專利名稱：乙型肝炎病毒表面抗原和含有這些抗原的雜種抗原的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒抗原和含有這些抗原的雜種抗原，以及利用DNA重組技術將上述抗原的編碼基因克隆到酵母中。
A.乙型肝炎疫苗乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的和大范圍內的有關鍵康的問題。感染可從急性或慢性階段顯示出來。在美國，急性肝炎病例的數量估計每年至少100，000例，死亡率達1-2%，取決于年齡及社會層次，在康的成人中，乙型肝炎病毒(HBV)慢性攜帶者的普遍程度在0.1-1.0%之間。在南美，MBV慢性攜帶者約為1-3%，在蘇聯和南歐，約為3-6%，而在亞洲和非洲則高于10%。
在發(fā)達國家中，存在著為有高度受傳染危險的人們提供疫苗的需求，例如病人和醫(yī)療單位接觸血液的全體人員、軍人、慢性病毒攜帶者的配偶，到高HBV地方性流行區(qū)域去的旅游者，慢性病毒攜帶者的新生嬰兒，同性戀者，娼妓和吸毒者。在第三世界國家中，也需要一種能夠用于公眾免疫的便宜的設備。公眾免疫項目，不僅能夠最大地影響急性肝炎的發(fā)病率和慢性肝炎病毒攜帶者的數量，而且還能夠減少慢活性的肝炎和肝癌的發(fā)病率及死亡率。
從傳染的病人身上分離出來的戴恩(Dane)顆粒，據信為乙型肝炎病毒顆粒，其直徑約42nm。每一顆粒都是由一個以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)構成的包膜，一種外殼(HBcAg)，一種由內源多聚酶和一個DNA基因組組成的。它的基因組是環(huán)狀和雙鏈的具有一個含有約200個堿基的單鏈區(qū)域。在體外，借助于內源多聚酶作用，能把單鏈區(qū)域補齊。較長的鏈含有約3200個堿基。
長期以來，由于人們知道很難在組織培養(yǎng)中繁殖病毒，并且認為人是唯一已知的寄主，所以制備HBV疫苗是困難的。然而在實驗室中黑猩猩也可以被此病毒傳染。
Valenzuela等人(Nature，298，347-350，1982)報導在酵母中使用一種表達載體進行了HBsAg的生物合成。載體中HBsAg編碼序列是一個835堿基對(bP)的TaqⅠ-HpaⅠ片段，并且其啟動子是酵母醇脫氫酶Ⅰ的啟動子。幾個早期簡短報告提及到以前這方面的研究工作，這些是Valenzuela等人(Arch.Biol.Med.Exp.(Chile)，14(1)21-22，1981)報導了在酵母中把一個含有編碼與HBsAg相似的蛋白的序列連接到酵母醇脫氫酶啟動子區(qū)域的DNA片段進行表達;在〔Scrip.No.616.P14(Aug.12，1981)〕中的一個報導述及一個美國研究小組(包括P.Valenzuela和W.J.Rutter在內)已經宣布，從酵母中制備了“蛋白外殼包圍的乙型肝炎病毒”;并且Zuckerman(Nature.295，98-99，1982)報導了W.J.Rutter已經報導了糖基化的HBsAg在酵母細胞中的表達。
據報導，HBV的抗原組成成份，如HBsAg已經通過插入一個含有該抗原的編碼基因的重組DNA分子，從細菌中制備出來了。Burrell等人(Nature，279，Number.5708，43-47，1979)報導克隆于質粒PBR322中的HBVDNA序列在大腸桿菌(E.coli)HB101中得到表達。
Murray等人在歐洲專利申請公布，第13，828號，1980年(EuropeanPatentApplicationPublicationNumber13，828，1980)中公開了，在大腸桿菌HB101菌株中制備了一種能夠為含有HBsAg的HBV抗原編碼的重組載體。此載體是從戴恩顆粒(Dane)DNA和質粒PBR322制備出來的。作者指出，雖然在應用中做為范例只用大腸桿菌做寄主，但可使用的寄主還包括細菌，酵母，其它真菌，動物或植物細胞以及其它寄主。
Charnay等人(Nature，286，893-895，1980)報導了一種攜帶β-半乳糖苷酶基因HBsAg結構基因的融合體的噬菌體的構建。該噬菌體直接合成一種由HBsAg和β-半乳糖苷酶的抗原決定簇組成的融合蛋白。
Tiollais等人在英國專利申請No.2，034，323公開制備了一種含有HBVDNA的大腸桿菌噬菌體。融合的噬菌體一HBVDNA被轉化到大腸桿菌C600菌株中。
在英國專利申請2，070，621號中公開了一種質粒是由部分HBsAg基因和啟動子以及乳糖操縱子的Z基因組成的，并且可以被克隆到大腸桿菌中。
Rutter等人在歐洲專利申請公布No.20，251，1980公開了含有一種由質粒PBR322和HBVDNA的BanHⅠ酶切片段構成的一些重組載體可被用于轉化大腸桿菌。另一種由HBVDNA的BamHⅠ酶切片段以及色氨酸操縱子的一部分組成的載體，也曾在大腸桿菌HB101菌株中得到表達。
Edman等人(Nature，291，Number5815，503-506，1981)描述了一些質粒的構建，在色氨酸操縱子調控區(qū)域的控制下，這些質粒在大腸桿菌中直接合成了一種β-內酰胺酶一HBsAg融合蛋白。
Pumpen等人(Gene，30，201-210，1984)公開了在大腸桿菌中合成了少量的HBsAg單體蛋白和一些融合蛋白。且用變性HBsAg單體誘導產生的抗體進行檢測。
其它文獻公開了HBVDNA插入到細菌中，包括Charnay等人(Prog.Med.Virol.27.88-92，1981);Mackay等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.78.No.7，4510-4514，1981);Fritsch等人(C.R.Acad.Sci..287.No.16，1453，1978);英國專利說明書2，034，323(DerwentNo.46874C)和Pasek等人(Nature.282，No.6，575，1979)。
HBVDNA還被克隆到哺乳動物細胞中，這些細胞包括人類，小鼠和人類癌細胞系。例如Dubois等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，77.No.8，4549-4553，1980)報導了用含有HBV基因組質粒進行的小鼠細胞的轉化和HBsAg的表達;Hirschman等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，77.No.9，5507-5511，1980)報導由HBVDNA進行轉化的HeLa細胞產生了一些類HBV的顆粒。
Funakoshi等人(Prog.Med.Virol.，27，163-167，1981)以及Maupas等人(Prog.Med.Virol.，27，185-201，1981)報導了使用來自人血液的HBsAg制備HBV疫苗的步驟。Funakoshi等人制備的疫苗含有40μg純化的、福爾馬林處理的HBsAg，磷酸鹽，氯化鈉，20mg甘露醇，且用0.1%的氫氧化鉛作為佐劑。在以后的文獻中Maupas等人報導一個劑量的疫苗是1ml純化的、福爾馬林處理的HBsAg含有2-10μg/ml的蛋白(Lowry方法)和0.1%氫氧化鋁。Maupas等人的研究報導中使用的方案，即免疫一年以后，用注射器以一個月為間隔注射二次進行強化;一些作者們提出了一種以三個月為間隔注射二次濃縮的HBsAg的方案。
另外有關制備HBV疫苗的文獻包括Maupas等人，Adamowicz等人;Funakoshi等人，分別在Maupas和Guesry，1981年編寫的“乙型肝炎病毒INSERM專題討論會No.18(Elseriver/North-HollandBiomedicalPress)中的第3，37和57頁上。
酵母已經被用來作為某些其它非HBVDNA序列表達的寄主，例如Fraser等人在英國專利申請第2，068，969號中公開了在酵母中制備雞卵清蛋白，(ScripNo.640，P.11Nov，4，1981)有一篇關于在酵母中制備了一種類型的干擾素的報導。在歐洲專利11，562(DerwentNo.38762C)中報導了含有2μ質粒中的ura酵母基因的雜種酵母質粒。
真正的乙型肝炎病毒表面抗原可以從被傳染的個體的胞漿中發(fā)現，是一種大約22nm的顆粒，由兩種已知為P24蛋白和它的糖基化衍生物GP28組成。此兩蛋白認為是S蛋白密碼序列的位于HBV基因組上的226個氨基酸密碼序列來編碼的。直接位于HBV基因組上的S蛋白密碼序列前的全部163個氨基酸密碼序列被劃歸為PreS密碼序列。直接位于S蛋白密碼序列前的PreS密碼序列的55個氨基酸被劃歸為PreS2密碼序列，而PreS密碼序列剩下的108個氨基酸則劃歸為PreS1密碼序列。PreS密碼序列或任何較小區(qū)域都劃歸為HBsAg前體蛋白序列。
從整體上講，應注意到對于某些HBV亞型(如，ayw)，完整的Pre S密碼序列是163個密碼子，而對于其它HBV亞型(如adw2)，完整的Pre S密碼序列是174個密碼子。在此兩種情況下，Pre S區(qū)域是直接位于S蛋白密碼序列前的55個密碼子。
從戴思(Dane)顆粒表面和從HBV傳染的病人血清中分離到的一些HBsAg顆粒表面上發(fā)現的多聚清蛋白偶聯或受體位點是由PreS2密碼序列編碼的。雖然PreS2區(qū)域直接位于HBV基因組上的S蛋白密碼區(qū)域前，但是PreS2區(qū)域不涉及HBsAg顆粒的裝配。參看，例如Persing等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，3440-3444，1985)。
Valenzuela等人(Nature，298，347-350，1982)公開了在含有S蛋白密碼序列的載體轉化的酵母細胞被裂解之后，發(fā)現了一些類似于HBsAg的顆粒，并得出結論HBsAg顆粒是在酵母中合成的。
Harford等人(DevelopmentsinBiologicalStandardization，54，125-139，1983)公開了用一種載體轉化酵母細胞裂解之后，發(fā)現了一些類似于HBsAg的顆粒，此載體含有直接位于S蛋白密碼序列前的PreS2密碼序列的N-末端42個氨基酸直接前面的鳥氨酸甲酰基轉移酶編碼序列的18個氨基酸。
Laub等人(J.Virology.，48(1).271-280，1983)公開了包括PreS-S蛋白編碼序列的大部分HBV基因組DNA的猴病毒40(SV40)的早期取代載體的構建，和由這載體轉化的CV-1細胞(COS細胞)轉化的SV40中此部分的表達。
Stibbe等人(J.Virology.46(2)，626-628，1983)公開了一些較小的被稱做GP33和GP36的HBsAg多糖蛋白是由PreS2-S蛋白編碼序列編碼的。Stibbe等(Dev.Biol.Stand.，54，33-43，1983)公開了與幾乎缺失GP33和GP36的那些HBsAg顆粒相比，含有大量GP33和GP36的HBsAg顆粒并沒有導致較高的抗S蛋白抗體的滴度。
Heerman等人(J.Virol.52(2).396-402，1984)公開了S蛋白編碼序列和PreS密碼序列組成的全部389個氨基酸編碼序列是為多肽-P39編碼的，而P39是以在HBV顆粒和病毒表面抗原絲中的其糖基化的形式GP42和與多肽P24，GP27，GP33和GP36相關的其它的HBV表面抗原形式被發(fā)現的。
Neurath等人(Science，224，392-394，1984)公開了具有PreS2密碼序列的26氨基末端氨基酸序列的多肽作用為免疫原，并且假設，由免疫原誘發(fā)產生的抗體可以被用來進行特征實驗。
Michel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81.7708-7712，1984)公開了HBsAg的生物合成，而HBsAg具有由攜帶PreS2-S蛋白編碼序列質粒進行轉染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中人血清多聚清蛋白的接受子。
Persing等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82.3440-3444，1985)公開了用PreS2-S蛋白編碼序列轉化的小鼠L細胞產生三種與多肽(24，000，27，000，和35，000道爾頓)相關的HBsAg。而這三種HBsAg都可以被列為直徑22nm，偶聯到聚合的人血清清蛋白(HSA)上的復雜免疫反應的HBsAg顆粒類型中。經受了PreS2區(qū)域接近3′末端移碼突變的PreS2-S蛋白編碼序列轉化的小鼠L細胞，只能產生能被列為不能偶聯HBA的22nm直徑免疫反應HBsAg顆粒類型中的24，000和27，000道爾頓的多肽。Persing等人得出結論PreS2-S蛋白密碼序列為35，000道爾頓多肽編碼，而認為HBsAg的HSA偶聯活性需要PreS2蛋白，而對于HBsAg顆粒的裝配和分泌是不需的。還認為HBsAg的主要多肽(如24，000道爾頓)并不是由PreS2-S蛋白編碼序列所編碼的前體物(如27，000和35，000道爾頓肽類)的剪切初步衍生而來的。
Milich等人(Science，228，1195-1199，1985)公開了由含有Pre S2-S蛋白密碼序列的質粒轉染的中國倉鼠卵巢細胞制備的含有Pre S2和HBsAg的包括HBV顆粒的疫苗，與只含有HBsAg的疫苗相比，對于某一種小鼠能夠避免不反應性的發(fā)生。而且認為，由Pre S2-S蛋白密碼序列的33，000道爾頓多肽的NH2-末端的26個氨基酸殘基代表了Pre S2區(qū)域上的抗體優(yōu)先偶聯位點。
Michel等人“疫苗86”(Vaccines86)見Brown等人主編，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory(1986)，359-363。討論了含有PreS區(qū)域表達產物的乙型肝炎病毒表面抗原顆粒在CHO細胞中的生物合成。
Neurath等人(Nature，315，154-156，1985)公開了PreS2區(qū)域為被肝細胞特異識別區(qū)域的HBV外殼上的蛋白編碼;PreS2-S蛋白密碼序列為HBV顆粒中的一種蛋白編碼;與編碼PreS蛋白基因相關的合成的肽是致免疫的，并得出結論，HBV疫苗應含有PreS因子。
Valenuzela等人(Biotechnology，3.317-320，1985)公開了用這種密碼序列進行轉化的酵母中完整PreS2-S蛋白密碼序列的表達;還公開了在這種酵母細胞中合成了一種含有HBsAg和PreS2的顆粒，此顆粒的電子顯微鏡學和沉積作用的性質與只含有HBsAg的顆粒非常相似。還提出PreS2區(qū)域不影響形成類似于22nmHBsAg顆粒的那一種顆粒的能力。Valenzuela等人還公開了已經假設，通過偶聯多聚清蛋白到其多聚清蛋白受體上，而受體又依次偶聯到肝細胞上而使HBV基因進入肝細胞，這樣病毒得到內在化(internalized)，并且HBV的多聚清蛋白受體是由PreS2區(qū)域編碼的。Valenzuela得出結論含有PreS2的疫苗將會誘導抗體的產生，另外通過常規(guī)機制使HBV失活，此抗體能夠影響病毒進入肝細胞的途徑。
TakedaChemicalInd.KK在歐洲專利申請公布號171.908-A中聲稱，在酵母中進行了非糖基化的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白的生產。
Chiron公司，歐洲專利申請公布號0，174，444A2提出一種從酵母中制備一些含有P31蛋白的HBsAg顆粒的方法。
下述表Ⅰ對已知的PreS2區(qū)域的氨基酸序列與發(fā)明題目中的HBVPreS2區(qū)域氨基酸序列進行了比較表1HBV的不同血清型PreS2區(qū)域的氨基酸序列比較HBVPreS2編碼區(qū)域亞型-55-50-40-30-20-100參考adwMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSARTGDP編碼序列adwTLI1adwLLII2adw-I3adwKI4adrTLVTTPIFSAP5adrTLVTTPISAP6aywTTVLTTPLIFSIAL7adywHTTVTTTPIFSIAL8
氨基酸縮寫符號AspD天冬氨酸IleI異亮氨酸ThrT蘇氨酸LeuL亮氨酸SerS絲氨酸TyrY酪氨酸GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸ProP脯氨酸HisH組氨酸GlyG甘氨酸LysK賴氨酸AlaA丙氨酸ArgR精氨酸CysC半胱氨酸TrpW色氨酸ValV纈氨酸GlnQ谷氨酰胺MetM甲硫氨酸AsnN門冬酰胺參考文獻1.Valenzuelaetal.，InAnimalVirusGenetics(Field，JaenischandFoxeds)p.57-70，AcademicPress，NewYork(1980).
