專(zhuān)利名稱(chēng)：具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移特征的成對(duì)蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白，蛋白A是作為能量供體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的抗原，蛋白B是作為能量受體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結(jié)合的共同抗原決定簇，由蛋白A、B和適當(dāng)?shù)木彌_液組成的均相免疫檢測(cè)藥盒，及它們用于檢測(cè)標(biāo)本中抗體存在的用途，尤其在艾滋病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)方面的用途。
免疫測(cè)定利用抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中的微量物質(zhì)，基于抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性，免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍遍及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域，由于它在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位日益重要，近年來(lái)新方法、新技術(shù)不斷出現(xiàn)，從總體上說(shuō)，其進(jìn)展主要在自動(dòng)化和簡(jiǎn)便化兩個(gè)方面。目前基因工程、細(xì)胞工程和酶工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的重組抗原、單克隆抗體及酶技術(shù)已逐步取代原有免疫診斷試劑，為各種疾病的診斷增加了新型的有效試劑盒。在現(xiàn)有的免疫檢測(cè)方法中，固相免疫法以放射免疫檢測(cè)法(RIA)和酶免疫檢測(cè)法(EIA)的應(yīng)用最為廣泛，通常包括包被(抗原或抗體)、封閉、多次孵育和洗滌以及檢測(cè)等過(guò)程，最快的也需2小時(shí)以上。而液相法的免疫反應(yīng)和信號(hào)測(cè)定在溶液中一步完成，沒(méi)有固相的參與，因此反應(yīng)速度比固相法快得多，操作程序也簡(jiǎn)單得多，其中均相熒光免疫測(cè)定(Homogeneous Fluoroimmunoassay，hFIA)應(yīng)用最為廣泛，但目前多只限于小分子藥物的測(cè)定，這主要是由于自然標(biāo)本通常存在較廣泛、復(fù)雜的熒光背景以及化學(xué)標(biāo)記技術(shù)的不成熟導(dǎo)致的。Ulman等人首先提出基于熒光共振能量傳遞(FRET)的hFIA，即均相熒光共振免疫測(cè)定(Homogeneous Fluorescence resonanceimmunoassay，hFRIA)，實(shí)現(xiàn)了抗原-抗體反應(yīng)的均相測(cè)定。
光譜重疊的兩個(gè)熒光分子之間存在著一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過(guò)程，即一個(gè)受激發(fā)的熒光物質(zhì)(能量供體，energy donor)將其激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移給一個(gè)光吸收分子(能量受體，energy acceptor)的過(guò)程。如果受體的激發(fā)波長(zhǎng)與前者的發(fā)射波長(zhǎng)重疊，那么用供體的激發(fā)光激發(fā)，檢測(cè)到的就會(huì)是受體的發(fā)射光，同時(shí)供體自身的發(fā)射光強(qiáng)度就會(huì)大大減弱。這一過(guò)程與它們之間的距離密切相關(guān)，只有當(dāng)距離足夠近時(shí)才能發(fā)生。
目前均相熒光共振免疫測(cè)定已應(yīng)用于檢測(cè)血清中的抗原。Ueda等[Ueda H，Kubota K，WangY，et al.Biotechniques，27(4)738-742(1999)]用琥珀酰亞胺脂和熒光黃-X分別標(biāo)記抗體的重鏈和輕鏈，兩者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗體的特異結(jié)合，使琥珀酰亞胺脂與熒光黃-X靠近，用490nm波長(zhǎng)激發(fā)琥珀酰亞胺脂，檢測(cè)到520nm發(fā)射光減弱，605nm的發(fā)射光增強(qiáng)，隨著抗原量的增加，605nm的熒光亦增強(qiáng)。Stenroos等[Stenroos K，Hurskainen P，Eriksson S，etal.Cytokine，10(7)495-499(1998)]用銪的螯合物標(biāo)記重組人白介素2(IL-2)、用Cy5標(biāo)記單克隆抗體，進(jìn)行時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定。Blomberg等分別用鋱和羅丹明標(biāo)記抗體，檢測(cè)血清中人絨毛膜促性腺素的βCG，結(jié)果能量轉(zhuǎn)移信號(hào)與樣品中的βCG濃度成正比。
現(xiàn)有的均相熒光共振免疫測(cè)定都必須用有機(jī)合成熒光染料或稀土元素對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行標(biāo)記，將作為能量供受體對(duì)的兩種熒光物質(zhì)分別偶聯(lián)在抗體的不同部位上或不同的抗體分子上，更多的是將它們分別偶聯(lián)在抗原和抗體上，在溶液中，通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合而拉近兩個(gè)熒光分子之間的距離，從而發(fā)生FRET現(xiàn)象。這些方法雖然滿(mǎn)足了快速檢測(cè)的需要，但都要求獲得高純度的抗體和抗原，使檢測(cè)前期工作繁雜，由于無(wú)法達(dá)到百分之百的純度，熒光標(biāo)記時(shí)難免產(chǎn)生非特異標(biāo)記，在檢測(cè)中極易出現(xiàn)假陽(yáng)性，而針對(duì)每種免疫反應(yīng)都提取到抗體是極其困難的。而且到目前為止的診斷試劑對(duì)抗原的純度要求都很高，因而對(duì)生產(chǎn)工藝的要求也相應(yīng)很高。這些不足給它們的實(shí)際推廣應(yīng)用帶來(lái)了許多局限。為改變以上不足，本發(fā)明建立了一類(lèi)新型的均相熒光共振免疫測(cè)定試劑及方法，以使生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，抗體檢測(cè)中假陽(yáng)性的出現(xiàn)減少，檢測(cè)能夠快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行。這一新型的均相熒光共振免疫測(cè)定方法利用了熒光蛋白及發(fā)光蛋白的光學(xué)特性。
