專利名稱：能夠中和乙型肝炎病毒的人抗體在預(yù)防或治療乙型肝炎病毒感染中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中和HBV的人抗體在預(yù)防或治療HBV感染或由此引起的疾病中的用途。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)引起肝炎和肝癌。WHO已經(jīng)透露約1/3的慢性HBV患者發(fā)生 肝硬化或肝癌，每年約一百萬人死于HBV相關(guān)的疾病。針對HBV的疫苗的開發(fā)使得預(yù)防乙型肝炎成為可能，但是還有許多人通過HBV感 染而患有慢性肝炎。另外，有日益增加的肝移植需要，這需要開發(fā)有效的可以在肝移植中抑 制HBV感染的抗體。病毒復(fù)制抑制劑如拉米夫定被廣泛用作慢性乙型肝炎的治療性藥物，但是僅使用 病毒復(fù)制抑制劑不可能治療慢性乙型肝炎。病毒復(fù)制抑制劑與具有與病毒復(fù)制抑制劑不 同作用機(jī)制的抗體的組合預(yù)期可以產(chǎn)生對于慢性乙型肝炎增加的治療效果。這樣的抗體 可以包括從具有高的抗HBV抗體滴度的血中純化的乙型肝炎抗體(乙型肝炎免疫球蛋白； HBIG)。但是，由于現(xiàn)在可獲得的HBIG的有限可用性、低特異性和可能的傳染性病原體的污 染，所述HBIG不是理想的治療性抗體的來源。因此，已經(jīng)嘗試使用重組抗體而解決上述問題。沒有血漿供應(yīng)是可能的，穩(wěn)定地提 供安全的產(chǎn)品也是可能的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這樣的重組抗體的活性是常規(guī)的源自血漿的抗體的 活性的3000倍或更高，其可以用于預(yù)防肝移植過程中的病毒感染和治療慢性乙型肝炎。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種中和HBV的人抗體在預(yù)防或治療HBV感染或由此 引起的疾病中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用中和HBV的人抗體而預(yù)防或治療HBV感染或 由此引起的疾病的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了人抗體在預(yù)防或治療哺乳動物中的HBV感染或由 此引起的疾病中的用途，所述抗體包含具有SEQ IDN0:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH) 和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種預(yù)防或治療哺乳動物中的HBV感染或由此 引起的疾病的方法，所述方法包括給予治療上有效量的人抗體，所述抗體包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH)和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū) (VL)。


從下列本發(fā)明的描述結(jié)合下列附圖，本發(fā)明上述的和其它的目的和特征將變得顯而易見，其分別顯示圖1從未經(jīng)本發(fā)明的抗體處理的黑猩猩中收集的血樣中的HBVDNA、HBsAg和抗HBs 的量的改變；圖2用于水動力學(xué)動物模型的HBV基因組和質(zhì)粒pHBVl. 3-MBRI的結(jié)構(gòu)特征；圖3向注射了 pHBVl. 3-MBRI質(zhì)粒的小鼠給予本發(fā)明的抗體和/或HBV復(fù)制抑制 劑后，血HBsAg濃度的改變；圖4向注射了 pHBVl. 3-MBRI質(zhì)粒的小鼠給予本發(fā)明的抗體和/或HBV復(fù)制抑制 劑后，血抗體濃度的改變；圖5(a)免疫沉淀分析結(jié)果顯示根據(jù)使用的本發(fā)明的抗體量的本發(fā)明的抗體對患 者血中HBV的結(jié)合程度；圖5(b)免疫沉淀分析結(jié)果顯示根據(jù)使用的本發(fā)明的抗體量的患者血中HBV DNA 量的改變；圖5(c)比較性免疫沉淀分析結(jié)果顯示本發(fā)明的抗體或常規(guī)抗體對患者血中HBV 的結(jié)合程度；圖6(a)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示本發(fā)明的抗體對HBV感染的人肝組織的結(jié)合； 和圖6(b)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示具有與本發(fā)明的抗體相同的同種型的陰性對 照抗體對HBV感染的人肝組織的結(jié)合。