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B.瘧疾疫苗最近大量研究提出在一個被瘧原蟲(Plasmodium)的某一種的子孢子階段侵染的敏感寄主中的保護免疫可以通過此寄主產生的抗體傳遞到某一子孢子的環(huán)狀體蛋白(CS蛋白)。
幾種類型的瘧原蟲的子孢子蛋白已被克隆出來，并且其中一些已通過重組DNA技術表達出來。
Nusserzweig等人(U.S.專利4，466，917)公開了一種子孢子多肽，鑒定為P-44蛋白，克隆到大腸桿菌中并表達。
Sharma等人(Science，228，879-882，1985)公開了在酵母中通過使用含有酵母醇脫氨酶I基因的5′調節(jié)區(qū)域代替諾氏瘧原蟲(Plasmodiumknowlesi)cs基因序列的5′上游區(qū)域的表達載體表達了諾氏瘧原蟲的一部分cs蛋白。
紐約大學PCT申請公布號WO84-02922-A發(fā)表了為諾氏瘧原蟲環(huán)狀體蛋白重復單位編碼的一部分編碼序列的克隆及β-內酰胺酶和β-半乳糖苷酶融合體在大腸桿菌中的表達。
Kemp等人，PCT專利申請公布號WO84-02917-A公開了來源于惡性瘧原蟲的血液生長階段的cs蛋白的編碼序列克隆到大腸桿菌中并表達。
Dame等人(Science，225，593，1984)公開了惡性瘧原蟲cs蛋白克隆到大腸桿菌中并表達，此蛋白質被描述為含有分子量近44，000的有約412個氨基酸的蛋白質。它由41個四肽的串聯重復組成。合成的那種結合于單克隆抗體上的重復區(qū)域的7-，11-和15-殘基肽能抗cs蛋白。
Ellis等人(Nature，302，536-538，1983)公開了在大腸桿菌中β-內酰胺酶與諾氏瘧原蟲cs蛋白融合的表達。
Enea等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，7520-7524，1984)公開了在一種瘧原蟲(P.cynomolgi)cs蛋白中的類似的重復單位結構，cs蛋白克隆到大腸桿菌中并表達，并公開了它的編碼序列。
Ballou等人(Science，228，996-999，1985)公開了結合到牛血清蛋白(BSA)或產生抗體的甲狀腺球蛋白上的惡性瘧原蟲cs蛋白重復區(qū)域的合成多肽，可以在小鼠及兔子體內產生應答。并推斷出抗瘧疾寄生蟲子孢子階段的疫苗能使用結合到載體蛋白的cs蛋白重復區(qū)域的合成肽來完善。
Weber等人(MolecularandBacterialParasitology，15，350-316，1985)公開了把惡性瘧原蟲(P.galciparum)的巴西菌株的克隆了的cs蛋白基因作為一種探針通過核酸雜交來分析其他17株惡性瘧原蟲的結構，并推斷cs蛋白基因是高度保守的，用cs蛋白的瘧疾疫苗的發(fā)展不會由于菌系的變化而復雜化。
Arnot等人(Science，230，815-818，1985)公開了間日瘧原蟲(P.vivax)的cs蛋白的克隆，并且公開了其全部編碼序列，并推斷間日瘧原蟲的cs蛋白編碼序列和諾氏瘧原蟲的cs基因同源，但和惡性瘧原蟲不同源。
Sharma等人(Science，229，779-782，1985)公開了諾氏瘧原蟲的Nuri菌株的cs基因編碼區(qū)域的全部核苷酸序列。
Young等人(Science，228，958-962，1985)公開了具有潛在應用于人類瘧疾疫苗的惡性瘧原蟲cs蛋白在大腸桿菌中的表達。
Walter和ElizaHall醫(yī)學研究所PCT專利申請公布號WO84/02917，1984公開了人工構建的多核苷酸序列大體上與所有或一部分惡性瘧原蟲mRNA或基因組DNA相對應;對應這種序列的肽和它的生產方法;在含有這種肽的脯乳動物中為刺激抗惡性瘧原蟲這一抗原的免疫反應的組分。
Mazier等人(Science，231，156-159，1986)指出在用惡性瘧原蟲環(huán)狀體蛋白的幾種重組和合成肽免疫了的老鼠中產生的抗體由于在人肝細胞培養(yǎng)系中的保護活性而受到評價，并發(fā)現此抗體顯示出對抵御寄生蟲在三個階段有保護效果子孢子吸附到肝細胞表面，進入，以及以后向胞內發(fā)展。
c.多價疫苗Valenzuela等人(Biotechnology，3，323-327，1985)公開了把由PreS2編碼序列所編碼的HBsAg多聚白蛋白受體用作一種工具來制備多價疫苗。Valenzuela等人也公開了由酵母中表達雜交體HSV-1gD-PreS2-S蛋白編碼序列制備雜種HBsAg一皰疹單式1病毒糖蛋白D(HSV-1gD)粒子。
Valenzuela，在“使用重組DNA技術乙型肝炎亞基疫苗”文中，5月15日，在BostonMassachussetts召開的Bio-Expo-5-會議，報導用如以上所述的HBsAg-HSV-1gD粒子這樣的雜種，有一個出現在其表面的外部免疫源上的HBsAg免疫優(yōu)勢的問題。
Chiron公司，歐洲專利申請公布號0，125，261聲稱含有融于一個或多個寡肽的乙型肝炎表面抗原至少一個主要部分的雜交粒子，在那里雜交多肽能在細胞寄主內形成粒子，有至少一個寡肽的至少一個抗原決定簇出現。
蛋白質能夠經過翻譯后的修飾，使其中一些蛋白深深地受到影響，即影響蛋白質的構象和功能。在人體中寡糖鏈的存在衍生出PreS1-PreS2-S和PreS2-S蛋白(Heermanetal，inJ.Virol.，52，396-402，1984;StibbeandGerlichinVirology，123，436-442，1982;StibbeandGerlichinJ.Virol.，46，626-628，1983)，可能PreS1-PreS2-S蛋白上的豆蔻酸(Persingetal.，Abstractsofpaperspresentedatthe1986meetingonMolecularBiologyofHepatitisBviruses，August28-31，1986，ColdSpringHarborLaboratory)的存在能影響粒子的形成及粒子中蛋白質的構象以及這些粒子的抗原性和免疫原性。
酵母(Saccharomycescerevisiae)也具有類似于高等真核細胞的蛋白質糖基化(Ballou，“TheMolecularBiologyoftheYeastSacch-aromyces，MetabolismandGeneExpression”;Strathern，JonesandBroachEd.，ColdSpringHarborLaboratory(1982)，P.335-360)和脂肪酸酰化作用(TowlerandGlaslerinProc.Natl.Acad.Sci.，83，2812-2816，1986)的酶作用能力。
已經發(fā)現，在酵母中表達的病毒表面糖蛋白被糖基化了，Jabbar等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，82，2019-2023，1985)指出流感病毒血細胞凝集素基因在酵母中的表達導致了糖基化的血細胞凝集素蛋白。Wen和Schlesinger(Proc.Natl.Acad.Sci.，83，3639-3643，1986)指出Sindbis和皰狀口炎病毒糖蛋白在酵母中以糖基化形式表達這些病毒蛋白。Fujisawa等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses，Auguest 28-31，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.62)指出Pre S2-S基因在酵母中的表達導致了Pre S2-S蛋白兩個糖基化形式的合成。Kniskern等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Modern Approaches to New Vaccines，Including Prevention of AIDS，September 9-14，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.89)指出Pre S1-Pre S2-S基因在酵母中的表達導致了45KD和39KD的兩個Pre S1-Pre S2-S蛋白的合成。Persing等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses，August 28-31，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.19)指出用3H豆蔻酸標記的表達Pre S1-Pre S2-S，Pre S2-S和S蛋白的COS7細胞導致在Pre S1-Pre S2-S蛋白上存在標記。
在酵母中表達并在粒子中重新組裝的融合蛋白可以用普通的方案純化Aerosil的吸附作用和解吸附作用(1)→CaCl沉淀作用(2)→苯基瓊脂糖或苯基硼化-瓊脂糖的吸附作用和解吸附作用(3)→CsCl梯度離心或DEAE-離子交換色譜。
在EP申請公布0204680號中描述了第一步，在EP申請公布0199698號中描述了第3步。至于苯基瓊脂糖也提到了。第(1)步和第(3)步的特殊聯合可以完成快速的污染物清除。(排除達90%蛋白質，碳水化合物和50%的脂類)。這種新的聯合使下一步色譜更好地發(fā)揮作用成為可能。
在融合蛋白被糖基化的例子中，苯基硼化物(PBA)被用作為一種親和吸附劑。在pH9.0微，硼化物基團同糖基化了的側鏈上的潛在順-二醇基團共價化合。PBA凝膠偶爾被用于可溶糖蛋白的純化但不用于鑲嵌于脂雙層的糖蛋白的粒子的純化(See，Cook，etal.，AnalyticalBiochemistry，149，349-353，1985;Middle，etal.，BiochemicalJournal，209，771-779，1983;Cook，etal.，BiochimicaetBiophysicaActa，828，205-212，1985;Maestasane，etal.，JournalofChromatography，189，225-231，1980)。由于粒子上的多配住體連接位點，可使用非常低PB-配位體濃度的PBA凝膠，例如含硼化物(boronate)的PBA凝膠＜10ug/ml凝膠，最好是5ug硼化物/ml凝膠。具有非常低硼化物含量的苯基硼化物凝膠的可用作含有鑲嵌糖蛋白粒子的親和層析。
本發(fā)明涉及和含有一步步融于乙型肝炎病毒PreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域的功能DNA編碼序列的重組DNA分子。這里所用的術語“編碼序列”或“編碼區(qū)域”也包括任何它的功能衍生物。術語“功能衍生物”是指在適當的地方，不干擾粒子形成和/或在希望保留的地方保護免疫原性的有氨基酸改變的編碼序列。這種功能衍生物可以用常規(guī)位點特異誘變來制備，如用Botstein等人的方法(Science，229，1193-1201，1985)。這種DNA分子也含有一個來源于酵母arg基因的調節(jié)區(qū)域就更好。
本發(fā)明涉及含有有效地連結于調節(jié)區(qū)域的重組DNA分子的重組載體。在這個DNA分子中含有一步步融合于HBVPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域的功能DNA編碼序列。此處用的術語“調節(jié)區(qū)域”指的是含有啟動子區(qū)域和編碼序列的轉錄和翻譯所必需的其他序列的DNA序列。
本發(fā)明也涉及用重組載體轉化的真核寄主細胞。在所謂的載體中含有有效地連接于調節(jié)區(qū)域的DNA分子，在所謂的DNA分子中含有一步步融合于HBVPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域功能DNA編碼序列。這項發(fā)明也和制備這種含有用重組載體轉化真核寄主細胞的轉化寄主細胞的方法有關。
本發(fā)明也涉及制備含有HBsAg蛋白的雜種粒子的方法。這個HBsAg蛋白含有和/或代表一個功能DNA編碼序列所編碼的多肽，也包括在適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用重組載體轉化的真核寄主細胞和從細胞裂解產物或寄主培養(yǎng)液的提取液中分離粒子。在所謂的載體中含有有效地連接于調節(jié)區(qū)域的DNA分子，在DNA分子中含有一步步融于HBVPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域的功能DNA編碼序列。
本發(fā)明也涉及含有乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)粒子的雜種致免疫粒子。HBsAg粒子含有和/或代表一個功能DNA編碼序列所編碼的肽。
本發(fā)明也涉及含有這種雜種粒子的免疫保護量的疫苗。
本發(fā)明也涉及含有雜種粒子及多價吸附劑(polysorbate)的膠團，和含有這種膠團的免疫保護量的疫苗。
術語“功能DNA編碼序列”是指一段DNA編碼序列，它在一步步融合于DNAPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域時，不涉及，也不干擾HBsAg粒子的組裝。
較好的功能DNA編碼序列包括，但并不限制于(a)整個HBVPreS蛋白編碼序列，或它的致免疫衍生物，比如，不限制于，PreS2，PreS1或PreS1-SPreS2蛋白編碼序列;和(b)其他的致免疫編碼序列列，諸如瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白編碼序列，或任何它的致免疫衍生物，HIV的包膜基因編碼序列，或任何它的致免疫衍生物，特別是C7肽，肽121或Dreesman肽編碼序列或它的一個致免疫衍生物。
本發(fā)明也涉及編碼以下氨基酸序列的HBVPreS1蛋白編碼區(qū)域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIleProCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGly
AGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla或涉及HBVPreS2蛋白編碼區(qū)域，或涉及在它的PreS2部分中為以下氨基酸編碼的HBVPreS2-S蛋白編碼區(qū)域-55-50Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40-30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn;a也涉及含有這種有效連接于調節(jié)區(qū)域的PreS1，PreS2或PreS2-S蛋白編碼區(qū)域的重組DNA載體;同含有這種載體的轉化寄主細胞;同這種含有用此載體轉化寄主細胞的轉化細胞的制備過程;同這種編碼區(qū)域編碼的蛋白質;同制備這種蛋白質的過程;同含有這種蛋白質免疫保護量的疫苗;同這種PreS2-S蛋白編碼區(qū)域編碼的粒子;同準備這種粒子的過程;同含有這種粒子免疫保護量的疫苗，和含有這種粒子和多價吸附劑的膠團，以及含有這種膠團免疫保護量的疫苗。