目前報(bào)道的熒光蛋白主要有綠色熒光蛋白(GFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、紫外激發(fā)綠色熒光蛋白(GFPuv)等，它們都衍生自來(lái)源于水母的綠色熒光蛋白。綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)是一個(gè)非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，全長(zhǎng)238肽，分子量約為27kDa，第65-67位的三個(gè)氨基酸能夠形成一種獨(dú)特的絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸(Ser65-dehydroTyr66-Gly67)環(huán)化結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)使得GFP具有較強(qiáng)的熒光性。GFP熒光結(jié)構(gòu)的形成是一個(gè)自催化的過(guò)程，僅由其一級(jí)結(jié)構(gòu)決定，而無(wú)需特殊的酶或輔助因子參與，因此可以進(jìn)行多種異源表達(dá)。GFP的N端和C端都可以與其他蛋白進(jìn)行嵌合表達(dá)而保留其熒光活性，與GFP融合表達(dá)對(duì)許多蛋白的活性基本上也沒(méi)有影響。GFP的熒光很穩(wěn)定，不易被光漂白。這些優(yōu)點(diǎn)使得GFP成為監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)、蛋白定位、細(xì)胞分化發(fā)育的良好標(biāo)記。Heim等通過(guò)突變篩選出了幾株熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的和/或熒光光譜改變的GFP變異型，這些變異型與野生型GFP只有幾個(gè)氨基酸的差別。在其它物種中也分離并克隆表達(dá)出了一些熒光蛋白，如來(lái)自珊瑚蟲(chóng)的紅色熒光蛋白DrFP583(DsRed)[Matz MV，F(xiàn)radkov AF，Labas YA，et al，NatBiotechnol，17(12)969-973(1999)]。1996年Mitro等成功地觀察到兩個(gè)GFP變異型BFP5和RSGFP4之間的FRET現(xiàn)象[Mitra RD，Silva CM，Youvan DC，Gene 17313-17(1996)]。BFP和GFP之間的FRET已被應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞編程死亡、線(xiàn)粒體中Bcl-2和Bax之間的相互作用等研究中[Mahajan NP，Linder K，Berry G，et al，Nat Biotechnol，16(6)547-552(1998)]。
GFP的各種變異型可組成多組能量供受體對(duì)S65G/V68L/S72A/T203Y變異型(激發(fā)峰513nm，發(fā)射峰527nm的黃色熒光蛋白，YFP)和F64L/S65T變異型(激發(fā)峰488nm，發(fā)射峰507nm，EGFP)；Y66H變異型(激發(fā)峰382nm，發(fā)射峰448nm的藍(lán)色熒光蛋白，BFP)和EGFP，T203I/S72A/Y145F變異型(激發(fā)峰395nm，發(fā)射峰509nm，GFPuv)和S65G/S72A/K79R/T203Y變異型(激發(fā)峰513nm，發(fā)射峰527nm，EYFP)等[Heim R，Prasher DC and Tsien RY，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9112501-12504(1994)，Heim R，Cubitt AB，Tsien RY，Nature，373663-664(1995)]。將它們分別與一種抗原嵌合表達(dá)，其產(chǎn)物既有免疫原性又具備熒光特性，在體系中是特異存在的，經(jīng)過(guò)初步純化就不會(huì)出現(xiàn)干擾檢測(cè)、造成假陽(yáng)性的因素，可以應(yīng)用為檢測(cè)試劑。
在維多利亞水母體內(nèi)自然存在著一種FRET現(xiàn)象，即水母發(fā)光蛋白(apoaequorin)和綠色熒光蛋白(wtGFP)之間的能量轉(zhuǎn)移。水母發(fā)光蛋白是一種生物發(fā)光蛋白，當(dāng)Ca2+達(dá)到足夠的濃度并與之發(fā)生結(jié)合后，它將發(fā)生氧化反應(yīng)并發(fā)射藍(lán)光，其最大發(fā)射波長(zhǎng)是466nm，與wtGFP的最大發(fā)射波長(zhǎng)470nm臨近，在水母體內(nèi)，由于兩種蛋白之間距離極小，必然發(fā)生能量的轉(zhuǎn)移，最后以wtGFP發(fā)射綠色熒光(最大發(fā)射波長(zhǎng)504nm)的形式體現(xiàn)出來(lái)。目前這兩種蛋白都得到了分離并在多種異源生物種活性表達(dá)，在GFP被改造利用的同時(shí)，發(fā)光蛋白也出現(xiàn)了多種變異型，包括生物活性提高的類(lèi)型[Casadei J，Powell MJ，KantenJH，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，872047-2051(1990)，Zenno S，Inouye S，Biochem.Biophys.Res.Commun.，171169-174(1990)，Nomura M，Inouye S，Ohmiya Y，et al.FEBS Lett.，29563-66(1991)，Shimomura O，Inouye S，Musicki B，et al.Biochem.，J.270309-312(1990)，Kurose K，Inouye S，Sakaki Y，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8680-84(1989)]，將二者分別與一種抗原嵌合表達(dá)，加入Ca2+作為誘發(fā)劑，其產(chǎn)物既有免疫原性又具備熒光特性，在體系中是特異存在的，經(jīng)過(guò)初步純化就不會(huì)出現(xiàn)干擾檢測(cè)、造成假陽(yáng)性的因素，而且還需要加入誘導(dǎo)劑才能檢測(cè)FRET，使檢測(cè)反應(yīng)更加精確，也能構(gòu)成一套靈敏的檢測(cè)試劑。
蛋白質(zhì)、酶、核酸、糖等生物大分子，可通過(guò)雙功能交聯(lián)劑，在生物大分子之間或與藥物、半抗原等生物小分子進(jìn)行共價(jià)連接，可以制備酶標(biāo)抗體、人工抗體、酶標(biāo)抗原、抗體導(dǎo)向藥物、免疫毒素、核酸探針、固定化酶、生物親和色譜材料、修飾性酶分子等。各種同型和異型雙功能交聯(lián)劑都已陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)?；瘜W(xué)合成的熒光物質(zhì)經(jīng)交聯(lián)劑修飾后可標(biāo)記在純化抗原的氨基、羧基或巰基上；以雙功能基團(tuán)螯合劑與稀土離子Eu3+等形成螯合物，可與純化抗原結(jié)合得到熒光抗原[Evangelista RA，et al，Clin.Biochem，21173(1988)，DiamandisEP，Clin.Biochem.，21139(1988)，Diamandis EP，et al，J.Immunol.Methods，11243(1988)，Diamandis EP，et al，Anal.Chem.，6148(1989)]。標(biāo)記蛋白配合融合表達(dá)熒光蛋白的蛋白構(gòu)成能量供受體對(duì)。雖然這一步操作較為復(fù)雜、存在非特異性，但熒光蛋白/發(fā)光蛋白融合蛋白的存在將使非特異性大大降低，試劑生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單化，并仍保持抗原、抗體的特異反應(yīng)和FRET距離依賴(lài)性，檢測(cè)結(jié)果靈敏而特異。