具體實(shí)施例方式用于預(yù)防或治療HBV感染或由此引起的疾病的方法中的人抗體包含具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH)和具有SEQ IDN0 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū) (VL)。本發(fā)明人已經(jīng)在試驗(yàn)中使用黑猩猩證明了本發(fā)明的抗體中和HBV的效率。特別 地，輸入了 HBV和本發(fā)明的抗體的混合物的黑猩猩在隨后的一年中沒有被HBV感染。另外， 當(dāng)向被HBV感染的黑猩猩給予本發(fā)明的抗體時(shí)，HBV表面抗原(HBsAg)的量開始減少，但 是隨著本發(fā)明的抗體量的減少而增加。免疫沉淀分析顯示本發(fā)明的抗體與患者血樣中的 HBV強(qiáng)烈結(jié)合，免疫組織化學(xué)染色分析顯示本發(fā)明的抗體還與被HBV感染的人肝組織強(qiáng)烈
纟口口。用于本發(fā)明方法的人抗體在韓國專利號467706中公開，并且可以通過細(xì)胞系 HBAb-49 (KCLRF-BP-00054)產(chǎn)生。如在本發(fā)明的實(shí)施例中所述的，在動物實(shí)驗(yàn)中抗體顯示了出色的針對HBV的中和 活性。因此，抗體可以用于預(yù)防或治療HBV感染，例如，在肝移植過程中的HBV感染，和由此 引起的疾病例如慢性肝炎。因此，本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療HBV感染或由此引起的疾病的藥物組合 物，其含有帶有藥學(xué)上可接受載體的作為活性成分的人抗體，所述抗體由具有SEQ ID N0:1 的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH)和具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(yL)組 成。藥物制劑可以根據(jù)任何常規(guī)的過程制成各種藥物制劑。為了制備藥物制劑，優(yōu)選地使用載體混合或稀釋抗體，或?qū)⒖贵w包埋在容器類載體中。當(dāng)載體用作稀釋劑時(shí)，其可以 是作為抗體的載體、賦形劑或介質(zhì)的固體、半固體或液體的材料。因此，制劑可以是片、丸、 粉末、囊、酏、懸浮液、乳劑、溶液、糖漿、氣溶膠、軟的或硬的明膠膠囊、無菌的可注射溶液、 無菌的粉末等的形式。合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸 鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶體纖維素、聚乙烯吡咯酮、水、羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸 丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物組合物可以另外包括填充劑、抗凝集劑、潤滑劑、浸 濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。藥物組合物還可以通過使用任何本領(lǐng)域熟知的方法在將 其給予哺乳動物后提供快速的、持續(xù)的或延遲的抗體釋放。本發(fā)明的抗體可以與抗病毒藥物如干擾素、抗HBV單克隆抗體、抗HBV多克隆抗 體、核苷同系物、DNA聚合酶抑制劑、siRNA藥物或治療性疫苗一起使用。可以給予哺乳動物(包括人)本發(fā)明的抗體從而預(yù)防或治療HBV感染或由此引起 的疾病?？贵w的劑量可以根據(jù)各種相關(guān)的因素如要治療的個(gè)體的狀況、疾病的類型和嚴(yán)重 程度、給藥的速率和醫(yī)生的意見而調(diào)整。本發(fā)明的抗體可以在單一劑量中或分開劑量中范 圍為約0. 001-10mg/kg(體重)/劑，優(yōu)選0. 005-lmg/kg/劑的有效量腸道外給藥。在某些 情況下，上述劑量以下的量可以是更恰當(dāng)?shù)??？梢允褂帽壬鲜鰟┝看蟮牧浚灰洳辉斐蓢?yán) 重的副作用，每日可以在分開劑量中給予這樣的大劑量。下列實(shí)施例是為了說明本發(fā)明而不限制其范圍。實(shí)施例1 對黑猩猩中中和HBV能力的評估為了確認(rèn)本發(fā)明的人抗體顯示出體內(nèi)中和HBV的能力，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)。將獲自！fepatitisResearch Foundation (New York, USA)的 HBV 100CID50(50% 黑猩猩感染劑量)放入三個(gè)管中。將0. Img和IOmg的本發(fā)明的抗體Ofepabig-Gene，Green Cross, Korea)分別加入兩個(gè)管中，另一個(gè)管中不加抗體。