本發(fā)明也涉及重組DNA載體有關，這種重組DNA載體含有整個PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列，或它的有效連結于調節(jié)區(qū)域的致免疫衍生物，與用這種載體轉化的酵母寄主細胞;與制備含有用這種載體轉化的酵母寄主細胞的轉化的寄主的方法;與制備蛋白的方法，這個蛋白是由PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或由PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列，或由它的致免疫衍生物編碼的;與用這種方法制備的蛋白質有關;與含有這種免疫保護量的蛋白質的疫苗有關;與含有多肽的粒子有關，這種粒子是由PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列或它的致免疫衍生物所編碼的;與它的制備方法，含有這種粒子的免疫保護量的疫苗，含有這種粒子和多價吸附劑的膠團以及含有這種膠團免疫保護量的疫苗有關。
本發(fā)明也同PreS1-PreS2蛋白編碼序列或者是它的PreS1-PreS2部分含有以下氨基酸序列的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列有關PRE-S1區(qū)域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAsp
TGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIleProCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla
Pre-S2區(qū)域-55ATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAMetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGAlaLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGATyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTThrValAsnProAlaProAsnIleAlaSerCACATATCGTCAAGCTCCGCGAGGACTGGGHisIleSerSerSerSerAlaArgThrGlyGACCCTGTGACGAACAspProValThrAsn
這項發(fā)明也同含有新的有效連接于表達控制序列的PreS1-PreS2或PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列的重組載體有關，同用此載體轉化的寄主細胞有關;同制備含有用載體轉化寄主細胞的轉化的寄主的方法有關;與制備PreS1-PreS2或PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或它的致免疫衍生物所編碼的蛋白質的方法有關;與用這種方法制備的蛋白質有關;與含有這種免疫保護量的蛋白質的疫苗有關;與含有PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或它的致免疫衍生物所編碼的多肽的粒子有關;與它的制備方法，含有這種粒子的免疫保護量的疫苗，與含有這種粒子和多價吸著物的膠團有關。
以下描述了用在這個申請中的氨基酸縮寫符號Asp天冬氨酸Ile異亮氨酸Thr蘇氨酸Leu亮氨酸Ser絲氨酸Tyr酪氨酸Glu谷氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸His組氨酸Gly甘氨酸Lys賴氨酸Ala丙氨酸Arg精氨酸Cys半胱氨酸Trp色氨酸Val纈氨酸Gln谷氨酰胺Met甲硫氨酸Asn門冬酰胺附圖簡要說明

圖1是pRIT10601的限制性內切核酸酶圖譜。
圖1A是說明制備pRIT12662的流程圖。
圖1B是乙型肝炎病毒包膜區(qū)域的圖解限制圖譜。
圖2是pRIT10616的限制性內切核酸酶圖譜。
圖2A列出了克隆λMPf1的圖解限制圖和序列分析策略。
圖2B說明了質粒pRIT12893的結構。
圖3是pMC200的限制性內切核酸酶圖譜。
圖3Aa、圖3Ab、圖3Ac、圖3Ad、圖3Ae、圖3Af列出了惡性瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白基因的核苷酸序列。
圖3B說明了質粒pRIT12897的結構。
圖4是插入于質粒pMC200的酵母DNA的一部分3300bpHindⅢ核苷酸序列。在pMC200中一部分含有HincⅡ，BgⅢ和EcoRⅠ位點。
圖4Aa、圖4Ab列出了pRIT12792的含有PreS1-PreS2DNA編碼序列。
圖4B說明了質粒pRIT12899的結構。
圖5是說明制備pRIT10671和pRIT10673的流程圖。
圖5A說明了質粒pRITX的結構。
圖6是說明制備pRIT10749的流程圖。
圖7是說明制備pRIT10761和pRIT10764的流程圖。
圖8a、圖8b、圖8c是說明制備pRIT10167(例1)，pRIT10518和pRIT10162(例3);pRIT10157，pRIT10677和pRIT10909(例4);pRIT10911(例5);pRIT10679，pRIT10903，pRIT10914(例6);pRIT12211，pRIT12209和pRIT12230(例7);以及pRIT12288和pRIT12322(例8)的流程圖。
圖9是pRIT10172的限制性內切核酸酶圖譜。
圖10是pRIT12290的限制性內切核酸酶圖譜。
圖11是闡明它的一部分來源于pRIT12230和pRIT12288和pRIT12322的限制性內切核酸酶酶切圖譜。
圖12a、圖12b是說明制備pRIT12571;pRIT12573;pRIT12572和pRIT12574的流程圖。
圖13是pRIT12309的限制性內切核酸酶圖譜。
圖14是說明制備pRIT12314和pRIT12544的流程圖。
圖15是說明制備pRIT12658的流程圖。
圖16是pRIT12662的限制性內切核酸酶圖譜。
圖17是說明制備pRIT12660的流程圖。
圖18是說明制備pRIT12845(a，b，c，d，e，f)的流程圖。
HBsAg在酵母中的表達這里所用的“調節(jié)區(qū)域”是指含有一個為編碼序列的轉錄和翻譯所必需的或期望的DNA序列。這種調節(jié)區(qū)一般是處于5′端與要表達的編碼序列相連。較好的是，含有轉錄終止信號酵母DNA的更遠區(qū)域其位置緊接于要表達的3′編碼區(qū)域，所以對轉錄終止有作用。
這里所用的“HBsAg”是指含有HBV基因組的S蛋白編碼序列所編碼的蛋白質的抗源。這個HBsAg，其結構類似于真正的HBsAg或者實質上有同真正的HBsAg一樣的編碼抗原決定簇的相同S蛋白編碼序列，也就是說，它能促進特異地辨認真正的HBsAg和同真正的HBsAg反應的免疫反應，或者是它可被抗-HBsAg抗體所特異辨認。
HBsAg編碼序列可以從感染了的人血清中的戴思(Dane)粒子提取出的DNA而分離得到。這種DNA是通過用DNA多聚酶，內源多聚酶更好，填齊單鏈區(qū)域，然后用限制性內切核酸酶消化而制得的。內切核酸酶的選擇部分取決于特殊的戴恩粒子。比如，adw血清型的某種戴恩粒子的HBVDNA的HBsAg編碼序列可以從一個單獨的BamHⅠ酶解片段上分離得到;ayw血清的某種戴恩粒子的HBVDNA的HBsAg編碼序列可以從HhaⅠ酶解片段分離得到。同樣血清型的戴恩粒子的HBVDNA也顯示了限制性位點的不同類型。
制備此發(fā)明中所用的DNA片段的DNA的限制性，制備此發(fā)明中所用的重組DNA分子的這種片段的的連接性以及插入到微生物中都是應用已知的技術諸如發(fā)表在前面和后面的標出的參考文獻中的技術來進行的。選擇避免DNA和酶變性的條件。比如，pH用緩沖液保持在7.0到11.0之間，溫度保持在60℃以下。限制性最好在約30到40℃之間的溫度進行，連接最好在0到10℃之間進行。在進行此發(fā)明中使用的限制內切酶和連段序列，它是一個或者保持或者提高天然序列的保護性致免疫活性的自然發(fā)生序列的衍生物或修飾的部位(version)。這種致免疫衍生物可以用常規(guī)的技術來制備。這里所用的術語“PreS2，PreS1，或整個PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列”包括它的任何致免疫衍生物。
術語“瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白”是指瘧原蟲子孢子上的免疫優(yōu)勢表面抗原或它的致免疫衍生物。有用的環(huán)狀蛋白它包括，但不限制于那些來源于惡性瘧原蟲，間日瘧原蟲，卵園瘧原蟲(P.ovale)和四日瘧原蟲(P.malariae)的蛋白。惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵園瘧原蟲和四日瘧原蟲侵染人類。
在Science，225，593-599(1984)Dame等人報導了惡性瘧原蟲的cs蛋白編碼序列。在Science，230，815-818(1985)上Arnot等人報導了間日瘧原蟲的cs蛋白編碼序列。在Science，229，779-782(1985)上Sharma等人報導了諾氏瘧原蟲的cs蛋白編碼序列。在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7520-7524(1984)上Enea等人報導了P.cynomolgi的cs蛋白編碼序列。瘧原蟲的其他種的cs蛋白編碼序列已為人所知(見上面提到的參考書)和/或可用常規(guī)的技術獲得。
如這里所用的，術語“csp”或“cs蛋白”將包括瘧原蟲天然的、全長度環(huán)狀體蛋白以及它的任何致免疫衍生物。術語瘧原蟲環(huán)狀體蛋白的“致免疫衍生物”是指(a)保留保護致免疫活性的瘧原蟲環(huán)狀蛋白的衍生物或(b)來源于保留保護致免疫活性的瘧原蟲環(huán)狀體蛋白的修飾了的編碼序列的蛋白質。這種致免疫衍生物可以用常規(guī)的技術來制備。一些惡性瘧原蟲的cs蛋白編碼序列的致免疫合成衍生物在Ballou等人的文章中透露出來，Science，228，996-999(1985)。也可參看，Mazier等人.，Science，231，156-159(1986)。
瘧原蟲的各個種的cs編碼序列是已知的并可用已知的技術來制備或分離。〔參看，如Colman等人，WO84-02922-A(惡性瘧原蟲cs蛋白)和來的氨基酸殘基。
本發(fā)明的一個實施例是HBsAg，編碼序列和HBsAg前體(Pre S-S)蛋白的42密碼子在從arg3啟動子所翻譯的酵母OCT蛋白編碼序列的第18個氨基酸之后一步步地融合。這樣構想給適當的S-蛋白的226個氨基酸與含有包括另外的60N-末端氨基酸的HBsAg蛋白的雜種粒子。
一個典型的調節(jié)區(qū)域是從為鳥氨酸甲酰氨基轉移酶(OCT)編碼的酵母arg3基因中所得到的。arg3調節(jié)區(qū)域受特殊的和一般的調節(jié)機制二者的支配。據Crabeel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第78卷，6026頁(1981)，報導，arg3調節(jié)區(qū)域已在質粒pYeura arg3上被克隆到大腸桿菌中。精氨酸生物合成途徑被去阻遏的啤酒酵母(S.cerevisiae)株系，如1c 1697d株系，是較好的寄主。與DC5株系相比，使用這種株系導致源于arg3啟動子的增強表達。其他有用的調節(jié)區(qū)域的例子包括了那些來源于糖酵解途徑酵母基因的調節(jié)區(qū)域，如為烯醇化酶、醛縮酶、磷酸甘油酸激酶和3-磷酸-甘油醛脫氫酶編碼的調節(jié)區(qū)域;酵母乙醇脫氫酶基因;以及，一般來說，涉及分解代謝中的基因，如精氨酸酶基因。
把融合了的DNA片段克隆到酵母中的較好的載體是質粒YEp13。它可在大腸桿菌和啤酒酵母兩者中復制并保存。因此，被認為是一種穿梭載體。幾種其他酵母載體也為人所知并可得到。HBsAg和調節(jié)區(qū)域可被連續(xù)地或自發(fā)地插入到酵母載體中。用含有在酵母中發(fā)揮作用的自主復制序列(復制子)的質粒載體的轉化一般將會導致產生象質粒一樣的此發(fā)明DNA分子的染色體外保留。這種復制子的得到需要技巧。用不含有在酵母中發(fā)揮作用的復制子的質粒載體的轉化會導致產生DNA分子摻入到染色體DNA中。
根據此發(fā)明，促進保護免受HBV對人入侵的疲苗含有酵母所產生的HBsAg，用已知的技術可以制備合適的載體。希望使用一種佐劑，如氫氧化鋁或磷酸鋁。這樣生產出來的HBsAg也能與其他免疫原結合來制備接酶可以從市場上買到并應按產品的要求使用。TDNA連接酶是較好的連接酶。
各種片段和最后的結構可以按照常規(guī)的方法連接起來。在很多情況下，基因被分離出來，作限制性酶切圖譜并測定序列。這樣，人們可選擇感性趣的的序列，如HBsAg序列，通過基因的限制性酶切，選用以后必需的操作步驟，如用Bal31進行酶切，體外誘變，引物修復，或類似的方法，從而提供期望大小，包括期望序列，且具有適當的末端的片段。銜接物和連接物可以用于連接序列，以及代替丟失序列，此處使用的限制酶切位點在感興趣的區(qū)域內部。切開的各種片段可以通過電泳，電洗脫，與其他序列連接，克隆，重分離和其他操作進行純化。
感興趣的結構基團控制轉錄的調節(jié)區(qū)域的使用，如HBsAg序列，可能使寄主細胞達到生長高密度，但結構基因，如HBsAg基因，不表達或低水平的表達，然后再改變環(huán)境條件，如營養(yǎng)，溫度等來誘導表達。
例如，含有GAL4調節(jié)區(qū)域，酵母細胞可以在有甘油-乳酸混合物的營養(yǎng)豐富的介質中生長到高濃度，如在對數中期或后期，然后轉變碳源為半乳糖。另一個例子是，PHO5調節(jié)，人們可以在大約7mM KH2PO4的高嶺酸鹽濃度中生長細胞，然后使細胞重懸于缺乏磷酸鹽的介質中得到恢復，以影響去阻遏和表達。由于溫度敏感性，可使細胞在25℃到37℃間生長，然后改變溫度約到5℃到20℃至合適。寄主細胞應該含有同所使用的調節(jié)區(qū)域相聯系的調節(jié)系統(tǒng)。
把HBsAg序列融于調節(jié)區(qū)域可以通過使用中間載體來完成，或者是，HBsAg序列可以直接插入到含有調節(jié)區(qū)域的載體中。載體是可以攜帶并保持發(fā)明的DNA片段包括如噬菌體和質粒的DNA。例如，Charnay等人，Nature，第286卷，第893-895頁(1980)和Tiollais，英國專利申請2，034，323公開了噬菌體中克隆DNA片段的技術。認為HBsAg序列與調節(jié)區(qū)域有關更好，這樣，通過HBsAg序列表達合成的HBsAg就可免除外組合疫苗。HBV或組合疫苗可以例如通過皮下的、靜脈內的或肌內途徑來使用。這項發(fā)明的DNA片段和由此而產生的HBsAg也能夠通過DNA雜交技術和各種免疫測定作為生物樣品中HBV測定的探針。