本發(fā)明的目的是尋找并提供具有FRET特征的檢測(cè)試劑。
本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移該檢測(cè)(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白，其可用于檢測(cè)標(biāo)本中抗體的存在，且該檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、快速，特異性高的特點(diǎn)，因此，該成對(duì)蛋白可用于疾病的檢測(cè)中。
本發(fā)明第一方面涉及具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移特征的由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白，其中，蛋白A是作為能量供體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的抗原，蛋白B是作為能量受體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結(jié)合的共同抗原決定簇。
本發(fā)明第一方面涉及由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白作為檢測(cè)試劑的用途。
本發(fā)明還涉及用于疾病檢測(cè)的試劑盒，其包括(1)由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白，(2)緩沖液，及如必要離子和/或表面活性劑。
本發(fā)明另一方面涉及用于檢測(cè)標(biāo)本中抗體存在的方法，該方法包括(a)將本發(fā)明所提供的任一成對(duì)蛋白與待測(cè)標(biāo)本中抗體相互接觸，形成抗原抗體復(fù)合物；(b)檢測(cè)該抗原抗體復(fù)合物的存在，該抗原抗體復(fù)合物的存在指示該標(biāo)本中與該成對(duì)蛋白共同抗原特異結(jié)合的抗體的存在。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的成對(duì)蛋白中的蛋白A可選自病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關(guān)抗原或其它具有抗原決定簇的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的成對(duì)蛋白中的蛋白B可選自病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關(guān)抗原或其它具有抗原決定簇的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的熒光物質(zhì)可選自熒光蛋白、熒光素、稀土元素、淬滅物質(zhì)等。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)可選自發(fā)光蛋白或魯米諾、過(guò)氧草酸鹽等化學(xué)合成發(fā)光物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的熒光蛋白可選自綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、紅色熒光蛋白及其它熒光蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的發(fā)光蛋白可選自水母發(fā)光蛋白及它的各種變異型。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的成對(duì)蛋白中融合熒光蛋白或發(fā)光蛋白與抗原決定簇片段的融合蛋白既保留了與原抗體分子特異結(jié)合的抗原決定簇，又具有熒光蛋白或發(fā)光蛋白的光學(xué)特性，純化要求簡(jiǎn)單，成對(duì)蛋白與特異抗體反應(yīng)后將導(dǎo)致熒光光譜的明顯變化，易檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。加入特殊的均相熒光免疫反應(yīng)添加劑的緩沖液還有助于擴(kuò)大光譜變化的程度，因此可以作為檢測(cè)試劑，用于檢測(cè)標(biāo)本中的特異抗體，如艾滋病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體。
以基因工程的各種方法可以將熒光蛋白或發(fā)光蛋白基因與編碼某種抗原的基因嵌合在一起，置于合適的載體中進(jìn)行表達(dá)。該抗原可以是病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關(guān)抗原或其它有抗原決定簇的物質(zhì)。在基因工程中，利用大腸桿菌生產(chǎn)外源蛋白的技術(shù)已十分成熟，嵌合蛋白可以通過(guò)調(diào)整表達(dá)條件，以可溶性蛋白形式出現(xiàn)，而且是表達(dá)體系中唯一既有免疫原性、又能發(fā)射熒光或進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的抗原蛋白，略加純化就可用作檢測(cè)試劑。在均勻液相體系中，光學(xué)特性恰好構(gòu)成一對(duì)能量供受體對(duì)的成對(duì)蛋白其相同的抗原決定簇分別結(jié)合特異抗體的兩臂，利用抗體本身的獨(dú)特構(gòu)相，使它們之間的距離拉近，達(dá)到發(fā)生FRET的距離要求以?xún)?nèi)，即1-10nm內(nèi)，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)熒光光譜的明顯變化，這種明顯的變化在20分鐘內(nèi)就可以發(fā)生，通過(guò)相應(yīng)的熒光檢測(cè)儀器如熒光全譜儀或肉眼進(jìn)行判定，證實(shí)待測(cè)樣品中特異抗體的存在，以此為檢測(cè)指標(biāo)對(duì)疾病作出診斷。由于成對(duì)蛋白存在的特異性，只有存在特異抗體的體系中才能出現(xiàn)FRET，在非陽(yáng)性的樣品溶液中，成對(duì)蛋白游離在溶液中，它們之間的距離不足以發(fā)生FRET。本發(fā)明的這一對(duì)蛋白中至少有一個(gè)涉及融合表達(dá)的熒光蛋白或發(fā)光蛋白，避免了使用化學(xué)方法進(jìn)行標(biāo)記操作的繁雜和以往免疫檢測(cè)中難以避免的假陽(yáng)性，因此保證了檢測(cè)試劑生產(chǎn)的簡(jiǎn)易性和應(yīng)用的簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確性。