將PBS (磷酸鹽緩沖的鹽水)加 入管中至最終體積為3ml，將混合物在37°C孵育1小時(shí)，然后在4°C過夜，并用液氮冷凍以制 備測試樣品。向三只黑猩猩 Ofepatitis Research Foundation, New York, USA)靜脈給予測試 樣品，上述黑猩猩以前未感染HBV。每只黑猩猩的抗體劑量列在表1中。表 1 從給予抗體的一周前至給予抗體后8周每周收集血樣，從給予抗體后8周起每2 周測定與HBV感染相關(guān)的標(biāo)志物如HBV DNA、HBsAg(HBV表面抗原)，抗_HBs (HBsAg的抗 體)，抗-HBc (HBV核心抗體)，ALT和AST。另外，通過血和尿的測試評價(jià)抗體的體內(nèi)安全 性，黑猩猩1至3的結(jié)果分別顯示于表2-4中。另外，測定了黑猩猩1的HBVDNA，HBsAg和 抗-HBs的量的改變，結(jié)果顯示于圖1中。表2 (黑猩猩1) 表3 (黑猩猩2) 表4(黑猩猩3) 如在表2至4中顯示的，在作為對照的黑猩猩1中觀察到HBV感染，而在給予了本 發(fā)明的抗體和HBV的黑猩猩2和3中未觀察到病毒感染。這些結(jié)果顯示本發(fā)明的抗體具有 優(yōu)異的HBV中和能力。另外，在肝功能、血和尿的測試中未發(fā)現(xiàn)異常值，顯示抗體在體內(nèi)是 安全的。實(shí)施例2 對小鼠模型中HBV中和能力的評價(jià)2-1)含有HBV DNA的質(zhì)粒的構(gòu)建將HBV (adr 亞型)基因的 1. 3 序列(Gene Bank accession No. DQ683578) (從HBV基因組的增強(qiáng)子I的上游至多聚腺苷酸化區(qū)的下游的HBV基因；見圖2)插入 pcDNA3. 1 (Invitrogen, USA)的PmeI限制位點(diǎn)中，得到的質(zhì)粒pHBVl. 3-MBRI通過使用 EndoFree PlasmidKit (Qiagen, Germany)而制備。2-2)質(zhì)粒注射將2-1)中制備的20μ g pHBVl. 3-MBRI質(zhì)粒溶于生理鹽水溶液中至對應(yīng)于 小鼠重量9%的體積，并以0. 3ml/秒的速率(水動力學(xué)注射)注射進(jìn)入免疫缺陷的 C57BL/6J-Prkdcscid/SzJ 雌性小鼠(8 周大，Jacksonlaboratory, USA)的尾靜脈中。2-3)給予本發(fā)明的抗體和HBV復(fù)制抑制劑每次HBsAg水平達(dá)到最高水平，將本發(fā)明的抗體以基于20g小鼠體重的5mg/ kg的濃度注射進(jìn)入小鼠的尾靜脈中。在早期只將100 μ IPBS注射進(jìn)入對照小鼠的尾靜 脈中，80天后，如上述注射本發(fā)明的抗體。作為比較的組，將1片Zeffix(Lamivudine，GlaxoSmithKline PLC) (HBV治療性藥物)稀釋于蒸餾水中，每天以基于20g小鼠體重的 5mg/kg的濃度口服給予100 μ 1混合物100天，從第101天開始給予50mg/kg的濃度口服給 予100 μ 1混合物，從第124天至第160天給予500mg/kg的濃度口服給予100 μ 1混合物。2-4)分析HBsAg水平的改變在實(shí)驗(yàn)中，每3至4天進(jìn)行眼出血，通過使用GENEDIA HBsAgELISA 3. 0試劑盒 (Greencross MS, Korea)分析血中HBsAg水平和殘余的抗體量。收集血樣并稀釋。測定ELISA吸收度，在10倍稀釋的血樣中測定的吸收度顯示于 圖3中。如圖3中顯示的，Zeffix處理的組中HBsAg水平維持恒定，而在本發(fā)明的抗體處 理的組中重復(fù)出現(xiàn)增加和減少HBsAg水平的循環(huán)。這一結(jié)果顯示本發(fā)明的抗體具有優(yōu)異的 中和HBsAg的效力。據(jù)信未觀察到Zeffix的影響，因?yàn)檫@種類型動物模型對于聚合酶抑制 劑可能不適合。另外，本發(fā)明的抗體和Zeffix共處理的組顯示了與本發(fā)明的抗體處理的組 相似的吸收度式樣。在PBS處理的組中，HBsAg水平維持恒定，但是在第80天注射本發(fā)明 的抗體后降低，這也顯示本發(fā)明的抗體具有優(yōu)異的中和HBsAg的效力。同時(shí)，使用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法測定血中抗體的量。特別地，將純化的重組HBsAg溶 液稀釋于PBS中至5 μ g/ml的濃度，將100 μ 1所得溶液的等份加載至Nunc immuno module 的每個(gè)孔中并在2至8°C孵育過夜，去掉溶液。然后將300μ1 1%BSA/PBS封閉緩沖液加 入每個(gè)孔中并在室溫孵育1小時(shí)。