含有逐步融合于HBVPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域的功能DNA編碼序列的DNA分子的表達本發(fā)明也同含有逐步融合于HBV Pre S2-S蛋白編碼序列的一部分Pre S2區(qū)域的功能DNA編碼序列的重組DNA分子有關。這里所用的術語“編碼序列”或“編碼區(qū)域”也含有它的功能衍生物?！肮δ苎苌铩边@個術語是指在希望的地方不妨礙粒子的形成和/或保持其免疫原性的涉及氨基酸改變的編碼序列。這些功能衍生物可以通過常規(guī)的點特異誘變來制備。Botstein等人，Science，229，1193-1201(1985)首先使用了點特異突變技術。這種融合可以發(fā)生在Pre S2區(qū)域的N-末端或者在Pre S2區(qū)域內的一些點上?？梢杂兴姆N類型的融合，即在整個Pre S2區(qū)域的5′-末端，在Pre S2區(qū)域內的一些位置上，這樣Pre S2 DNA位于功能DNA編碼序列的兩側，或在Pre S2區(qū)域截短部分的5′-末端上，或是在S-蛋白編碼區(qū)域的5′-末端，這樣融合不含有Pre S2 DNA。各種Pre S2-S蛋白編碼序列已為人所知，并可以用已知的技術來制備或分離?！矃⒖矗宋乃傅膮⒖紩?，上述〕。這項發(fā)明的一個體現是ARG3調節(jié)區(qū)域和酵母OCT蛋白的18個氨基酸一步步融合到截短的Pre S2-S蛋白編碼序列，以致融合了的序列含有Pre S2-S蛋白編碼序列和完整的S蛋白編碼序列的42個密碼子。較好的功能DNA編碼序列包括瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白編碼序列，或它的致免疫衍生物，HIV的包膜基因編碼序列或任何它的致免疫衍生物，特別是C7肽，肽121或Dreesman肽編碼序列或它的致免疫衍生物。例如，一個較好功能DNA編碼序列是后來連結于Pre S2-S蛋白編碼序列的截短的Pre S2區(qū)域的C-末端42個密碼子的Pre S2編碼序列的開頭的13個N-末端密碼子。術語“致免疫衍生物”是指一Dame等人.，Science，225，593(1984)(惡性瘧原蟲cs蛋白)〕。含有cs編碼序列的DNA分子，或任何其它一步步融合到HBVPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域的功能DNA編碼序列都能用常規(guī)的技術來構建。如用把cs編碼序列或任何其他功能DNA編碼序列一步步連接到在PreS2-S蛋白編碼序列的55個氨基酸PreS2編碼區(qū)域內的任何密碼子上。
較好的是，足夠的PreS2編碼序列保留到cs編碼序列或任何其他功能DNA編碼序列的連接之后，以保證cs蛋白或任何其他功能DNA編碼序列蛋白的最適出現，即應該保留足夠的PreS2區(qū)域，這樣，編碼多肽的PreS2區(qū)域作為功能DNA蛋白編碼序列產物和HBsAg粒子表面之間的橋而起作用。據報導，PreS2編碼序列的26個氨基末端氨基酸代表了在PreS2區(qū)域上的一個占優(yōu)勢的抗體結合位點?！矃⒁?，如Milich等人，Science，228，1195-1199(1985)〕。因此，如果想要制備一個含有和/或代表PreS2抗原決定簇和cs二者，或其他功能編碼序列抗原決定簇的雜種粒子，最好把cs編碼序列或其他功能DNA編碼區(qū)域插入到在使含有和/或代表PreS2抗原決定簇和cs二者，或其他功能DNA編碼序列抗原決定簇的雜交粒子的制備成為可能的PreS2編碼區(qū)域中的一個位點上。
此發(fā)明的重組載體包括有效連接于調節(jié)區(qū)域的有關發(fā)明的重組DNA分子(即一個功能DNA編碼序列一步步融合到HBVPreS2-S蛋白編碼序列的一部分PreS2區(qū)域)。這種載體另外也許也包含一個在酵母中行使功能的復制子。術語“復制子”是指保持功能穩(wěn)定的DNA最小區(qū)域，并且是染色體外的在用此載體轉化的寄主酵母有機體中的重組載體。這種復制子的得到需要技巧。術語“調節(jié)區(qū)域”是指調節(jié)想要表達的編碼序列的調節(jié)轉錄和翻譯的DNA區(qū)域。這種調節(jié)區(qū)域的得到需要技巧。這種載體可以用常規(guī)的技術來制備，如把這項發(fā)明的DNA分子逐步逐步地插入到已經含有復制子和調節(jié)區(qū)域的載體上，通過這種方式DNA分子有效地連接到這樣的調節(jié)區(qū)域上。較好的是，DNA分子連接到能夠在酵母的酵母屬(Saccharomyces)中表達的載體上。
本發(fā)明也和用這種重組載體中轉化的酵母寄主細胞，同制備這種含有用此發(fā)明的重組載體轉化酵母寄主細胞的轉化寄主的方法有關。這種轉化用常規(guī)技術如以上已經描述了的技術來進行。較好的酵母細胞包括那些屬于酵母屬的酵母，特別是那些屬于啤酒酵母種和卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)種的酵母。
本發(fā)明也與制備含有HBsAg蛋白的雜種粒子的方法有關。這個HBsAg含有和/或呈現了功能DNA編碼序列產物。在這個方法中包括在適當的培養(yǎng)介質中培養(yǎng)此發(fā)明的轉化酵母寄主細胞，并從細胞裂解產物或這個寄主培養(yǎng)物提取液中分離粒子。術語“呈現”或“含有和/或呈現”是指功能DNA編碼序列蛋白包含于含有HBsAg蛋白的雜種粒子中。通過這種方式，可使對功能DNA編碼序列蛋白的免疫反應的產生成為可能。當需要使的時候，雖然不一定是必要的時候，功能DNA編碼序列蛋白的出現并不干擾HBsAg抗原決定簇的致免疫活性，因此，形成了二價疫苗。大多數轉好的功能DNA編碼序列蛋白出現在HBsAg粒子上，以這樣一種方式，或是功能DNA編碼序列蛋白的抗原決定簇或是功能DNA編碼序列蛋白和HBsAg抗原決定簇二者的最大量均能適量地暴露?！斑m當的培養(yǎng)介質”是指能使轉化寄主生存下來，并也能使這種寄主表達載體的雜種功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列蛋白質產物的介質。載體在恢復量中轉化。最好操作者有一定技巧，使用適當的培養(yǎng)基取決于所用的寄主細胞。將此發(fā)明中的雜種粒子從細胞裂解產物或此寄主培養(yǎng)物的提取液中的分離是用常規(guī)的蛋白質分離技術來進行的。
本發(fā)明也和含有此發(fā)明雜種粒子的疫苗有關，這個疫苗將含有此發(fā)明雜種粒子的免疫保護蛋白質的量，并用常規(guī)的技術制備?！懊庖弑Ｗo”是指此發(fā)明足夠的雜種粒子有助于得到沒有嚴重的付作用而具有對想要被保護的因素的足夠的保護抗體反應。再者，此發(fā)明的疫苗含有此發(fā)明的膠團，即膠團含有此發(fā)明的粒子和多價吸附劑。這種膠團組成的多價吸附劑的最佳量是每100μg蛋白5-50μg多價吸附劑。此膠團可以用歐洲專利申請公布號0199698所報導的方法來制備。
在本發(fā)明的疫苗中，本發(fā)明雜種粒子的水溶液在生理pH緩沖液中直接使用更好。粒子可以選擇性地同任何各種已知的佐劑攙和或吸收。這些佐劑除了氫氧化鋁外還包括有其他物質。
疫苗準備一般在“疫苗的新動向與發(fā)展”上有敘述。由Voller等人編著，Park大學出版社，Baltimore，Maryland，美國，1978。
出現在每種疫苗劑量中目前發(fā)明雜種粒子的量被選作誘導免疫保護反應而在經典疫苗中無大的付作用的量。這個量變化由使用特殊的免疫原和疫苗以及是否用佐劑輔助來決定。一般來說，期望每個劑量含有1-1000μg蛋白質，1-200μg更好。特殊疫苗的最適量可以用包括受試者抗體效價觀察和其他反應的標準研究來決定。按照一個最初的疫苗接種，受試者最好在大約四周內接受一次強化，之后只要感染的危險存在多長，每六個月就接受重復的強化。
本發(fā)明中對雜種粒子的免疫反應可通過佐劑的使用來提高，如(但不限制于)氫氧化鋁(明礬)。
本發(fā)明雜種粒子的舉例說明，為惡性瘧原蟲環(huán)狀蛋白(cs)重復抗原決定簇編碼的64個密碼子DNA序列和8個密碼子cs編碼序列〔見Dame等人，Science，225，593-599(1984)〕分別被一步步插入到在含有復制子、PreS2-S蛋白編碼序列和適當的調節(jié)區(qū)域的酵母表達載體中的一部分PreS2編碼序列中。兩個表達載體，即一個含有64個密碼子cs序列，另一個含有8個密碼子cs序列，每個都被插入到酵母寄主細胞中，分析這種轉化細胞的提取液來看在同一分子上的HBsAg抗原決定簇和cs抗原決定簇是否存在。
使用cs特異的5個單克隆抗體和抗原來源于酵母的純化HBsAg的一個單克隆抗體，從免疫吸印分析得到的結果表明37，000千道爾頓(Kd)雜種蛋白是從用含有同PreS2-S蛋白編碼序列一步步融合的64個密碼子cs編碼序列的載體轉化的酵母的裂解產物中獲得的，30，000Kd雜種蛋白是從用含有同PreS2-S蛋白編碼序列一步步融合的8個密碼子cs編碼序列的載體轉化的酵母的裂解產物中獲得的。這些蛋白裝配到HBsAg粒子狀結構是通過CsCl和蔗糖梯度分析，高壓液相層析(HPLC)和電子顯微鏡檢術來顯示的。在這種粒子外部cs抗原決定簇的出現是通過cs抗原決定簇對ELISA分析中cs特異抗體的接受能力來顯示的。在這種粒子外部HBsAg抗原決定簇的出現是通過放射免疫分析(AUSTIAⅡ，Abbott)或ELISA分析(Enzygnost-HBsAg，Behringwerke)來顯示的。
新的PreS2和PreS2-S蛋白編碼序列本發(fā)明的新的HBVPreS2和PreS2-S蛋白編碼序列來源于從質粒pRIT10616分離出來的HBVadw亞型。這里所用的術語“編碼序列”或“編碼區(qū)域”也包含它的功能衍生物。術語“功能衍生物”是指在合適的地方有氨基酸改變但并不干擾粒子的形成并且(或者)在此其保留是滿意的地方保持免疫原性的編碼序列。這個功能衍生物可以采用常規(guī)的位點特異突變來制備，如用Botstein等人的方法，Science，229，1193-1201(1985)。這種PreS2和PreS2-S蛋白編碼序列可以用常規(guī)的重組DNA步驟來恢復。這種常規(guī)的重組DNA步驟來源于Budapest條約存放在在美國典型菌種保藏所，Rockville，Maryland，1982年6月2日，登記號ATCC38131，的質粒pRIT10616。這個新的蛋白編碼序列的PreS2區(qū)域為以下氨基酸序列-55-50Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40-30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-
-20Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile--10Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.
這個區(qū)域也可通過常規(guī)的合成寡核苷酸的合成來獲得。這項發(fā)明的PreS2-S編碼序列的較好的功能衍生物是一個第45位的丙氨酸(GCT)在那里通過點特異突變改成蘇氨酸(ACT)。與此發(fā)明的未修飾編碼序列相比較，這個功能衍生物通過轉化的啤酒酵母導致了大兩倍水平的表達。
這項發(fā)明的重組載體含有有效地連接于調節(jié)區(qū)域的有關發(fā)明的PreS2或PreS2-S蛋白編碼序列。這種載體可能另外也含有取決于選用物和/或所使用的寄主的復制子。術語“復制子”是指在用這種載體轉化的真核或原核生物寄主中的重組載體的保持功能穩(wěn)定的染色體外DNA最小區(qū)域。這種復制子的得到需要技巧。術語“調節(jié)區(qū)域”是指含有啟動子區(qū)域和編碼序列轉錄所必需的其他序列的DNA序列。這種調節(jié)區(qū)域的得到需要技巧。這樣一種載體可以用常規(guī)的技術來制備，如把這項發(fā)明的PreS2或PreS2-S蛋白編碼序列一步步插入到已經含有復制子和調節(jié)區(qū)域的載體上，通過這種方式DNA分子有效地連接到調節(jié)區(qū)域上。最好是DNA分子連接到能夠在酵母如酵母屬中表達的載體上。
這項發(fā)明也和用這種重組載體轉化的寄主細胞和制備這種轉化寄主的方法有關。這種轉化用常規(guī)技術進行。寄主細胞可以是真核的或原核的。最適的寄主細胞是真核細胞，特別是酵母細胞并包括那些屬于酵母屬的酵母，特別是那些屬于啤酒酵母和卡氏酵母種的酵母。
本發(fā)明也和本發(fā)明的PreS2或PreS2-S蛋白編碼序列所編碼的蛋白質的制備有關。在這個方法中包括在適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此發(fā)明的轉化寄主細胞，和從寄主細胞培養(yǎng)液或從細胞裂解產物中分離蛋白，此分離取決于寄主細胞分泌這種蛋白質的能力?！斑m當的培養(yǎng)基”是指在恢一量中能使這項發(fā)明的轉化細胞生存下來并也能使寄主表達這項發(fā)明的PreS2或PreS2-S蛋白編碼序列的培養(yǎng)基。有經驗的人會知道，使用適當的培養(yǎng)基將依使用的寄主細胞而定。把這項發(fā)明的PreS2-S蛋白從這寄主的培養(yǎng)裂解產物或寄主的培養(yǎng)液中分離出來是用常規(guī)蛋白質分離技術來進行的。用此發(fā)明的方法制備的蛋白質可以依寄主細胞糖基化能力來糖基化。如果想要得到一個去糖基化的蛋白質，這項發(fā)明的蛋白質應該通過使用無糖基化作用的寄主細胞或者通過在進行這項發(fā)明的過程之前的蛋白質的編碼序列上采用常規(guī)位點的特異突變，如用Botstein等人的方法，Science，229，1193-1201(1985)來進行制備。
本發(fā)明也同含有些發(fā)明的PreS2或PreS2-S蛋白的免疫保護量的疫苗有關。這種疫苗可以用常規(guī)的技術來制備。
本發(fā)明也同制備含有包含此發(fā)明的PreS2-S蛋白編碼序列所編碼的蛋白質的HBsAg蛋白的雜種粒子的方法有關，這個方法包括在適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此發(fā)明的轉化真核寄主細胞，并從寄主細胞培養(yǎng)液或從細胞裂解產物或這種寄主培養(yǎng)液的提取液中分離粒子，此分離取決于轉化寄主細胞分泌這種粒子的能力?！斑m當的培養(yǎng)基”是指能使此發(fā)明的轉化細胞生存下來并能使寄主從粒子形式和恢復量表達此發(fā)明的PreS2-S蛋白編碼序列的培養(yǎng)基。有經驗的人會知道，使用適當的培養(yǎng)基依所使用的寄主細胞而定。此發(fā)明的雜交粒子從培養(yǎng)液裂解產物或寄主培養(yǎng)液中分離出來是用常規(guī)的分離技術進行的。
本發(fā)明也會和含有此發(fā)明的雜種粒子的疫苗有關。這種疫苗含有此發(fā)明的雜種粒子的免疫保護量并用常規(guī)技術來制備。最好是此發(fā)明的疫苗包括此發(fā)明的膠團，即膠團含有此發(fā)明的粒子和多價吸附劑。這種粒子構成的多價吸附劑的最適量是每100μg蛋白質5-50μg多價吸附劑。膠團可用歐洲專利申請公布第0199698號上發(fā)表的方法來制備。
在此發(fā)明的疫苗中，此發(fā)明的PreS2-S蛋白或雜種粒子的水溶液可以直接使用，最好在生理pH緩沖液中。蛋白質或粒了可以選擇性地同各種已知的佐劑一起攙合或吸收。這種佐劑包括氫氧化鋁及其他。
疫苗制備一般在“疫苗的新動向與發(fā)展”(NewTrendsDevelop-mentinVaccines)上有敘述。此書由Voller等人編著，UniversityPark出版社出版，Baltimore，Maryland，美國，1978。對脂質體的包裹作用(Encapsulation)也有敘述，例如，Fullerton，美國專利4，235，877。對蛋白質連到大分子上也有描述。例如，Likhite，美國專利4，372，945和Armor等人，美國專利4，474，757。