本發(fā)明采用的均相熒光免疫反應(yīng)添加劑基于抗體本身具有極性，在溶液中加入離子或表面活性劑后輕微改變?nèi)芤旱臉O性，相應(yīng)改變抗體的構(gòu)相，使抗體兩臂之間的距離更加接近，結(jié)合在抗體兩臂上的熒光抗原之間的距離也更近，從而提高能量傳遞效率和檢測(cè)的靈敏度。
本發(fā)明根據(jù)檢測(cè)對(duì)象—血清的自身熒光特性，選擇最大發(fā)射波長(zhǎng)在500nm以上的熒光蛋白來(lái)構(gòu)建成對(duì)蛋白。例如，為驗(yàn)證血清中的綠色熒光蛋白GFPuv的抗體的存在，將綠色熒光蛋白GFPuv和黃色熒光蛋白EYFP分別定作蛋白A和蛋白B，它們之間95.8％的同源性確保了它們相似的免疫原性，而前者的最大發(fā)射波長(zhǎng)(509nm)與后者的最大激發(fā)波長(zhǎng)(513nm)十分接近，可以作為一對(duì)能量供受體對(duì)，它們與血清中的特異抗體反應(yīng)后，形成免疫復(fù)合物，其中GFPuv-antiGFPuv-EYFP的形式將會(huì)發(fā)生FRET，以GFPuv的激發(fā)光(395nm)激發(fā)，20分鐘內(nèi)，其最大發(fā)射波長(zhǎng)509nm處的熒光強(qiáng)度將比加入血清前的大大降低而EYFP最大發(fā)射波長(zhǎng)527nm處的熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，為檢測(cè)血清中是否存在HIV病毒抗體，選擇重組HIV-1包膜蛋白ENV2與熒光蛋白GFPuv、EYFP的嵌合蛋白ENV2-GFPuv、ENV2-EYFP分別作為蛋白A和蛋白B，由它們構(gòu)成檢測(cè)試劑，當(dāng)加入存在HIV-1病毒抗體的待測(cè)血清時(shí)，20分鐘內(nèi)將檢測(cè)到FRET現(xiàn)象，即以GFPuv的最大激發(fā)光395nm激發(fā)，GFPuv的509nm處最大發(fā)射光強(qiáng)度較加入血清前降低而EYFP527nm處的最大發(fā)射光強(qiáng)度較加入血清前升高。而加入HIV-1抗體陰性血清觀察不到這種變化。上述蛋白A和蛋白B構(gòu)成的成對(duì)蛋白因此可以應(yīng)用在艾滋病檢測(cè)中。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明還構(gòu)建另一套HIV-1抗體檢測(cè)試劑，其以嵌合蛋白ENV2-GFPuv作為蛋白A，標(biāo)記熒光素BODIPY507/545的蛋白作為蛋白B，它們都有共同的抗原決定簇——重組HIV-1包膜蛋白ENV2，GFPuv的最大發(fā)射波長(zhǎng)(509nm)與BODIPY507/545的最大激發(fā)波長(zhǎng)(507nm)十分接近，是一對(duì)能量供受體對(duì)，當(dāng)加入存在HIV-1病毒抗體的血清時(shí)，20分鐘內(nèi)將檢測(cè)到FRET現(xiàn)象，出現(xiàn)極其顯著的光譜變化，即以GFPuv的最大激發(fā)光395nm激發(fā)，液相系統(tǒng)最大發(fā)射波長(zhǎng)由加入血清前的507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗體陰性血清的體系最大發(fā)射波長(zhǎng)幾乎不移動(dòng)。這一系統(tǒng)在艾滋病檢測(cè)中具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。
本發(fā)明中應(yīng)用的成對(duì)蛋白都是基因工程產(chǎn)物，利用大腸桿菌構(gòu)建和表達(dá)質(zhì)粒pGFPuv、pEYFP、pRSETB-env2、pRSETB-env2-gfpuv、pRSETB-env2-eyfp，分別得到蛋白GFPuv、EYFP、ENV2、ENV2-GFPuv、ENV2-EYFP。以基因工程中常用的或熟知的純化技術(shù)純化表達(dá)產(chǎn)物，ENV2通過(guò)巰基反應(yīng)標(biāo)記上BODIPY507/545，就可以分別配對(duì)，組成成對(duì)蛋白中的蛋白A和蛋白B。
本發(fā)明提供的藥盒選擇極性緩沖液(10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，可以輕微改變抗體的構(gòu)象和有機(jī)熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率，有利于蛋白A、B和特異抗體反應(yīng)、形成免疫復(fù)合物后FRET的檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選以緩沖液稀釋等摩爾蛋白A和蛋白B，即可作為試劑盒檢測(cè)樣品中特異抗體的存在。
免疫檢測(cè)的對(duì)象一般都是血清，對(duì)多份血清進(jìn)行熒光全譜掃描發(fā)現(xiàn)以紫外光激發(fā)常常會(huì)出現(xiàn)最大發(fā)射波長(zhǎng)在450nm左右的發(fā)射峰并有很長(zhǎng)的尾峰。在本發(fā)明中為避免血清中的背景的干擾，選擇檢測(cè)試劑的最大發(fā)射光譜都在500nm以上。在現(xiàn)有的GFP各種突變型以及化學(xué)合成的熒光試劑中，選擇了GFPuv和EYFP，GFPuv和BODIPY507/545作為能量供受體對(duì)。
GFPuv的發(fā)射光波長(zhǎng)(509nm)與EYFP的激發(fā)光波長(zhǎng)(513nm)幾乎相重疊，二者在足夠近的距離內(nèi)(10nm)可以發(fā)生熒光共振能量傳遞(FRET)，即以GFPuv的激發(fā)光(395nm)激發(fā)，GFPuv獲得的能量以無(wú)輻射的方式傳遞給近距離的EYFP，作為后者的激發(fā)能量，最后這一能量以527nm的光輻射形式發(fā)射，表現(xiàn)為黃色熒光。GFPuv與EYFP之間有95.8％的同源性，以GFPuv為免疫原免疫動(dòng)物獲得的抗血清對(duì)EYFP也有良好的免疫反應(yīng)。陽(yáng)性抗血清中抗體的兩臂能將這兩種熒光蛋白拉近，發(fā)生FRET。檢測(cè)熒光光譜的變化情況可以反映免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱。將同一種抗原分別與這兩種熒光蛋白嵌合表達(dá)，利用抗體兩臂將兩種熒光抗原拉近的作用，使它們之間發(fā)生FRET現(xiàn)象。檢測(cè)這時(shí)液相中熒光光譜的變化可以測(cè)定抗原抗體間是否發(fā)生了結(jié)合。
Molecular probe公司的熒光物質(zhì)BODIPY 507/545能與蛋白質(zhì)中的巰基發(fā)生反應(yīng)，共價(jià)結(jié)合標(biāo)記于蛋白質(zhì)上，使后者獲得最大激發(fā)波長(zhǎng)507nm和最大發(fā)射波長(zhǎng)530nm的熒光性質(zhì)并保留大部分生物活性。以BODIPY 507/545標(biāo)記純化抗原。這一熒光抗原與GFPuv嵌合表達(dá)的同種抗原構(gòu)成一對(duì)能量供受體對(duì)，共同結(jié)合于同一抗體的兩臂上后，以GFPuv的激發(fā)光(395nm)激發(fā)，GFPuv獲得的能量以無(wú)輻射的方式傳遞給近距離的BODIPY 507/545，則可發(fā)生FRET，檢測(cè)到530nm的光強(qiáng)的增加。以FRET的發(fā)生與否可以作為特異抗體存在與否乃至疾病是否發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)。
