基因處于tac的控制之下。用上面的方法轉(zhuǎn)化枯草桿菌，在卡那霉素平板上得到大量轉(zhuǎn)化子。
3.HBVe基因在杜草桿菌中的表達(dá)挑選雜交信號最強(qiáng)的重組子，于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)20小時(shí)，7，500rpm離心15分鐘去細(xì)胞，10000rpm離心20分鐘去細(xì)胞碎片。收集上清液，Elisa檢測e抗原為陽性，與c抗原無交叉反應(yīng)。
本發(fā)明具有直接克隆HBVe基因片段，用枯草桿菌作HBVe抗原表達(dá)系統(tǒng)和抗原能分泌至細(xì)胞外與c抗原無交叉反應(yīng)幾大特點(diǎn)，具有重大理論意義和實(shí)用價(jià)值。有了以上特點(diǎn)，在分離純化e抗原時(shí)，不需破碎細(xì)胞，從而簡化了提純程序。采用本發(fā)明可制成高純度的HBe抗原產(chǎn)品，適用于科學(xué)研究及臨床檢驗(yàn)，應(yīng)用前景十分廣闊。
實(shí)施例LB液體培養(yǎng)基100毫升，裝入250毫升三角瓶，塞上棉塞，滅菌消毒，無菌操作接一環(huán)重組子斜面菌種，置37℃搖床培養(yǎng)20小時(shí)，7500rpm離心15分鐘，取上清液于10000rpm離心20分鐘，收集上清液。采用市售乙肝診斷試劑盒(HBe、HBc抗體試盒)檢測，反應(yīng)后用DG-3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀檢測，與HBe抗體反應(yīng)測得結(jié)果為OD值為0.93，N為0.1，P/N值為9.3;用HBc抗體檢測，OD值為0.12，N為0.1，P/N值為1.2。(P/N值＞2.1為陽性，P/N，＜2.1為陰性)。
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒基因工程e抗原在枯草桿菌中的表達(dá)，其特征是將HBVe抗原在枯草桿菌中表達(dá)，直接克隆HBVe基因片段，用枯草桿菌作HBVe抗原表達(dá)系統(tǒng)，HBVe抗原能分泌到細(xì)胞外，經(jīng)離心去細(xì)胞及細(xì)胞碎片后，可以直接作為乙肝診斷試劑盒的檢測制劑；
2.按權(quán)利要求1所述的HBVe抗原表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于能表達(dá)乙型肝炎基因工程e抗原的是枯草桿菌基因工程菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了乙型肝炎病素e抗原在枯草桿菌中表達(dá)的研究全過程，包括表達(dá)載體的構(gòu)建，HBVe基因的克隆及HBVe基因在枯草桿菌中的表達(dá)。其優(yōu)點(diǎn)是，單獨(dú)克隆HBVe基因片段，用枯草桿菌作HBVe抗原表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的e抗原能分泌到細(xì)胞外，與c抗原無交叉反應(yīng)，可以直接作為乙肝診斷試劑藥盒的原料及經(jīng)純化后作為科學(xué)研究的生物試劑。
文檔編號C12N15/75GK1108695SQ9310154
公開日1995年9月20日 申請日期1993年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1993年2月12日
發(fā)明者譚業(yè)平, 齊義鵬, 黃永秀, 尹亦農(nóng) 申請人:武漢大學(xué)