本發(fā)明中的每個疫苗劑量中PreS2-S蛋白或雜種粒子的量被選定為誘導那種免疫保護反應而在經典疫苗中又沒有大的付作用的量。這個量依所用的特異免疫原和疫苗是否用佐劑輔佐而變化。一般來說，希望每個劑量含1-1000μg蛋白質，最好是1-200μg。特殊疫苗的最適量能用包括受試者抗體效價的觀察和其他反應的標準研究來決定。按照一個最初的疫苗接種，受試者最好在大約四用內接受一次強化，之后只要感染的危險存在多長，每六個月就接受重復的強化。
對PreS2-S蛋白或此發(fā)明的雜種粒子的免疫反應通過使用佐劑，如礬，但不限制于礬，來提高。
新的PreS1蛋白編碼序列此發(fā)明的新的HBVPreS1蛋白編碼序列來源于從質粒pRIT10616中分離出的HBVadw亞型。這里所用的術語“編碼序列”或“編碼區(qū)域”包括它的任何功能衍生物。術語“功能衍生物”是指那種不干擾粒子形成和/或保留免疫原性的包含氨基酸改變的編碼序列。這種功能衍生物能用常規(guī)位點特異突變來制備，如Botstein等人的方法，Science，229-1193-1201(1985)。這種PreS1蛋白編碼序列能用常規(guī)重組DNA程序來恢復，這種程序來源于按照Budapest條約寄存在美國典型菌種保藏所，Rockville，Maryland，1982年6月2日，登記號ATCC38131的質粒pRIT10616，PreS1區(qū)域為以下氨基酸序列編碼-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIlePro
CCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla這種區(qū)域也可以用常規(guī)的合成寡聚核苷酸的合成而獲得。
此發(fā)明的重組載體包含有效連接于調節(jié)區(qū)域的有關發(fā)明的PreS1蛋白編碼序列，另外也可能包含取決于選用物和/或使用的寄主的復制了。術語“復制子”是指在用載體轉化了的真核或原核生物寄主中的重組載體的保持功能正常的染色體外DNA最小區(qū)域。這種復制子的得到需要技巧。術語“調節(jié)區(qū)域”是指含有啟動子區(qū)域和編碼序列轉錄必需的其他序列的DNA序列。這個調節(jié)區(qū)域的得到需要技巧。這種載體可用常規(guī)技術如用把此發(fā)明的PreS1蛋白編碼序列一步步插入到已經含有復制子和調節(jié)區(qū)域的載體中來制備。通過這種途徑，DNA分子有效地連接到調節(jié)區(qū)域上。最好是DNA.分子連接到能在如酵母屬的酵母菌中表達的載體上。
本發(fā)明也同用重組載體轉化的寄主細胞有關，同制備轉化寄主的方法有關。這種轉化是用常規(guī)技術來進行的。寄主細胞可以是真核的或原核的。較好的寄主細胞是真核細胞，特別是酵母細胞，包括那些屬于酵母屬的細胞，特別是那些屬于啤酒酵母和卡氏酵母種的細胞。
本發(fā)明也同制備此發(fā)明的PreS1蛋白編碼序列所編碼的蛋白質的方法有關，這個方法包括在適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)此發(fā)明的轉化寄主細胞，和從寄主細胞培養(yǎng)液或從細胞裂解產物或這種寄主培養(yǎng)液的提取液中分離蛋白質，此分離依轉化寄主細胞分泌這種蛋白質的能力而變?！斑m當的培養(yǎng)基”是指能使此發(fā)明的轉化寄主生存下來并在恢復量條件下能使此寄主表達此發(fā)明PreS1蛋白編碼序列的培養(yǎng)基。有經驗的人會知道，使用適當的培養(yǎng)介質依使用的寄主細胞而定。此發(fā)明的PreS1蛋白的從培養(yǎng)液裂解產物或此寄主的培養(yǎng)液中分離出來是用常規(guī)的分離技術來進行的。用此發(fā)明的方法制備的蛋白質依寄主細胞的糖基化能力可以被糖基化。如果想要一個脫糖基化的蛋白質，這項發(fā)明的蛋白質應該使用無糖基化作用的寄主細胞或用在本發(fā)明的過程進行之前在蛋白質編碼序列上的常規(guī)位點進行特異突變。位點特異突變是用如Botstein等人的方法，Science，229，1193-1201(1985)來進行的。
本發(fā)明也和含有此發(fā)明的PreS1蛋白的疫苗有關。這種疫苗含有此發(fā)明PreS1蛋白的免疫保護量并用常規(guī)技術制備。
在發(fā)明的疫苗中，此發(fā)明的PreS1蛋白的水溶液可以直接使用，在生理pH緩沖最好。PreS1蛋白可以選擇性地同任何各種已知的佐劑混合或吸收。這種佐劑包括氫氧化鋁及其他。
疫苗制備一般在《疫苗的新動間與發(fā)展》上有敘述，此書由Voller等人編著，UniversityPark出版社出版，Baltimore，Maryland，美國，1978。在脂質體中的包裹作用有敘述，例如Fullerton，美國專利，4，235，877。蛋白質連接到大分子上也有報導，例如Likhite，美國專利4，372，945和Armor等人，美國專利4，474，757。
出現在每個疫苗劑量中的本發(fā)明的PreS1蛋白的量被選作為誘導免疫保護反應而在經典疫苗中沒有大的付作用的量。這個量將依所用的特殊免疫原和疫苗是否用佐劑輔佐而變。一般來說，希望每個劑量包含1-1000μg的蛋白質，最好是1-200μg。特殊疫苗的最適量可以通過包括受試者抗體效價觀察和其他反應的標準研究來查明。按照一個最初疫苗接種，受試者將最好在大約四周內再接受一次疫苗強化，繼而只要感染的危險存在多長，每六個月就接受一次重復強化。對此發(fā)明的PreS1蛋白的免疫反應使用佐劑，如礬，但不限制于礬來提高。
新的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列這項發(fā)明也同其PreS1-PreS2部分含有以下氨基酸序列的HBVPreS1-PreS2-S蛋白編碼序列有關PreS1區(qū)域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIlePro
CCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAlaPRE-S2區(qū)-55ATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAMetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGAlaLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGATyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTThrValAsnProAlaProAsnIleAlaSerCACATATCGTCAAGCTCCGCGAGGACTGGGHisIleSerSerSerSerAlaArgThrGlyGACCCTGTGACGAACAspProValThrAsn
此發(fā)明的新的HBVPreS1-PrS2-S蛋白編碼序列來源于從以上所述的質粒pRIT10616中分離出來的HBVadw亞型，可以從美國菌種保藏所，Rockville，Maryland，登記號ATCC38131，上獲得。術語“編碼序列”或編碼區(qū)域也包括任何一種從它來的功能衍生物(或叫功能推衍)。“功能推衍”是指一段具有氨基酸變化的編碼序列，這些變化，在適當的地方，并不干擾粒子的形成，或者說，這些變化在可能出現免疫原性的地方可保持該免疫原性。這種“功能推衍”可通過常規(guī)的特異性位點突變方法，如Botstein等的方法，《科學》，229，1193-1201，(1985)。
由此方法而得的重組載體含有與一調節(jié)區(qū)域相連的人工操作產生的PreS1-PreS2-S蛋白質編碼序列。此外，這種載體也可能包含一個依賴于選擇性的和(或)依賴于要使用的寄主的復制子?！皬椭谱印笔侵妇S持其功能穩(wěn)定的一段最小的區(qū)域，在染色體外，這種重組載體位于以它進行轉化的真核寄主或原核生物體內。這種復制子在此方法中已聞名遐邇?！罢{節(jié)區(qū)域”是這樣一段DNA順序，它含有一個啟動區(qū)域和為一段編碼序列的轉錄必需的其他順序，而這一段編碼序列則調節(jié)一個結構基因編碼序列的轉錄。這種調節(jié)區(qū)域也是眾所周知的。這種載體可由一般的方法得到，如把在噬菌體中獲得的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列嵌入已具有復制子和調節(jié)區(qū)域的載體中，使得通過人工操作將DNA分子與這個調節(jié)區(qū)域相連。DNA分子優(yōu)先縛于能在酵母，如酵母屬中表達的載體上。
本發(fā)明也與寄主細胞經這種重組載體進行轉化有關，還涉及到獲得這種轉化寄主的方法。用常規(guī)方法即可進行上述轉化。寄主細胞可以是真核或原核的。經選擇的宿主細胞為真核細胞，尤其是酵母及包括屬于酵母屬的細胞，特別是其中屬于啤酒酵母和卡氏酵母。
該發(fā)明還涉及到制備由PreS1-PreS2-S蛋白質編碼序列所編碼的蛋白質的方法，此方法包括在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉化了的宿主細胞，從宿主細胞培養(yǎng)液或細胞溶化產物中分離蛋白質，或者，依賴宿主細胞可分泌蛋白質的能力，從宿主培養(yǎng)物中提取該蛋白質。上述的“合適的培養(yǎng)基”是這樣的培養(yǎng)基，它能使本發(fā)明轉化后的宿主存活，也能使這一宿主以可取得的量表達PreS1-PreS2-S蛋白質編碼序列的產物。在熟練工作人員的工作中可以看到，將采用的合適的培養(yǎng)基會依賴于要使用的宿主細胞。用常規(guī)的蛋白質分離技術可從培養(yǎng)溶化物或宿主培養(yǎng)液分離得PreS1-PreS2-S蛋白質。以此法制備的蛋白質，可能會由于宿主細胞的糖基化作用而帶有糖基。如果需要去糖基的蛋白質，就要利用無糖基化作用的宿主細胞來制備，或者，在進行這種發(fā)明方法之前，采用常規(guī)的蛋白質編碼序列上特異性點突變方法，如(Botsteinet.al.Science，229，1193-1201，(1985))。通過一個轉化了的酵母或哺乳動物宿主細胞，PreS1-PreS2-S編碼序列將表達為糖基化蛋白質。通過一個轉化了的酵母宿主細胞，PreS1-PreS2-S編碼序列將表達為N-肉豆蔻酸蛋白。
本發(fā)明還涉及到含有大量PreS1-PreS2-S蛋白質的免疫保護性疫苗。這種疫苗可用一般技術獲得。
本發(fā)明也涉及了制備含有HBsAg蛋白的雜種粒子的方法，HBsAg蛋白包含了由PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列編碼的蛋白質，這種發(fā)明中也包括了在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化了的真核寄主細胞，從寄主細胞培養(yǎng)液或細胞溶化產物中分離這種蛋白質顆粒，或者根據轉化了的宿主細胞可分泌蛋白質的能力提取這種蛋白質的培養(yǎng)基。所謂“適合的培養(yǎng)基”即是使轉化后的宿主存活，使宿主以顆粒形式、以補償量表達PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列的培養(yǎng)基。應注意，在此法中，所用的培養(yǎng)基將依賴于使用的宿主細胞。用一般的分離技術從培養(yǎng)的溶化物或寄主培養(yǎng)液中分離蛋白質顆粒。
本發(fā)明亦涉及到該發(fā)明的含有雜種粒子的一種疫苗。這種疫苗包含有大量免疫保護的雜種粒子，這些粒子可由一般的技術制備。更好的是，該發(fā)明得到的疫苗具有一種膠團，即，含有此發(fā)明所得的粒子和多價吸附劑的膠團。膠團中多價吸附劑的選擇量為每100μg蛋白質中含5-50μg多價吸附劑。制備膠團的方法在歐洲專利申請公布No.0199698中有敘述。
本發(fā)明制備的疫苗中，PreS1-PreS2-S蛋白質或雜種粒子的水溶液可選擇在生理pH緩沖條件下直接使用。另一方法是，這種蛋白質或粒子可被眾多已知的佐劑之一吸收或與其混合。這些佐劑包括氫氧化鋁就其他許多物質。
疫苗制備方法的描述常見于“疫苗的新動向與發(fā)展”中，此書由Voller等主編，UniversityPark出版社，美國馬里蘭州巴爾的摩，1987年出版。例如，包裹在脂質體內就是由Fullerton描述的，美國專利4，372，945，又如，Likhite和Armor等揭示了蛋白質與大分子物質的結合，美國專利4，372，945和4，474，757。
存在于每一疫苗劑量中的以現有發(fā)明制得的PreS1-PreS2-S蛋白或雜種粒子的數量，被選來用在典型疫苗誘導產生免疫保護性，而無明顯的、相反的副作用的劑量數量。隨著所用的特異性抗原之不同以及疫苗是否加有佐劑，這一數量可以改變。一般期望的是每一疫苗劑量含有1-1000μg蛋白質，最好是1-200μg。要確定一種特定的疫苗產生的最佳蛋白質數量可通過標準方法，包括抗體效價的觀察，以及觀察其他的反應。在初始接種后，有選擇性地增大接受試驗者在約四周內的劑量，這之后，只要傳染的可能性存在，就要接著每6個月重復增加劑量。
利用佐劑，如明礬，但不限于礬，可提高對于PreS1-PreS2-S蛋白或雜種粒子的免疫反應。
酵母中PreS1-PreS2-S蛋白的表達本發(fā)明也關系到一個重組DNA載體，它含有人工操作與一段表達控制順序相連的整個PreS1-PreS2-S蛋白質編碼序列。這里所說的“編碼序列”或“編碼區(qū)域”也包括由此產生的任何功能推衍?！肮δ芡蒲堋笔侵敢欢尉哂邪被嶙兓木幋a序列，這些變化在適當地方，不干擾顆粒的形成，或者說，這些變化在可能有免疫原性的地方，保持其免疫原性。用常規(guī)的特異性點突變法，如Botstein等的方法。(Science，229，1193-1201(1985))，可制備這種功能推衍。此外，這種載體還可能含有一個復制子，這個復制子是選擇依賴性或宿主依賴性?？上驳氖牵纱税l(fā)明可得到我們將使用的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列。