以基因工程表達(dá)熒光蛋白/發(fā)光蛋白融合抗原的技術(shù)已十分成熟，它們一般以上清的形式出現(xiàn)，純化便利，活性高，易生產(chǎn)，檢測(cè)時(shí)利用抗體本身的特殊構(gòu)象將它們拉近而發(fā)生FRET，反應(yīng)快速而準(zhǔn)確，適合大規(guī)模檢測(cè)的需要，是一種很有應(yīng)用前景的檢測(cè)方法。
pGFPuv、pEYFP分別是兩種熒光蛋白GFPuv和YFP的表達(dá)載體，將這兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coli表達(dá)菌株BL21，低溫誘導(dǎo)表達(dá)以保證熒光蛋白的正確折疊和熒光活性。表達(dá)上清為可溶性成分，熒光明顯。由于GFPuv、EYFP、EGFP、EBFP四者有高于95％的同源性，取經(jīng)分子排阻高效液相層析純化的GFPuv免疫小鼠，可獲得對(duì)這些熒光蛋白都有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)的抗體。
例如，將GFPvu和EYFP等摩爾混合，稀釋后加入免疫小鼠的血清，檢測(cè)前后的熒光變化，可以驗(yàn)證被免疫的小鼠是否產(chǎn)生了抗體及抗體產(chǎn)生的強(qiáng)弱。當(dāng)兩種熒光蛋白與熒光蛋白抗體的比例恰好是1∶1∶2時(shí)，應(yīng)該有50％的抗原、抗體復(fù)合物以GFPuv-antiGFPuv-EYFP的形式存在，抗體的兩臂將GFPuv和EYFP的距離拉近，產(chǎn)生FRET。以395nm光對(duì)整個(gè)液相系統(tǒng)進(jìn)行激發(fā)，熒光光譜的變化在20分鐘內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定?？梢钥吹?，加入GFPvu抗體陽(yáng)性血清的系統(tǒng)里，GFPuv的發(fā)射光峰值明顯下降，而陰性血清中沒(méi)有特異的抗體將兩種熒光蛋白拉近，不發(fā)生FRET。由于加入血清造成熒光背景的變化一般都在500nm之前，可以忽略。
艾滋病(AIDS，獲得性免疫缺陷綜合癥)對(duì)人類(lèi)的威脅正在激增，檢測(cè)試劑的研制也顯得及其重要。EIA是目前最普及的HIV檢測(cè)手段，主要是基于HIV env基因編碼的鑲嵌于包膜的糖蛋白gp120、gp41和gag基因編碼的衣殼蛋白p24的免疫原性來(lái)研制的。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明可以熒光共振能量傳遞均相檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)艾滋病。
具體講，以分子克隆的方式構(gòu)建出能夠融合表達(dá)熒光蛋白和抗原蛋白的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒pRSETB-env2能在大腸桿菌中表達(dá)出具有較強(qiáng)抗原活性的重組艾滋病毒包膜蛋白，從含有g(shù)fpuv基因的質(zhì)粒pGFPuv(購(gòu)自Clonetech公司)中以限制性?xún)?nèi)切酶切出750bp的gfpuv基因片段，連入env2基因3`端，獲得重組質(zhì)粒pRSETB-env2-gfpuv(2u)。同樣，連接來(lái)自于質(zhì)粒pEYFP的750bp eyfp基因于env2基因的3`端，獲得重組質(zhì)粒pRSETB-env2-eyfp(2y)。
構(gòu)建的質(zhì)粒2u、2y轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21，低溫誘導(dǎo)表達(dá)2U、2Y以保證融合表達(dá)的熒光蛋白和ENV2構(gòu)相和功能的正確，取超聲裂解的菌體上清用于檢測(cè)。熒光檢測(cè)及免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，融合蛋白保存了熒光蛋白和重組艾滋病毒包膜蛋白的生物學(xué)和化學(xué)活性，但略低于單獨(dú)表達(dá)的這兩種蛋白質(zhì)。
將2Y和2U等摩爾混合，稀釋后加入血清，檢測(cè)前后的熒光變化。當(dāng)兩種熒光抗原2U、2Y與包膜蛋白抗體的比例恰好為1∶1∶2時(shí)，理論上將有50％的抗原、抗體結(jié)合形式為2U-Ig-2Y，其余50％是等比例的2U-Ig-2U和2Y-Ig-2Y，也就是將有50％的抗原、抗體復(fù)合物會(huì)發(fā)生FRET。以GFPuv的激發(fā)光對(duì)整個(gè)液相系統(tǒng)進(jìn)行激發(fā)，熒光光譜的變化在20min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定。加入HIV-1抗體陽(yáng)性血清的體系中，GFPuv的發(fā)射光峰值明顯下降，這是其吸收的激發(fā)光能量傳遞給EYFP所引起的。加入HIV-1陰性血清的體系測(cè)不到GFPuv發(fā)射光峰值的明顯下降，也即沒(méi)有特異的抗體將兩種熒光抗體拉近，不發(fā)生FRET。以稀釋液取代血清加入到檢測(cè)體系中，觀察由于加入血清造成的整個(gè)反應(yīng)體積的變大、蛋白濃度降低，從而降低熒光強(qiáng)度的影響。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這一影響很小，低于1％，可以忽略。
另外對(duì)純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2進(jìn)行了化學(xué)熒光標(biāo)記。Molecular probe公司生產(chǎn)的熒光探針可對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等進(jìn)行標(biāo)記，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。BODIPY 507/545是該公司生產(chǎn)的巰基反應(yīng)熒光探針，以DMSO溶解成10mmol/l的儲(chǔ)備液。已純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2，標(biāo)記前先對(duì)PB(pH＝7.3)透析，并以PEG10000濃縮成2mg/ml存于PB中的溶液，在室溫、避光、不停震蕩的條件下以1∶100(V/V)的比例緩慢加入BODIPY507/545儲(chǔ)備液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，隔絕氧氣，維持室溫、避光、震蕩反應(yīng)3小時(shí)，最后對(duì)PB(pH＝7.3)透析終止反應(yīng)，獲得ENV2-BODIPY507/545(2D)。檢測(cè)得知其熒光光譜不變，熒光強(qiáng)度及抗原活性略有下降，可作為FRET檢測(cè)試劑。