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，去掉封閉緩沖液，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液、測試溶 液和摻入的測試溶液的每種100 μ 1并在室溫孵育90分鐘。然后，去掉反應(yīng)溶液，用洗滌溶 液(PBS/0. 05%吐溫20)洗滌五次。將用1%85々^^5溶液稀釋25，000倍的100 μ 1山羊抗 人IgG Fab特異性的過氧化物酶共軛物(Sigma)加至每個(gè)孔中并在室溫孵育60分鐘。用 上述洗滌溶液洗板五次，將100 μ 1底物溶液(1 1的TMB微孔過氧化物酶底物溶液A和 B的混合物，KPL，USA)加至每個(gè)孔中并在室溫孵育30分鐘。然后，將100 μ 1停止溶液(1Ν H2SO4)加至每個(gè)孔中，在測量波長450nm和參考波長620 650nm測定吸收度從而確定血 樣中抗體的量。結(jié)果顯示于圖4中。如圖4中顯示的，本發(fā)明的抗體處理的組以及抗體和Zeffix共處理的組均顯示抗 體濃度的相似式樣。參考圖4和圖3，重復(fù)出現(xiàn)通過抗體與HBsAg的反應(yīng)而增加和降低抗體 水平(降低和增加HBsAg水平)的循環(huán)。實(shí)施例3 抗體的HBV結(jié)合能力的免疫沉淀分析進(jìn)行了免疫沉淀以檢查本發(fā)明的抗體是否結(jié)合乙型肝炎患者(由Ajou University, School of Medicine, Korea ) i巾白勺 HBV。3-1)乙型肝炎患者血樣的制備用山羊抗人IgG (Fe特異性)瓊脂糖共軛物(Research DiagnosticsInc.， Flanders, NJ)孵育1000 μ 1乙型肝炎患者的血樣(用0. 2% BSA/PBS緩沖溶液稀釋10倍) 以去除免疫球蛋白。3-2)本發(fā)明的抗體與山羊抗人IgG瓊脂糖共軛物的結(jié)合反應(yīng)將10 μ 1本發(fā)明的抗體(0. 1，0. 5，1和5μ g)和PBS與50 μ 1山羊抗人IgG瓊脂 糖共軛物(Research Diagnostics)混合并在室溫?cái)嚢柘路跤?小時(shí)。向其中加入IOmg人 免疫球蛋白(I. V. -Globulin-S,Green Cross，Korea)，將所得的混合物在室溫?cái)嚢柘路跤?小時(shí)以封閉山羊抗人IgG瓊脂糖共軛物的結(jié)合區(qū)。作為比較組，如上述處理源自血的HBV抗 體(Hepabig, Green Cross, Korea)、TT-F9 (抗破傷風(fēng)類毒素人抗體，GreenCross, Korea), 和HuS 10 (抗乙型肝炎病毒表面抗原人源化抗體GreenCross，Korea)的每種中的1 μ g。3-3)抗體結(jié)合的山羊抗人IgG瓊脂糖共軛物和患者血樣的混合物的制備將200 μ 1 3-1)中制備的血樣與3-2)中制備的抗體結(jié)合的山羊抗人IgG瓊脂糖 共軛物混合，將所得的混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)以便使抗體與患者血樣中的HBV進(jìn)行反應(yīng)。3-4) HBV沉淀的分析將3-3)中所得的溶液離心，用上清液進(jìn)行Cobas Amplicor HBVMonitor Test, v2. O (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) UflJ胃 HBVDNA。用0. 2% BSA/PBS緩沖溶液洗滌殘余瓊脂糖10次，并用100 μ 1相同緩沖溶液重 懸，然后加入 5μ1 10% SDS, 2 μ 1 50mM EDTA 和 200 μ g 蛋白酶 K(Sigma-Aldrich)并在 55°C孵育30分鐘。然后，用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)處理上 清液以分離 DNA，使用 LiquiMix GM PCR預(yù)混合液(Neurotics，Korea)，引物M3 (SEQ ID N0: 3)和P0L8(SEQ ID NO 4)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增HBV特異性DNA，PCR在下列條件下進(jìn)行55°C變 性5分鐘；35個(gè)循環(huán)(950C 1分鐘，550C 1分鐘和72°C 1分鐘)；72°C最后延伸10分鐘。在 1.0%瓊脂糖凝膠上分析擴(kuò)增的DNA。結(jié)果顯示于圖5中。在圖5的(a)和(c)中，每條泳 道的被分析的樣品如下圖 5 (a)1 用0. 1 μ g本發(fā)明的抗體處理的組，2 用0. 