“復制子”是可以穩(wěn)定地維持其功能的最小的DNA區(qū)域，在染色體外，這種重組載體通過該發(fā)明所得的載體在寄主酵母體內進行轉化。這些復制子已眾所周知。所謂“調節(jié)區(qū)域”是指任何一段DNA序列，它含有一個啟動區(qū)域和其他為轉錄一段密碼序列所必需的序列，而這一段密碼序列了調又調節(jié)一個結構基因序列的轉錄。這些調節(jié)區(qū)域也已是人所周知的。用一般的技術可制備這種載體，如把噬菌體中的一段PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列嵌入到一個已含有復制子和調節(jié)區(qū)域的載體中，以使DNA分子與這個調節(jié)區(qū)域相連。人們選擇的是能在酵母的酵母屬中表達的載體和DNA分子連接。最好載體中包含的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列正是上述的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列。這些載體在插入功能DNA編碼序列的過程中也十分有用，這段DNA的插入使該載體內含的結果PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列，得到表達。因此，這一發(fā)明方法也關系列一個重組DNA分子，它含有一段在噬菌體中與PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列的PreS1區(qū)域融合的功能DNA編碼序列，從而使這段功能DNA序列要么構成PreS1區(qū)域的一個插入區(qū)，要么取代部分PreS1區(qū)域，可能還要取代PreS2-S區(qū)域的一部分，所以，這一發(fā)明也涉及含有這種重組DNA分子的載體。例如，見下述實例21A。所謂“功能DNA編碼序列”是指一段DNA編碼序列，當它在噬菌體中與PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列中PreS1區(qū)域融合時，并不涉及，也不妨礙HBsAg粒子的裝配。經選擇的功能DNA順序包括(但不限于)這些瘧原蟲或任何免疫原性衍生的環(huán)孢體編碼序列，HIV或任何免疫原性衍生的包膜基因編碼序列，尤其是象后面要舉出的C7肽、肽121或Dreesmas肽的編碼序列，或來自其他感興趣的病毒中肽的編碼序列，特別是來自其他宿主中的為外殼蛋白或表面蛋白編碼的序列。
本發(fā)明也涉及到用這種重組載體轉化酵母宿主細胞和制備這種轉化宿主的方法。常規(guī)技術即可進行這一轉化。選用的酵母細胞也包括酵母菌屬，特別是屬于啤酒酵母種的。
該發(fā)明還關系列一種由PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列所編碼的蛋白質的制備，在這發(fā)明中，包括了在一種適當的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉化后的宿主細胞，從宿主細胞培養(yǎng)液或細胞溶化物中分離該蛋白質，或者根據宿主細胞能分泌該蛋白質的性質來提取這種蛋白質。所謂的“適當的培養(yǎng)基”是指它能使轉化后的宿主生長，也能使宿主表達一段PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或以可取得的量表達PreS1-功能DNA編碼序列一PreS2-S蛋白編碼序列的產物。應意識到，用這種技術，采用的適當的培養(yǎng)基應依賴于將使用的宿主。用普通的蛋白質分離技術即可從細胞溶化物或寄主培養(yǎng)液中分離PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA編碼序列一PreS2-S蛋白。由此發(fā)明方法制備的蛋白質，由于其宿主細胞的糖基化作用，可能是帶糖基的。如果需要去糖基的蛋白質，就應這樣制備用一種糖基化作用失效的宿主細胞，或在進行前述步驟前，在蛋白質編碼序列上采用一般的特異性點突變方法，如Botstein等《科學》上的方法(Botsteinetal.Science，229，1193-1201(1985))。
此發(fā)明還涉及一種疫苗，它含有由該發(fā)明生產出的大量免疫保護性的PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白。由一般的技術可制得該疫苗。
本發(fā)明也與制備一種雜種粒子的方法有關，這種粒子含有由PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列所編碼的蛋白質，該法中包括在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉化后的酵母宿主細胞，從宿主細胞培養(yǎng)液或細胞溶化物中分離粒子，或根據轉化后的宿主細胞能分泌這種粒子的性質來提取它。所謂“適合的培養(yǎng)基”是指轉化后的宿主能生長的培養(yǎng)基，它也能使PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白編碼序列以粒子形式，以可提取的量表達。應注意，采用這些方法之一時，所用的合適的培養(yǎng)基要依賴于使用的宿主細胞。用一般的分離技術即可從培養(yǎng)的溶化物或宿主培養(yǎng)液中分離得粒子。
本發(fā)明還與含有粒子的一種疫苗有關。這種疫苗含有大量具免疫保護性的粒子，這種粒子可由常規(guī)技術制得。更好的是，這種疫苗含有膠團，即包括粒子和多價吸附劑的膠團。選擇的多價吸附劑在這種膠團中含量為每100μg蛋白質有5-50μg多價吸附劑。膠團的制備法可見歐洲專利申請公布No.0199698。
在該發(fā)明中的疫苗里，PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白或粒子的水溶液，可在選擇的生理pH緩沖條件下直接使用。另一方法是，眾多已知的佐劑中，任何一種都可吸附或與蛋白質粒了混合，這些佐劑包括氫氧化鋁及其他物質。
疫苗的制備方法見“疫苗的新動向與發(fā)展”中，由Voller等主編，1978年，美國馬里蘭州巴爾的摩，UniversityPark出版社出版。例如脂質體的包膜見于美國專利4，235，877，Fullerton著述，蛋白質與大分子的結合，見于美國專利4，372，945，Likhite著述，美國專利4，474，757，Armor著述。
每一疫苗劑量中PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白的含量被選定為在典型疫苗中不出現明顯的、相反的副作用，而又誘導免疫保護應答的蛋白含量。由于采用的特異性免疫原不同以及疫苗中是否加入佐劑，這一蛋白含量也將隨之而變。一般地，人們希望每一疫苗劑量中含1-1000μg蛋白質，1-200μg更好。對一種特定的疫苗，可用標準方法來確定上述最佳含量，這些方法包括對接受試驗者的抗原效價及其他反應的觀察。起始接種后，在大約四周內要有選擇性地加強接受試驗者的疫苗劑量，只要感染的可能性還存在，這之后每六個月還要重復地加強疫苗劑量。
使用佐劑，如明礬(但不限于此)，可增強對PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA編碼序列-PreS2-S蛋白或粒子的免疫應答。
實例以下為此發(fā)明的實例，它是解釋性的，但不限于此。
所有百分比為重量百分比，所用溫度采用攝氏溫標。
DNA操作處理中使用的酶由BethesdaResearch實驗室、NewEnglandBiolabs和/或Boehringer得來，按提供者的說明操作使用。
酵母生長培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基YNB(不含氨基酸的)酵母氮源(Difco實驗室)，0.675%(W/V)，含2%(W/V)葡萄糖。
YEPD培養(yǎng)基1%(W/V)酵母浸汁，2%(W/V)胨，2%(W/V)葡萄糖。
DNA重組方法在《分子克隆》(“MollecularCloning”)中有敘述，T.Maniatis等，冷泉港實驗室(1982)ColdSpringHarborLab.(1982)。
PMSF苯甲基氟化磺酰。
以下為可能用到的縮略語PBS磷酸鹽緩沖液(每升)(pH7.4)8.0克NaCl
0.2克KCl1.15克Na2HPO40.2克KH2PO40.1克CaCl20.1克MgCl2·6H2OBSA牛血清清蛋白(A4378·Sigma)X-gal5-溴-4-氯吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷密蘇里州，圣路易斯Sigma化學公司生產的商業(yè)用品。
L-肉湯(每升)10克胰蛋白胨5克NaCl5克酵母浸汁1毫升0.1M MgSO4滅菌后加入無菌硫胺素(1mg/ml)5毫升。
要制成固體培養(yǎng)基，則每升中再加15克瓊脂。
實例1質粒pRIT10167的構建起始物是一段含有長度為2.1KbHindⅢ的酵母DNA片段的質粒p6Y，這段DNA編碼克隆pBR322上的TOB3基因。Bolivar等對pBR322已有描述(Gene，2，95-113，1977)。p6Y質粒由Musti等構建和特征化，從NationalInstituteofHealth的M.Rosenberg博士處得到該質粒。HindⅢ片段再次克隆到一個pBR322衍生物上，在該衍生物中，EcoRⅠ位點被破壞而得到質粒pRIT10164(非本質性的變動)。以下的操作都是為了制造出一個位于TDH3編碼順序的ATG密碼中堿基G處的BamHⅠ位點，還要得到一段具有TDH3啟動子活性的HindⅢ-BamHⅠDNA片段，此片段上的活性完整，不為操作過程而變化。如上述方法制得的pRIT10164DNA，經兩次CsCl-溴乙錠密度梯度離心純化，基本原理由Kahn等描述(MethodsinEnzymology，68，268，1979)。用75個單位的核酸內切酶XbaⅠ完全消化150μgpRIT10164DNA，用酚-醚提取，以乙醇沉淀，然后，以1μg/μl的濃度再懸浮于0.01M的二吡喃硫胺素-HCl緩沖液中。
用核酸酶Bal 31消化經上述XbaⅠ處理的20μg DNA樣品，可以切除ATG密碼與XbaⅠ位點之間的61對DNA堿基對。Bal 31的消化作用在如下條件進行30℃，1-3分鐘，在含600mM NaCl，12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA，20mM二吡喃硫胺素-HCl，pH3.1的緩沖液中進行，在200μl的反應終體積內，每20μg DNA用1個單位的Bal 31核酸酶。
加入EGTA(乙二醇雙乙胺醚-N，N′-四乙酸)，使其終濃度為20mM，以中止酶反應，樣品用等體積的酚、醚提取，用乙醇沉淀。每一DNA樣品又懸浮于20μl10mM，pH7.5的二吡喃硫胺素-HCl緩沖液中。
Bal31的酶解程度可這樣測定用核酸內切酶HpaⅠ消化約2.5μg每一DNA樣品，將HpaⅠ-XbaⅠ片段的大小與來源于pRIT10164的335bp長的HpaⅠ-XbaⅠ片段作一比較。人們發(fā)現用Bal31進行的2分鐘酶解可切掉pRIT10164的XbaⅠ-HpaⅠ片段上約41-88個核苷酸。
上述結果表明從XbaⅠ朝向ATP密碼的另一端也有相同數目的堿基對被切除。5μg經2分鐘Bal 31酶解后回收的DNA用核酸內切酶BamHⅠ消化，以酚提取，用乙醇沉降回收。在三磷酸脫氧核糖核苷酸存在下，用5個單位的T4多聚酶處理這個DNA使BamHⅠ及任何Bal 31的單股端填滿并使之末端補齊，然后用酚提取，以乙醇沉降回收。用5個單位的T4DNA連接酶處理2.3μg這種DNA，其中一半的連接混合物用于轉化大腸桿菌K12菌株MM294的感受態(tài)細胞，這種感受態(tài)細胞按照Cohen等方法制備(proc.Natl.Acad.Sci.69，2110，1972)。把1毫升轉化后的大腸桿菌菌體稀釋在含200μg/ml氨芐青霉素的350ml L-肉湯中，整個質粒DNA從最終培養(yǎng)物中提純。
80μg上述質粒DNA，它含有大量經Bal31去除約40-80個堿基對的質粒分子，先后進行如下酶解每75個單位的核酸內切酶HindⅢ消化，用96個單位的核酸內切酶BamHⅠ從那些質粒上釋放DNA片段，即那些經上述處理后又重產生BamHⅠ位點的質粒，也就是說，在Bal31消化的G殘基末端。這個DNA酶解物在1%制備瓊脂凝膠上電泳走帶，將需要的HindⅢ-BamHⅠ片段從凝膠上割上，根據片段大小1100-1000bp，將其切成兩段，一段代表1070bpDNA，另一段為1030bp的DNA。兩段瓊脂凝膠經冷凍和解凍循環(huán)，再以高速離心沉淀瓊脂，即可回收DNA。上述的上清液通過一個微孔GVMillex過濾器過濾，經兩次乙醇沉降回收DNA，再把DNA懸浮于20μl0.01MpH7.5的二吡喃硫胺素-HCl緩沖液中。
瓊脂凝膠電泳分析方法，與pRIT10164DNA的HindⅢ和XbaⅠ酶解物的比較，與入噬菌體DNA的HindⅢ和EcoRⅠ酶解片段的比較，都表明得到了兩個獨特的HindⅢ-BamHⅠ片段的類群，估計一個大小為1070bp，一個大小為1030bp(與長度為1120bp、來源于pRIT10164的親本HindⅢ-XbaⅠ片段相比)。約100ng的長為1030bpHindⅢ-BamHⅠ片段的類群與200ng質粒pUC9連接，后者已經核酸內切酶HindⅢ和BamHⅠ酶解、經堿性磷酸酶處理(見Shine，U.S.PatentNo.4，264，731)，連接的混合物用于轉化大腸桿菌菌株JM103的感受態(tài)細胞，該細胞經選擇為氨芐青霉素抗性的。進行有效的大腸桿菌菌株JM103的轉化可根據Cohen等在前面舉出的方法。
pUC9載體質粒和受體大腸桿菌菌株JM103均已由Vieira和Messing在“基因”(Gene，19，259，1982)中描述過，從J.Messing(Univ.ofMinnesota)處獲得。pUC9載體作為商品可從Amersham(Buckinghamshire，UnitedKingdom)和Pharmacia(Uppsala，Sweden)得到，大腸桿菌菌株JM103可從J.Messing(univ.ofMinnesota)得到。另一種具有大腸桿菌JM103特征的大腸桿菌菌株，即JM101，可從美國典型菌種保藏所(AmericanTpyeCultureCollection)，Rockville，Maryland)登記號ATCC33876獲得，它也能作為宿主用。在含有X-gal的培養(yǎng)基上，從98個試驗菌落里大約可得到每毫升400個氨芐青霉素抗性菌落。95個菌落為白色，表明在載體的HindⅢ和BamHⅠ位點之間成功地插入了一個外來DNA片段。
在生長培養(yǎng)基中加入壯觀霉素(150μg/ml)以放大質粒，然后，通過一個小樣操作步驟BirnboimandDoly，Nucl.Acid.Res.，7，1513，1979)，就可制備來源于單個轉化菌落的質粒。
重組質粒經核酸內切酶AVaⅡ和BamHⅠ雙重酶解后，在7.5%丙烯酰胺凝膠上分析，與含有pRIT10164的啟動子-N-末端區(qū)域的AvaⅡXbaⅠ片段相比較，還與pBR322DNA的HpaⅡ酶解片段比較。與pRIT10164相比時，在檢驗的36個質粒中，有35個里面存在一個AvaⅡ-BamHⅠ片段，相當于20-90個被切除的堿基對。選擇三種代表切掉了80個堿基對(pRIT10166)、50個堿基對(pRIT10167-表8)和45個堿基對(pRIT10165)的質粒進行更深入的研究。質粒DNA由CsCl-溴乙錠密度梯度離心制備，25μg每種質粒DNA都用EcoRⅠ酶解。EcoRⅠ酶解末端用r-32P-ATP標記，方法為采用Maxam和Gilbert的化學修飾法(Methods in Enzymology，65，499，1980)，變換激酶作用和每一質粒的HindⅢ-EcoRⅠ片段上的核苷酸序列。在每個重組質粒中pUC9載體部分標記和排列EcoRⅠ位點是確定鄰近BamHⅠ位點周圍序列的簡便方法，這一位點標志著TDH3DNA片段上的切除末端。這一序列分析表明，在質粒pRIT10166中，位于ATG密碼以上25個堿基對的5′一端非翻譯區(qū)域內的G殘基處，又產生了BamHⅠ位點;在pRIT10165中，BamHⅠ位點處于第三個密碼的第二個堿基處;在pRIT10167中，BamHⅠ位點處于ATG密碼的G殘基處。
因此，在pRIT10167上構建的TDH3DNA的HindⅢ-BamHⅠ片段含有所有TDH3啟動子活性所必需的序列，這一序列并未改變。