根據(jù)本發(fā)明，在合適的反應(yīng)緩沖液中按相等的抗原活性加入2U和2D組成檢測(cè)體系，再加入相應(yīng)滴度的血清，以GFPuv的激發(fā)光激發(fā)，掃描500-550nm的發(fā)射光，對(duì)比加入血清前后發(fā)射光譜的變化，發(fā)現(xiàn)20分鐘后，加入HIV-1抗體陽(yáng)性血清的體系最大發(fā)射波長(zhǎng)由507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗體陰性血清的體系最大發(fā)射波長(zhǎng)幾乎不移動(dòng)。即以FRET檢測(cè)到了HIV-1ENV2的特異性抗原、抗體反應(yīng)，可應(yīng)用于艾滋病檢測(cè)中(見(jiàn)圖3、圖4)。
綠色熒光蛋白現(xiàn)已發(fā)展出多種變異型，它們的特性包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜的移動(dòng)，量子產(chǎn)率的變化以至熒光強(qiáng)度的變化，更易于表達(dá)等[(Heim R，Prasher DC，Tsien RY，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9112501-12504(1994)，Heim R，Cubitt AB，Tsien RY，Nature，373663-664(1995)]。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，X-衍射分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)、定點(diǎn)突變、DNA shuffling等技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)和改造中，可能產(chǎn)生出更多的GFP突變型，以供選擇成為FRET能量供受體對(duì)。從其它物種中也分離并克隆出了一些熒光蛋白，如珊瑚蟲(chóng)熒光蛋白等。將熒光蛋白基因和抗原的核苷酸序列以分子克隆技術(shù)在氨基末端或羧基末端相連，可以制備融合蛋白，獲得熒光抗原。生物表達(dá)的熒光抗原，熒光蛋白作為分子探針高度特異地標(biāo)記在特定的抗原上，可以避免純化工藝不足造成的檢測(cè)時(shí)的干擾，其理化性質(zhì)也是很穩(wěn)定的。
對(duì)于化學(xué)合成熒光物質(zhì)和稀土元素的研究已有很長(zhǎng)的歷史，許多基團(tuán)或稀土元素的熒光特性都已得到了充分的了解，經(jīng)雙功能交聯(lián)劑修飾后即可對(duì)病毒蛋白或多肽的氨基、羧基或巰基等基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，純化后獲得熒光抗原。它們的特點(diǎn)是熒光的量子產(chǎn)率高，反應(yīng)后熒光光譜的變化很明顯，易于檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明，可以熒光抗原為檢測(cè)試劑，建立一個(gè)均勻液相反應(yīng)體系，加入可能含有特異抗體的血清，一旦發(fā)生抗原、抗體的特異反應(yīng)，抗體兩臂將檢測(cè)試劑中的這對(duì)熒光能量供受體拉近，就能觀察到FRET。加入某些特殊的添加劑，如Triton、金屬離子等，可能輕微改變?nèi)芤旱碾娦詮亩淖兊鞍踪|(zhì)的構(gòu)相，將抗體兩臂間的距離拉得更近。由于FRET的發(fā)生與距離的六次方成反比，更近的距離將使FRET的發(fā)生更加明顯，從而提高檢測(cè)的靈敏度。根據(jù)本發(fā)明，可以化學(xué)發(fā)光的抗原和熒光抗原為檢測(cè)試劑，建立均勻液相反應(yīng)體系，加入可能含有特異抗體的血清，一旦發(fā)生抗原、抗體的特異反應(yīng)，抗體兩臂將檢測(cè)試劑中的這對(duì)熒光能量供受體拉近，只要加入合適的誘發(fā)劑，就能觀察到FRET。由于化學(xué)發(fā)光需要誘導(dǎo)條件，可以用于設(shè)定檢測(cè)時(shí)間、控制測(cè)量值的大小，更有利于標(biāo)準(zhǔn)化操作和測(cè)定。
以下參照表格、附圖及描述實(shí)例以更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
表格中表格1顯示檢測(cè)試劑GFPuv、EYFP體系中加入陰、陽(yáng)性血清前后GFPuv熒光強(qiáng)度的比較表格2顯示檢測(cè)試劑2U、2Y體系中加入陰、陽(yáng)性血清前后GFPuv熒光強(qiáng)度的比較表格3顯示檢測(cè)試劑2U、2D體系中加入陰、陽(yáng)性血清前后體系的熒光高峰比較


圖1顯示GFPuv、EYFP檢測(cè)體系中加入陽(yáng)性血清前后的熒光強(qiáng)度變化圖2顯示GFPuv、EYFP檢測(cè)體系中加入陰性血清前后的熒光強(qiáng)度變化圖3顯示檢測(cè)試劑2U、2Y體系中加入陽(yáng)性血清前后的熒光強(qiáng)度變化圖4顯示檢測(cè)試劑2U、2Y體系中加入陰性血清前后的熒光強(qiáng)度變化圖5顯示檢測(cè)試劑2U、2D體系中加入陽(yáng)性血清前后熒光光譜的變化圖6顯示檢測(cè)試劑2U、2D體系中加入陰性血清前后熒光光譜的變化術(shù)語(yǔ)解釋熒光共振能量傳遞(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)指一對(duì)合適的熒光物質(zhì)可以構(gòu)成一個(gè)能量供體(Donor)和能量受體(Acceptor)對(duì)，它們之間的距離達(dá)到1-10nm的范圍內(nèi)時(shí)，由于偶極-偶極的相互作用，激發(fā)供體分子的光子能量hν可能被傳遞至受體分子，而后受體分子通過(guò)發(fā)射出光子hν’(hν＞hν’)而松弛。由Frster于1948年首先提出該理論。均相熒光免疫測(cè)定(Homogeneous Fluoroimmunoassay，hFIA)指在同一個(gè)均勻溶液系統(tǒng)中一步完成免疫反應(yīng)和信號(hào)的測(cè)定，檢測(cè)方法包括夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法兩種，都是由抗原、抗體復(fù)合物的形成導(dǎo)致其中的標(biāo)記物熒光信號(hào)的改變而進(jìn)行檢測(cè)的。
實(shí)施例1 GFPuv和EYFP作為成對(duì)蛋白用于檢測(cè)血清中抗體的是否存在pGFPuv、pEYFP分別是兩種熒光蛋白GFPuv和YFP的表達(dá)載體，將這兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coli表達(dá)菌株BL21，挑取單克隆30℃搖菌至OD600＝0.6，加入IPTG至終濃度0.5mmol/l，15℃ 200rpm震蕩培養(yǎng)24hr。離心菌體以裂解液(20mM Tris-Cl，5mM EDTA，100mMNaCl，pH＝8.0)吹起，超聲破碎，12000rpm離心10分鐘，上清熒光明顯，用于檢測(cè)。
以俄羅斯Lumex公司產(chǎn)熒光全譜儀(FLUORAT-02 PANORAMA)檢測(cè)表達(dá)上清，GFPuv激發(fā)波長(zhǎng)395nm，發(fā)射波長(zhǎng)507nm；EYFP激發(fā)波長(zhǎng)513nm，發(fā)射波長(zhǎng)527nm，熒光強(qiáng)度相當(dāng)。