5 μ g本發(fā)明的抗體處理的組，3 用1 μ g本發(fā)明的抗體處理的組，4 用5 μ g本發(fā)明的抗體處理的組，5 =PBS圖 5 (C)1 =PBS2 用1 μ g TT-F9 (抗破傷風(fēng)類毒素人抗體)處理的組，3 用1 μ g H印abig處理的組，4 用1 μ g HuS 10 (抗乙型肝炎病毒表面抗原人源化抗體)處理的組，5 用1 μ g本發(fā)明的抗體處理的組。如在圖5的(a)和(b)中顯示的，沉淀的HBV的量與用于免疫沉淀的抗體的量成 比例，免疫沉淀后上清液中HBV的量與用于免疫沉淀的抗體的量成反比。另外，當(dāng)使用相同 量的抗體時(shí)，源自血的HBV抗體Ofepabig)由于其弱的HBV結(jié)合能力而不沉淀HBV，而具有 強(qiáng)結(jié)合能力的本發(fā)明的抗體特異性沉淀HBV(見圖5(c))。實(shí)施例4 抗體的HBV結(jié)合能力的免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色以檢查本發(fā)明的抗體是否結(jié)合HBV感染的組織。HBV 感染的人肝組織(Spring Bioscience, Fremont, CA, USA. Catalog No. STS-025)的冷凍片子用丙酮固定并用甲醇稀釋的過氧化氫處理。然后，用正常 的兔血清、抗生物素和生物素順序處理片子。使用Immunoprobe biotinylation kit (Sigma-Aldrich)將本發(fā)明的抗體和同種型陰性對照抗體(人IgGl，Sigma-Aldrich)共軛結(jié)合至生物素，然后在此處理Str印tABComplex/HRP(Dako，Netherlands)。用3，3' -二 氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)將上面的試劑染色并用蘇木精復(fù)染。結(jié)果顯示于圖6中。如圖6中顯示的，同種型陰性對照抗體不結(jié)合HBV感染的人肝組織(見(b))，而本 發(fā)明的抗體強(qiáng)烈地與其結(jié)合(見(a))。雖然已經(jīng)就上面的特定具體實(shí)施方式
描述了本發(fā)明，應(yīng)該認(rèn)識到可作出各種修飾 和改變，所述修飾和改變也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，如接下來的權(quán)利要求所限定的。
權(quán)利要求
一種用于預(yù)防或治療哺乳動物中乙型肝炎病毒(HBV)感染或由此引起的疾病的人抗體的用途，所述抗體包含具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH)和具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(VL)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中抗體從細(xì)胞系HBAb-49(KCLRF-BP-00054)中制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中抗體中和HBV。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中抗體與抗病毒藥物一起使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中抗病毒的藥物選自干擾素、抗HBV單克隆抗體、抗 HBV多克隆抗體、核苷類似物、DNA聚合酶抑制劑、siRNA藥物或治療性疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中以范圍為0.001-10mg/kg (體重)/劑的量給予哺 乳動物抗體。
7.一種預(yù)防或治療哺乳動物中的HBV感染或由此引起的疾病的方法，所述方法包括以 有效量向其給予人抗體，所述抗體包含具有SEQID N0:1的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(VH) 和具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明提供針對乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的人抗體的用途。所述抗體顯示優(yōu)異的中和HBV能力，因此，可以用于預(yù)防或治療HBV感染或由此引起的疾病。
文檔編號A61K39/395GK101878037SQ200880118406
公開日2010年11月3日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者吳宣姃, 奉紀(jì)兌, 崔真設(shè), 張基奐, 徐東赫, 柳憬桓, 洪廣元, 辛庸源, 辛龍男, 金世鎬, 金判勁 申請人:株式會社綠十字