實例2載體pRIT10172的構建照實例1的方法制得的1050bpHindⅢ-BamHⅠ TDH 3 DNA插入段(來自pRIT10167)，再克隆于穿梭載體YEP 13上，Broach等描述(Gene，8，121，1979)，是在載體的2微米長DNA部分的HindⅢ位點與BamHⅠ位點間克隆的，從而得到重組質粒pRIT12159。然后，用核酸內切酶XbaⅠ和BamHⅠ消化pRIT12159 DNA，得到的1650bp片段代替與之相似的含arg3啟動子的XbaⅠ-BamHⅠ片段，而連結到質粒pRIT10774上。質粒pRIT10774由Cabezon等描述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，81，6594-6598，1986)，它包含有YEP 13復制子，已用體外方法從此復制子上切掉了天然載體的BamHⅠ和XhoⅠ位點，也含有包括arg3啟動子區(qū)域的一段1470bpHindⅢ-BamHⅠ插入段，還含有一段包括arg3轉錄終止區(qū)域的1150bpBamHⅠ-HindⅢ片段。由于TDH3啟動子插入段代替了pRIT10774上的arg3啟動子插入段，從而使得到的質粒pRIT10174含有一個單獨的BamHⅠ位點，這一位點位于TDH3啟動子插入段的ATG密碼處，同時，在1150bpBamHⅠ-HindⅢarg3DNA片段上，它為轉錄終止預先提供了功能信號。因此，外來DNA可在此位點被克隆。此外，這兩個DNA插入段被HindⅢ位點包圍。就使得表達獨立部分(盒)可以移動，它作為一個2200bpHindⅢ片段，能插入其他載體中。圖9是pRIT10172的一個限制性核酸內切酶的裂解圖。
實例3pRIT12290的構建照實例1的方法從-pRIT10167(圖8)制得的1050bpHindⅢ-EcoRⅠ片段，它含有HindⅢ-BamHⅠ TDH3啟動子片段和pUC9多連接物中的BamHⅠ-SmaⅠ-EcoRⅠ部分，再被克隆于pBR322誘導質粒的HindⅢ和EcoRⅠ位點之間，而這一質粒已通過加入T4DNA多聚酶和再連接作用去除了BamHⅠ位點之后的部分。最終得到的重組質粒被定名為pRIT12176。
按下面的實例4(b)的方法制得的pRIT10158(圖8)質粒DNA，用核酸內切酶EcoRⅠ消化，用T4DNA多聚酶處理，從而可填補EcoRⅠ單鏈延伸部分。這一制備物用核酸內切酶ClaⅠ進一步消化。pRIT10158 DNA的深入酶解樣品以核酸內切酶ClaⅠ和HindⅢ消化，用制備瓊脂凝膠電泳和洗脫就可得到一個具有arg3基因轉錄末端區(qū)域的1150bp Cla HaeⅢ片段。這一片段與經EcoRⅠ、T4DNA多聚酶、ClaⅠ處理的pRIT10158 DNA連結，連結混合物用于轉化大腸桿菌(E.Coli)菌株MM294的感受細胞，用前述的Cohen等(Cohen等(Cohen et al)方法，使之成為氨芐青霉素抗性。從轉化后的菌落里，可分離到一個定為pRIT10162的質粒，在這一質粒中，ClaⅠ-HaeⅢ arg3轉錄終止片段被插入pRIT10158的ClaⅠ和已插入的EcoRⅠ位點之間，同時，在這質粒上重建了EcoRⅠ位點。圖8是一張說明pRIT10162制備的流程圖。pRIT10162的質粒DNA用核酸內切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化，與pRIT12176的質粒DNA(用上述方法制備，也以核酸內切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化(混合)，連接起來的混合物用于轉化大腸桿菌K12菌株MM294的感受態(tài)細胞以得到氨芐青霉素抗性菌，如上舉出的Cohen等的方法。從這一轉化過程的菌落里可得到一個pRIT12208質粒，在此質粒中，來自pRIT10162的一個1930bp EcoRⅠ-PstⅠ的小片段已經連接在來自pRIT12176的一個4630bp EcoRⅠ-PstⅠ的大片段上，而且，arg3轉錄終止區(qū)域就與TDH3啟動子并列排置在這個質粒中。arg3和TDH 3 DNA區(qū)域可以作為一個單個的2200bp片段被核酸內切酶HindⅢ從pRIT12208上酶切下來。考慮到載體的序列，為了得到另一方向的這一片段把pRIT12208的2200bp HindⅢ片段再克隆到一個pBR322衍生質粒的HindⅢ位點上，在此衍生質粒中，已通過加入T4DNA多聚酶和再連接作用分別切除了天然的EcoRⅠ和BamHⅠ位點。得到的這個質粒定為pRIT12290，它與pRIT12208相比，在載體序列的相反方向插入了2200bp的HindⅢ片段。圖10為pRIT12290的一個限制性核酸內切酶的酶解圖。在pRIT12208和pRIT12290載體中，TDH3啟動子和arg3轉錄終止片段被專一性的BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的限制性位點分開，這些位點對于克隆具有密碼序列的DNA片段十分有用，啟動子和轉錄終止區(qū)域作為轉移到其他載體上去的一個獨立部分(盒)，可以一起從一個2000bpHindⅢ片段上切下來。
BamHⅠ位點尤其有用，因為它位于TDH3基因的ATG密碼處，可以用于TDH3啟動子和其他基因的融合，從而能在酵母中表達其他基因(如下面的實例)。用核酸內切酶HindⅢ消化酵母穿梭載體上的插入段，或者用其他限制性內切酶在插入段的側面限制性位點上酶切，就能以盒或獨立單位的形式從pRIT12208或pRIT12290衍生物上得到這種融合體。
實例4質粒pRIT10677，pRIT10909和pRIT10158的構建a)pRIT10677從pRIT10616(Harfordetal.，Dev.Biol.Standard，54，125-130，1983)上切下一段已克隆的HBVDNA的1372bpBamHⅠ片段，這一片段再與經核酸內切酶BamHⅠ消化過的pBR327DNA混合并連接。這一BamHⅠ片段具有一部分HBs抗原前體區(qū)域，以及HBs抗原編碼序列和3′一端非編碼序列。從連接混合物中，可以選到一個pRIT10677質粒，在該質粒中，HBVBamHⅠ片段插入載體的BamHⅠ位點，其插入方向正是為了使HBVDNA中的XbaⅠ位點鄰接于pBR327載體的SaLⅠ位點。圖8是說明pRIT10677制備的流程圖。
b)pRIT10909來自質粒pMC200〔從美國典型菌種保藏所獲得，登記號為ATCC39131，無限制〕的3300bpHindⅢ片段(Crabed M et al描述，EMBO J.，2，205-212，1983)，再被克隆到pBR322衍生質粒上，在這一質粒中，通過加入T4DNA多聚酶和再連接作用已切除了天然的EcoRⅠ位點。選出得到的重組質粒pRIT10158(圖8)，在此重組質粒中，HindⅢarg3基因插入段具有arg3基因的區(qū)域，這一區(qū)域又相鄰于修飾過的pBR322載體上的ClaⅠ位點。由pRIT10158可獲得一個1150bp的ClaⅠ-HaeⅢ片段，它帶有arg基因的轉錄終止區(qū)域。這個1150bp的片段又與經內切酶ClaⅠ和HpaⅠ消化過的質粒pRIT10677連接(如上述a)部分中制備法)，使得在HBsAg密碼區(qū)以下的HpaⅠ位點處的arg3終止區(qū)域可被融合。最終的質粒是pRIT10909。圖8是一張說明pRIT10909制備法的流程圖。圖3是pMC200的限制性核酸內切酶和酶解圖。
實例5質粒pRIT10911及pRIT10912的構建pRIT10167(實例1)上的BamHⅠ位點以及HBsAg基因前體區(qū)域中的天然BamHⅠ位點(HBsAg基因來自克隆在pRIT10616上的adw血清型HBV病毒-Harford et al.，Dev.Biol.Standard，54，125-130，1983)都位于同一翻譯閱讀框內，使得提供ATP密碼的TDH啟動子片段與HBsAg前體序列的42個密碼融合，而這段序列又位于HBsAg編碼順序自身的226個密碼之前。這一融合的HBV DNA片段來自質粒pRIT10909(見上面實例4，b))，該質粒含有一個編碼部分HBsAg前體區(qū)域的935bp BamHⅠ HpaⅠ插入段，還含有完整的HBsAg編碼順序以及已被融合的128bp的3′非翻譯DNA。在HpaⅠ位點之下，有一個來自pRIT10158的1150bp HaeⅢ-ClaⅢDNA片段，具有arg3轉錄終止區(qū)域。RIT10158已在上面實例4，B部分描述。從pRIT10909上切下2085bp的EcoRⅠ-BamHⅠ片段，再插入pRIT10167的EcoRⅠ和BamHⅠ位點之間(方法在A例中描述)，從而構建出質粒pRIT10911。來自pRIT10911(含酵母DNA轉錄信號和HBsAg編碼序列)的3135bpHindⅢ片段則插入YEP13穿梭載體上，從而得到質粒pRIT10912。圖8為說明pRIT10911制備方法的流程圖。
實例6質粒pRIT10903和pRIT10914構建從一段至少編碼了成熟HBsAg密碼序列N末端部分的DNA片段的5′末端，去掉其多余的核苷酸，是下述構建工作的目的，從而可在第二個密碼的第一個堿基處造出一個6個堿基對的限制性位點。然后，將得到的片段與啟動子片段融合，在得到的片段上，其起始密碼處帶有6個堿基對的限制性位點，用錄豆或S1核酸酶切去單鏈延伸部分，選出連接所需要的鈍末端。如Rosenberg等述，“酶學方法”(MethodsinEnzymology，101C，123(1983))。
來自pRIT10616編碼HBsAg基因的HBV DNA上1225bp FunDⅡ片段(見Harford et al.(1983)Devel.Biol.Standard.，54，125-130)，從該質粒上切下，與人工合成的八聚體EcoRⅠ連接體相連，然后再克隆到載體pACYC184的EcoRⅠ位點上，得到pRIT10679(圖8)。載體pACYC184從S.Cohen處得到，Chang A.C.Y.和Cohen S.(1978)描述過，“細菌學雜志”(J.Bacteriol.，134，1141-1156)。pACYC184也可從美國典型菌種保藏所登記號ATCC37033)獲得。從這個EcoRⅠ(FunDⅡ)片段，可得到一個125bp的EcoRⅠ-XbaⅠ片段，這一片段包括HBsAg前體的C-端區(qū)域、HBsAg的ATG密碼以及90bp的HBsAg編碼序列。這一125bp的EcoRⅠ-XbaⅠ片段被插入pRIT10158的EcoRⅠ和XbaⅠ位點。(見上面實例4(b))。得到的質粒pRIT10903含有一個單個的EcoRⅠ位點，這一位點處于arg3DNA和HBV DNA的連接處，該質粒還含有一個單個的XhoⅠ位點，這位點在arg啟動子區(qū)域內。圖8是一個說明pRIT10903制備法的流程圖。
用CsCl-溴乙錠密度梯度離心制備pRIT10903質粒DNA，用80單位的EcoRⅠ核酸內切酶消化150μg這個質粒，用酚提取，乙醇沉降，再懸于pH7.51μg/μl的10mM二吡喃硫胺素-HCl緩沖液中。DNA分為3個50μg樣品，在30℃下以核酸酶Bal31溫育50、75和90秒。每一反應混合物含有實例1舉出的同樣的反應緩沖液，還含50μgEcoRⅠ酶解過的pRIT10903DNA以及2.5個單位的Bal31核酸酶，最終體積為500μl。加入終濃度為20mM的EGTA終止反應，在冰上冷卻，用等體積的酚提取，乙醇沉淀。每個Bal31處理過的DNA樣品溶入50μl100mM二吡喃硫胺素-HCl緩沖液中，用核酸內切酶BstEⅡ消化2.5μgDNA，在7.5%丙烯酰胺凝膠上與經EcoRⅠ和BstⅡ核酸內切酶處理而釋放出一個285bp片段的pRIT10903相比較。可以發(fā)現，在30℃下用Bal31核酸酶處理75秒能從這個EcoRⅠBstEⅡ片段上減少10-60堿基對，得到一系列不連續(xù)的帶，代表切除DNA上的10、30、45及60個堿基對。從FunDⅡ原始位點切去29個堿基對將會去掉所有的HBsAg前體DNA和HBsAgATG密碼。
5μg被Bal31處理75秒的pRIT10903DNA再用8個單位的核酸酶XhoⅠ消化，以酚提取，用乙醇沉淀。這個DNA再在三磷酸脫氧核苷酸存在下與5個單位的TDNA多聚酶溫育，以便補上XhoⅠ和Bal31的末端，再以酚提取，以乙醇沉淀。然后把得到的DNA在16℃下與5個單個TDNA連接酶溫育16小時，混合物用于轉化大腸桿菌K12株系MM294的感受態(tài)細胞，以得到氨芐青霉素抗生菌，接上面舉出的Cohen等的方法。平板培養(yǎng)后，可獲得2000個氨芐青霉素抗性群落/毫升。用小樣方法(見上面舉出的Birnboinetal.)從47個單個菌落制備質粒，發(fā)現其中有23個保留了一個XhoⅠ位點，說明在原始XhoⅠ位點上的插入成功了，同時也成功地連接在一個以G殘基為末端的3′端。這23個質粒進一步用核酸內切酶XhoⅠ和XbaⅠ消化，以便能在與pRIT10903的原始EcoRⅠ-XbaⅠ片段比較時，確定限制性小片段的大小。
一些質粒的確定，要切去25-40個堿基對。質粒pRIT10914，估計含有95-1000個堿基對的XhoⅠXbaⅠ片段，被選來進行深入研究。圖8是說明pRIT10914制備法的流程圖。這一質粒的DNA由CsCl-溴乙錠密度梯度離心法純化，取25μg這種DNA，用140個單位的核酸內切酶XbaⅠ消化。
XbaⅠ末端被換成r-32P-ATP標記物，以15個單位的核酸內切酶HindⅢ酶解標記過的DNA。765bp的HindⅢ-XbaⅠ小片段用丙烯酰胺凝膠電泳和電洗脫分離出來，再用乙醇沉淀。用Maxam和Gilbert的化學修飾法(上面已舉出)從標記的XbaⅠ末端排序，即可確定XhoⅠ位點處及其附近的核苷酸序列。排序數據表明XhoⅠ位點在HBsAg編碼序列第二個密碼的第一個堿基處。
XhoⅠCTCGAGAACHBsAg核苷酸因此，在切除了單鏈末端后，這一片段非常適合于與pRIT10167(實例1)上的TDH3啟動子片段的BamHⅠ延伸部分融合。
實例7質粒pRIT12211、pRIT12209、pRIT12230及pRIT12265的構建實例1制備的質粒pRIT10911，被用作進一步操作的骨架。為了引入需要的限制性位點，用核酸內切酶BamHⅠ和XbaⅠ消化這個質粒，切下的片段被質粒pRIT10158(實例4)的一個2275bpBamHⅠ-XbaⅠ片段所代替。由此操作得到質粒pRIT12211，在此質粒中，HindⅢ-BamHⅠ TDH3啟動子片段與BamHⅠ-XbaⅠ片段相鄰，而后者又含有一個XhoⅠ位點，這一位點之后為一個XbaⅠ-HindⅢ片段，此片段又包括了HBsAg編碼序列的C-末端區(qū)域和128bp的3′非編碼DNA(該DNA已與1150bp arg3轉錄終止區(qū)域融合)。圖8為一說明pRIT12211制備的流程圖。用核酸內切酶XhoⅠ和XbaⅠ酶解質粒pRIT12211，可切去一個1600bp的片段，這一片段被經修飾過的HBsAg DNA(來自pRIT10914)上的94bp XhoⅠ XbaⅠ片段代替，如實例5所述方法。經XhoⅠ和XbaⅠ酶解過的pRIT10914 DNA先在丙烯酰胺凝膠上電泳純化，然后電洗脫適當的凝膠塊，用乙醇沉淀，即件的94bp的片段。