PSA軟件分析結(jié)果顯示，GFPuv、EYFP、EGFP、EBFP四者有很高的同源性，都在95％以上(GFPuvEGFP 96.7％，GFPuvEBFP95.8％，GFPuvEYFP95.8％，EGFPEBFP99.2％，EGFPEYFP97.9％)?；谶@一點(diǎn)，取GFPuv免疫小鼠，以獲得熒光蛋白抗體。將GFPuv表達(dá)上清以飽和硫銨沉淀，其中50％飽和硫銨沉淀中GFPuv的含量在60％以上。用PBS(20mMNaCl，2.68mM KCl，10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4，pH7.4)重懸浮后，對(duì)PBS透析，取透析產(chǎn)物進(jìn)行分子排阻高效液相層析(TSK-GELHPLC，BECKMAN)，產(chǎn)物純度在95％以上。以MBA-2000核酸、蛋白檢測(cè)儀測(cè)定并調(diào)整濃度到2mg/ml，取30μl與等體積的福氏佐劑混勻，四肢肌肉等量注射免疫小鼠，并在2周和7周后分別以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。免疫前后都剪鼠尾采血，分離血清用于免疫檢測(cè)。EIA測(cè)定發(fā)現(xiàn)，GFPuv、EYFP表達(dá)上清以碳酸緩沖液1∶2000稀釋包被，仍有良好的免疫反應(yīng)，與陰性血清對(duì)比P/N值都在10以上，適用于FRET檢測(cè)。
將GFPvu和EYFP等量混合，取2ul以1∶50的比例稀釋成100ul(稀釋液10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，加入5ul血清，檢測(cè)前后的熒光變化。以395nm光對(duì)整個(gè)液相系統(tǒng)進(jìn)行激發(fā)，熒光光譜的變化在20min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定。可以看到，加入GFPvu抗體陽(yáng)性血清后，GFPuv的發(fā)射光峰值明顯下降，達(dá)17％以上，這是其發(fā)射光能量被EYFP吸收所引起的。由于其尾峰的掩蓋，527nm處EYFP的發(fā)射光峰值的增加一般不能看到。陰性血清中沒(méi)有特異的抗體將兩種熒光抗體拉近，不發(fā)生FRET。加入陰性血清后GFPuv發(fā)射光也有下降，低于5％，這可能是由一些假陽(yáng)性的抗原抗體反應(yīng)引起。但可以體現(xiàn)出陰、陽(yáng)性血清之間的差別。由于加入血清造成的整個(gè)反應(yīng)體積的變大、蛋白濃度降低，從而熒光強(qiáng)度降低的影響很小，低于1％，可以忽略。(見(jiàn)表1，圖1、圖2)實(shí)施例2 ENV2-GFPuv(2u)和ENV2-EYFP(2y)作為成對(duì)蛋白檢測(cè)血清中是否存在HIV-1抗體已檢測(cè)到多數(shù)血清都存在以紫外光激發(fā)后產(chǎn)生的450nm左右的發(fā)射光，構(gòu)建熒光抗原時(shí)避開(kāi)了最大發(fā)射光在448nm的EBFP；同時(shí)為避免能量供體的激發(fā)光直接為能量受體提供激發(fā)能量，也避開(kāi)了最大激發(fā)光波長(zhǎng)與最大發(fā)射光波長(zhǎng)之間距離很近的EGFP(EX＝488nm，EM＝507nm)，選擇了GFPuv(EX＝395nm，EM＝509nm)作為能量供體，EYFP作為能量受體(EX＝513nm，EM＝527nm，以分子克隆的方式構(gòu)建出能夠融合表達(dá)熒光蛋白和抗原蛋白的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒pRSETB-env2能在大腸桿菌中表達(dá)出具有較強(qiáng)抗原活性的重組艾滋病毒包膜蛋白，以限制性?xún)?nèi)切酶PstI/KpnI處理，切去其終止密碼前的一小段堿基。同時(shí)將含有g(shù)fpuv基因的質(zhì)粒pGFPuv(購(gòu)自Clonetech公司)也以限制性?xún)?nèi)切酶PstI/KpnI處理，回收750bp的gfpuv基因片段，連入env2基因3`端，獲得重組質(zhì)粒pRSETB-env2-gfpuv(2u)。同樣，以限制性?xún)?nèi)切酶BamHI/KpnI同時(shí)處理質(zhì)粒pRSETB-env2和pEYFP，連接750bp的eyfp基因于env2基因的3`端，獲得重組質(zhì)粒pRSETB-env2-eyfp(2y)。
構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ecoli BL21菌株，30℃搖菌至OD600＝0.6，加入IPTG至終濃度0.5mmol/l，15℃ 200rpm震蕩培養(yǎng)24hr。離心菌體以裂解液(20mM Tris-Cl，5mM EDTA，100mM NaCl，pH＝8.0)吹起，超聲破碎，12000rpm離心10分鐘，取上清用于檢測(cè)。
以12％SDS-PAGE觀察，2Y、2U均為43KD(ENV2 16KD，GFPuv、EYFP27KD)，含量約占上清的20％。以熒光全譜儀FLUORAT-02(俄羅斯產(chǎn))分別檢測(cè)2Y、2U的熒光，2U最大激發(fā)光波長(zhǎng)Ex＝395nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)Em＝509nm，2Y最大激發(fā)光波長(zhǎng)Ex＝513nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)Em＝527nm，與單獨(dú)表達(dá)的GFPuv、EYFP相同，但熒光強(qiáng)度相對(duì)減弱。EIA檢測(cè)二者均有較強(qiáng)的免疫學(xué)活性，但低于單獨(dú)的ENV2。
將2Y和2U等量混合，取100ul以1∶30的比例稀釋成3ml(稀釋液10％牛血清，0.5％酪蛋白，2％BSA，1‰TritonX-100，1ppm氨基吡啉)，加入50ul血清，檢測(cè)前后的熒光變化。以395nm光對(duì)整個(gè)液相系統(tǒng)進(jìn)行激發(fā)，熒光光譜的變化在20min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定。.可以看到，加入HIV-1抗體陽(yáng)性血清后，GFPuv的發(fā)射光峰值明顯下降，達(dá)14％以上，這是其發(fā)射光能量被EYFP吸收所引起的。由于其尾峰的掩蓋，527nm處EYFP的發(fā)射光峰值的增加一般不能看到，但強(qiáng)陽(yáng)性血清與抗原的反應(yīng)比例合適而充分時(shí)，也有增強(qiáng)的現(xiàn)象。陰性血清中沒(méi)有特異的抗體將兩種熒光抗體拉近，不發(fā)生FRET。加入陰性血清后GFPuv發(fā)射光也有下降，低于5％，這可能是由一些假陽(yáng)性的抗原抗體反應(yīng)引起。但可以體現(xiàn)出陰、陽(yáng)性血清之間的差別。由于加入血清造成的整個(gè)反應(yīng)體積的變大、蛋白濃度降低，從而熒光強(qiáng)度降低的影響很小，低于1％，可以忽略。(見(jiàn)表2，圖3、圖4)實(shí)施例3 2u和ENV2-BODIPY 507/545(2D)作為成對(duì)蛋白用于檢測(cè)血清中是否存在HIV-1抗體。
對(duì)純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2進(jìn)行了化學(xué)熒光標(biāo)記。熒光物質(zhì)購(gòu)于Molecular probe公司。BODIPY 507/545為紅色固體粉末，避光、干燥、保存于-20℃。標(biāo)記前挑取適量干粉，溶于200μl DMSO成紅色溶液，測(cè)其在507nm激發(fā)光下的吸光值A(chǔ)。根據(jù)公式C＝A/ε(ε＝69000)算出BODIPY 507/545的實(shí)際濃度，再加DMSO調(diào)整濃度到10mM。純化的HIV-1重組包膜蛋白ENV2，純度達(dá)95％，濃度為0.5mg/ml，保存于Tris-Cl緩沖液中，標(biāo)記前先對(duì)PB(pH＝7.3)透析，并以PEG10000濃縮成為2mg/ml存于PB中的溶液。將抗原ENV2等分，每200μl到一0.5ml eppendorf管中，室溫下避光、不停震蕩、緩慢加入2μl稀釋好的BODIPY507/545溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，蓋好管蓋，維持室溫、避光、震蕩反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)后，溶液對(duì)PB(pH＝7.3)透析終止反應(yīng)，獲得ENV2-BODIPY507/545(2D)。檢測(cè)其熒光光譜及抗原性。光譜為激發(fā)光504nm，發(fā)射光530nm，EIA檢測(cè)抗原活性下降10％，可作為FRET檢測(cè)試劑。
在100μl反應(yīng)緩沖液(含10％牛血清、0.5％酪蛋白、2％BSA、5‰TritonX-100、1ppm氨基吡啉)中加入5μl 2U和5μl 2D，裝入酶聯(lián)免疫檢測(cè)微孔板的微孔中，再加入3μl血清，檢測(cè)前后的熒光光譜變化。以395nm光激發(fā)，掃描500-550nm的發(fā)射光，對(duì)比加入血清前后發(fā)射光譜的變化，發(fā)現(xiàn)20分鐘后，體系的熒光強(qiáng)度整體提高，可能是TritonX-100提高了熒光團(tuán)的熒光效率的結(jié)果。加入HIV-1抗體陽(yáng)性血清的微孔最大發(fā)射波長(zhǎng)由507nm左右移至530nm左右，而加入HIV-1抗體陰性血清的微孔最大發(fā)射波長(zhǎng)幾乎不移動(dòng)，在510nm左右。即以FRET檢測(cè)到了HIV-1ENV2的特異性抗原、抗體反應(yīng)，可應(yīng)用于艾滋病檢測(cè)中，以尋找最大發(fā)射波長(zhǎng)的位置確定血清中是否含有陽(yáng)性抗體(見(jiàn)表3、圖5、圖6)。
表1.加入不同血清前后507nm熒光強(qiáng)度的比較
表2.加入陰、陽(yáng)性血清的509nm熒光強(qiáng)度比較50ul 2Y+50u12U稀釋→3000ul 激發(fā)光Ex＝395nm
表3.加入不同血清前后熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)的變化Ex＝395nm 掃描Em 480~550nm
權(quán)利要求
1.具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白，其中蛋白A是作為能量供體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的抗原，蛋白B是作為能量受體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)的抗原，而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結(jié)合的共同抗原決定簇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的成對(duì)蛋白，其中蛋白A可選自病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關(guān)抗原或其它具有抗原決定簇的物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的成對(duì)蛋白，其中蛋白B可選自病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、腫瘤相關(guān)抗原或其它具有抗原決定簇的物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一要求的成對(duì)蛋白，其中熒光物質(zhì)可選自熒光蛋白、熒光素、稀土元素、淬滅物質(zhì)等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一要求的成對(duì)蛋白，其中化學(xué)發(fā)光物質(zhì)可選自發(fā)光蛋白和魯米諾、過(guò)氧草酸鹽等化學(xué)合成發(fā)光物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的成對(duì)蛋白，其中熒光蛋白可選自綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、紅色熒光蛋白及其它熒光蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的成對(duì)蛋白，其中發(fā)光蛋白可選自水母發(fā)光蛋白及它的各種變異型。
8.一種用于檢測(cè)標(biāo)本中抗體存在的方法，該方法包括(a)權(quán)利要求1-7任一要求的成對(duì)蛋白與待測(cè)標(biāo)本中的抗體相互接觸，形成抗原、抗體復(fù)合物；(b)檢測(cè)該抗原抗體復(fù)合物的存在，該抗原抗體復(fù)合物的存在指示該標(biāo)本中與該成對(duì)蛋白共同抗原特異結(jié)合的抗體的存在。
9.權(quán)利要求8的方法，其中待測(cè)抗體可為艾滋病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體。
10.一種檢測(cè)盒，其包括(1)權(quán)利要求1-7任一要求的成對(duì)蛋白，(2)緩沖液，及(3)如必要離子和/或表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)特征的由蛋白A和蛋白B組成的成對(duì)蛋白,蛋白A是作為能量供體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的抗原,蛋白B是作為能量受體且?guī)в袩晒馕镔|(zhì)的抗原,而且蛋白A和蛋白B具有能與同一抗體分子特異結(jié)合的共同抗原決定簇,由蛋白A、B和適當(dāng)?shù)木彌_液組成的均相免疫檢測(cè)藥盒,及它們用于檢測(cè)標(biāo)本中抗體存在的用途,尤其在艾滋病毒抗體、乙型肝炎病毒抗體、丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)方面的用途。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1353313SQ0013029
公開(kāi)日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者夏寧邵, 羅文新, 張軍, 謝小燕, 李少偉 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)