由于引入94bp片段(見圖8)而得到的質粒pRIT12209，經CsCl-溴乙錠密度梯度離心，再用90個單個的內切酶BamHⅠ和60個單位的內切酶XhoⅠ消化50μg pRIT12209 DNA，就可切掉TDH3啟動子和HBsAg編碼區(qū)域間990bp的外來DNA，然后用酚提取，用乙醇沉淀。16μg的這種DNA在30℃下與20個單位的綠豆核酸酶(PL Bio-Chemicals)溫育30分鐘(總體積為125μl)。溫育用緩沖液為30mM乙酸鈉(pH4.6)、250mM NaCl、1mM ZnCl2和%5甘油。加入使終濃度達到0.2%的十二烷基硫酸鈉以終止反應，用等體積的酚提取，再用乙醇沉降。經綠豆核酸酶處理的0.5μg的該等分樣品在16℃下與2個單位的T4DNA連接酶溫育16小時，再用2個單位的核酸內切酶BamHⅠ酶解以破壞任何殘留的載體分子。得到的這一混合物用于轉化大腸桿菌K12株系MM294的感受態(tài)細胞以選擇氨芐青霉素抗性菌，根據上面的Cohen等方法，從轉化混合物中可回收約2000個氨芐青霉素抗性菌落/毫升，采用小樣方法(按上舉出的Birnboin等方法)，從上述24個轉化體的擴大培養(yǎng)中可制備質粒。
經核酸內切酶HindⅢ消化后，24個質粒中有16個釋放出大小為2700bp(載體pUC9)和3000bp的兩個DNA帶。3000bp帶正是HBsAg編碼序列和arg末端區(qū)域與TDH3啟動子片段融合所期望的長度的帶。
四個候選質粒用于進一步的研究。每一質粒DNA用核酸內切酶XbaⅠ消化，用交換激活作用標記上r-32P-ATP，再用核酸內切酶HindⅢ消化，用丙烯酰胺凝膠電泳和電洗脫分離標記過的1190bpHindⅢ-XbaⅠ片段，再以乙醇沉淀。每個片段的順序用上面舉出的Maxam及Gilbert化學修飾法確定。發(fā)現有2個質粒具有正確的ATGGAGAAC序列，這一序列使TDH3啟動子區(qū)域與HBsAg基因理想地融合。上述質粒之一，即質粒pRIT12230，被用于進一步操作。圖8是說明pRIT12230制備法的流程圖。將質粒pRIT12230的DNA用核酸內切酶HindⅢ消化，含有與TDH3啟動子融合的HBsAg編碼序列的3000bp片段被連接在穿梭載體YEP13上。用Ito等的轉化方法(J.Bact.，153，163，(1983))將得到的質粒pRIT12265轉化到酵母株系DC5上(MATa，Leu2-3，LeU2-112，his3，can1-11)〔從J.Broach(StateUniversityofN.Y.StonyBrook)處得到〕，這一菌株也可從美國典型菌種保藏所獲得，登記號ATCC20630)。
實例8質粒pRIT12288、pRIT12322的構建質粒pRIT12230(實例7)上的結構包括128bp非編碼HBVDNA，這個DNA位于HBsAg結構基因終止密碼的3′下端。
要切除這段128bp的DNA，就需用核酸內切酶AccⅠ和EcoRⅠ來消化約25μG的pRIT12230，照實例1方法。pRIT12230含有一個單個的AccⅠ位點，這一位點在S-基因編碼序列處，即TAA終止密碼前7個核苷酸處。酶解后的DNA在1%瓊脂凝膠上電泳，較大的4200bp片段通過電洗脫凝膠和用乙醇沉淀回收得到。
合成具有如下序列的12個和14個核苷酸鏈的人工DNA連接體分子以插入在pRIT12330的AccⅠ和EcoRⅠ位點之間5′ATACATTTAACG3′12個核苷酸3′TGTAAATTGCTTAA5′14個核苷酸這樣就會恢復正確的C-末端HBsAg密碼、TAA終止密碼，同時，為了增加轉錄終止片段，還提供了一個在TDH3啟動子或HBsAg編碼序列的其他位置所沒有EcoRⅠ位點。
100微微克分子合成的12個核苷酸單鏈與100微微克分子合成的14個核苷酸單鏈混合一起，終體積達到10-20μl，在70℃下加熱15分鐘，3小時后緩慢恢復到室溫，使兩條鏈沿其互補序列退火。退火后的混合物中加入約0.15微微克分子(400ng)pRIT12230的4200bp AccⅠ-EcoRⅠ片段，還加入10倍濃度的連接緩沖液以及2個單位的T4DNA連接酶。
這一混合物在16℃溫育4小時，再加入2個單個的TDNA連接酶，再置冰上過夜。連接后的混合物用于轉化菌株MM294的感受態(tài)細胞以得到氨芐青霉素抗性菌，照Cohen等方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，69，2110，1972)。用Birnboim和Doly(Nucl.Acids.Res.，7，1513，1979)的快速方法從12個或更多的單個菌落制備質粒，用限制性核酸內切酶分析法來檢驗。帶有AccⅠ插入EcoRⅠ連接體片段的質粒，在用AccⅠ或EcoRⅠ酶解時，會顯示出一個4200bp的DNA帶。用Maxam和Gilbert的化學修飾法(MethodsinEnzymology，65，499，1980)從EcoRⅠ或AccⅠ位點進行DNA序列分析，就可檢驗連接體插入該質粒的正確性。
為了得到一個轉錄終止片段，就得用EcoRⅠ內切酶和堿性磷酸酯酶(ShineJ.U.S.Patent4，264，731)處理帶有AccⅠ-EcoRⅠ連接體插入段的質粒(前面所述)。pRIT10162的2650bpHindⅢ片段(實例3制得)再被克隆到pBR327載體質粒的HindⅢ位點上，構成質粒pRIT12288。pBR327已由Soberon等描述(Gene.，9，287-305，1980)，可以用下述實例10、b部分的方法從質粒pRIT12309制得，pRIT12309可從美國典型菌種保藏所，登記號ATCC67187(AmericanTypeCultureCollection)獲得。圖8為表明pRIT12288構建過程的流程圖。
pRIT12288上的HindⅢ片段與arg3轉錄終止區(qū)域鄰接，這一區(qū)域具有約一半的pBR327上的EcoRⅠ和ClaⅠ限制性位點。從pRIT12288得到一個1180bp的EcoRⅠ片段，它帶有arg3轉錄終止區(qū)域。這一片段與經EcoRⅠ消化、堿性磷酸酯酶處理的pRIT12230衍生物(如上所述)連接，還要檢驗由連接混合物得來的質粒中1180bp EcoRⅠ片段的插入情況和方向性。用內切酶HindⅢ消化質粒可得知插入段的方向性，如果是所需要的方向，就會釋放出2880和2720bp的片段。
在構建的質粒pRIT12322中，AccⅠ-EcoRⅠ連接體取代了128bp不需要的HBVDNA，在此質粒上，來自pRIT12288的1180bpEcoRⅠ片段以理想的方向性存在，即位于HBsAg編碼序列以下。從pRIT12322上可切下一個2900bp的HindⅢ片段，該片段具有合成HBsAg的獨立表達部分，包括THD3啟動子，HBsAg編碼序列以及arg轉錄終止區(qū)域。圖8是表示pRIT12322構建方法的流程圖。見圖11，是pRIT12232的限制性核酸內切酶解圖。表明了上面哪些部分來自pRIT12288和pRIT12230。
實例9質粒pRIT12329的構建如上述實例8，pRIT12322含有一個2900bp的HindⅢ片段，該片段具有來自TDH3啟動子的為HBsAg表達必需的所有信號。這一段獨立部分連接在一個穿梭載體中用來引入酵母細胞里。用核酸內切酶HindⅢ和堿性磷酸酯酶消化穿梭載體YEP13的DNA，這個DNA用工作HindⅢ片段(來自pRIT12322)插入的受體。(pRIT12322的制備在實例8中已述)由此分離出質粒pRIT12329，它具有YEP13復制子和2900bp的HindⅢ獨立片段(實例8描述)。
實例10為雜種抗原HBsAg-CS在酵母中表達的質粒載體構建A.質粒pRIT12573和pRIT12574的構建從WalterReedArmyInstituteofResearch獲得質粒WR301。它是一段長2.3Kb的EcoRⅠ片段插入載體pUC8構成的，它上面的這一段來自λmPf1(Dame等，Science，225，593-599，1984)，λmPf1編碼惡性瘧原蟲的完整的環(huán)狀體蛋白質基因。圖2A表明了克隆λmPf1的限制性系列圖和排序方式。圖中限制性酶切位點的位置由序列分析和酶解方法來確定和證實A，AvaⅡ;Ac，AccⅠ;B，BstnⅠ;D，DraⅠ;Dd，DdeⅠ;F，FokⅠ;N，NdeⅠ;R，RsaⅠ;S，StuⅠ;T，TthⅢ;Tq，TaqⅠ;X，XhoⅡ。箭頭表示確定出的原點、方向以及序列的范圍。cs蛋白質編碼基因用一條粗線表示。圖3A顯示惡性瘧原蟲來源的cs蛋白基因的核苷酸序列。λmPf1中的cs蛋白基因的核苷酸序列也表示出來了。載體pUC8由Vieria等描述(Gene，19，259，1982)。pUC8作為商品可從Amersham和Pharmacia得到。帶有cs蛋白編碼序列(除去開始的52bp)、(圖12)來自質粒WR201的一個1215bp的StuⅠ-RsaⅠ片段經電洗脫，從7.5%聚丙烯酰胺電泳凝膠上純化出來。這一片段再經Sau3A酶解產生較小的片段，這些小片段包括為cs蛋白的16個重復四肽編碼的192bpSau3A片段，三個相同的為cs蛋白2個重復四肽編碼的24bpSau3A片段。
質粒pRIT10911(實例5方法制備)是帶有一個3136bp的HindⅢ盒的pUC9衍生物，它含有一個1050bpHindⅢ-BamHⅠ酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TDH3)啟動子片段(提供ATG)，這一片段在BamHⅠ位點與HBV DNA的一個935bp BamHⅠ-HpaⅠ片段融合，而后者又編碼Pre-S2區(qū)域C-端的42個氨基酸以及3′一非編碼DNA的128bp和S基因(血清型adw)的226個氨基酸。S基因處于帶有arg3轉錄終止子的1150bp酵母DNA片段旁邊。pUC9已被Vieria等描述(Gene，19，259-268，1982)。位于ATG起始密碼處的pRIT10911 BamHⅠ位點與惡性瘧原蟲的cs重復性抗原決定簇上Sau3A位點處于同一位段。質粒pRIT10911的DNA經核酸內切酶BamHⅠ消化和堿性磷酸酯酶處理后，用酚提取，乙醇沉降回收。取0.2μg這種DNA與0.2μg經Sau3A消化的StuⅠ-RsaⅠ cs基因片段(如上法制備)混合，用T4DNA連接酶處理，連接混合物用于轉化大腸桿菌K12株系MM294的感受態(tài)細胞(Cohen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，69，2110，1972)。在生長培養(yǎng)基內加入壯觀霉素(300μg/ml)使質粒擴增，然后采用一種小樣方法(Birnboim et al.Nucleic Acids Research，7，1513，1979)從單個的轉化群落中得到32個質粒。重組質粒經核酸內切酶BamHⅠ和XbaⅠ的兩次酶切后，在7.5%丙烯酰胺電泳凝膠上分析，與pRIT10911(含Pre S2區(qū)域前體的初始42個氨基酸編碼序列和HBsAg區(qū)域起始部分)的219bp BamHⅠ-XbaⅠ片段，也與HaeⅢ酶切過的φX174DNA片段比較。
在這32個質粒中，一個重組質粒顯示出有一個411bpBamHⅠXbaⅠ片段，這一段相當于正確取向的192bpSau3A插入段，它被定為pRIT12572。另一重組質粒表明具在一個243bp的BamHⅠ-XbaⅠ片段，它相當于正確取向的24bpSau3A插入段，被定為pRIT12571。圖12為說明pRIT12571和pRIT12572制備法的流程圖。
pRIT12572和pRIT12571的HindⅢ片段，它含有TDH3啟動子，cs-HBsAg雜種編碼序列以及arg3終止區(qū)域，它們被克隆到YEP13上，分別得到質粒pRIT12574和pRIT12573(圖12)。YEp13由Broach等描述(Gene，8，121-133，1979)。圖12為說明pRIT12573和pRIT12574制備的流程圖。
通過轉化乙酸鋰處理過的細胞(Itoetal.J.Bacteriol.153，163-168，1983)、選擇亮氨酸非依賴型、可將質粒pRIT10912、pRIT12574和pRIT12573引入啤酒酵母株系DC-5(a，Leu2-3，Leu2-112，his3can1-11)和啤酒酵母株系10S44C(pep4-3，Leu2-3，Leu2-112)中，這些菌株來自M.Crabeel(CeriaInstitute，Anderlecht，Belgium)(見Cabezon，T.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6594-6598，1984)。酵母菌株DC5按1982年6月2日“布達佩斯條約”(BudapestTreaty)規(guī)定存放于美國典型菌種保藏所，登記號ATCC20819。酵母菌株10S44C根據1986年8月18日“布達佩斯條約”規(guī)定存放于美國典型菌種保藏所，登記號ATCC20819?？梢灶A言，所期望的pRIT12573雜種蛋白質含277個氨基酸，對pRIT12574來說，雜種蛋白質含有333個氨基酸。
在上面得到的載體上加入或擴大cs抗原決定簇區(qū)也同樣可能。例如，在質粒pRIT12572和pRIT12571上，多出的cs蛋白DNASau3A片段，如192bp或24bp的Sau3A片段，可以下法連接到BamHⅠ位點上用核酸內切酶BamHⅠ和堿性磷酸酯酶處理pRIT12572或pRIT12571的質粒DNA。質粒WR201(如上法制得)的1215bpStuⅠ-RsaⅠ片段經核酸內切酶Sau3A消化后，釋放出帶有重復四肽的192bp和24bp的片段。這些片段再與經BamHⅠ和堿性磷酸酯酶處理過的pRIT12572或pRIT12571載體混合，再用TDNA連接酶處理得到的混合物，用常規(guī)方法轉化到大腸桿菌K12細胞中，選擇氨芐青霉素抗性菌。從轉化后的菌落得到的質粒用核酸內切酶消化以檢查BamHⅠ-XbaⅠ片段的大小，與經同樣酶解的pRIT12572或pRIT12571的DNA比較，尤其要與pRIT12572和pRIT12571中的411bp和243bp的BamHⅠ-XbaⅠ片段比較，它們帶有cs重復段和部分PreS2-S編碼序列之間的融合物。這些片段上增加192bp或24bp說明一個重復四肽插入了pRIT12572和pRIT12571上的BamHⅠ位點。這些質粒上存在著一個BamHⅠ位點，表明192bp或24bpSau3A片段以正確方向插入，在ATG密碼處融合。若需要進一步引入編碼cs重復四肽的192bp或24bpSau3A片段，在雜種粒子上延長cs四肽區(qū)域，也可以重復上述步驟。正如前面所述，來自pRIT12572或pRIT12571(帶有表達獨立部分或盒)這種衍生物的HindⅢ片段，可被切下來，插入YEp13或其他合適的酵母克隆載體中，用常規(guī)技術引入酵母細胞。
(B)pRIT12309、pRIT12314的結構，含有酵母中完整的2微米DNA序列的表達穿梭載體pRIT12377的構建質粒pRIT12309含有來自酵母、克隆于質粒載體pBR327的EcoRⅠ位點上的完整的6318bp2微米長DNA序列。這一段6318bp2微米長的DNA序列來自質粒pCV19(該質粒從J.Broach，PrincetonUniversity，NJ.獲得)。1986年8月18日，質粒pRIT12309被存放在美國典型菌種保藏所的大腸桿菌K12MM924菌株中，這是根據布達佩斯條約的規(guī)定，這個菌的登記號為ATCC67187。圖13是pRIT12309的核酸限制內切酶圖。在這個分子上有兩個EcoRⅠ位點，通過其中的一個插入2μDNA序列的pBR327，以阻斷2μA編碼區(qū)，結果雜種分子pRIT12309對A基因功能無效，這就是所謂的FLP功能。關于2μ結構和功能參看下列文獻。(TheMolecularBiologyoftheyeastSaccharomycesLifecycleandInheritancePP.445-470.StrathernJ.N.，JonesE.W.andBroachJ.R.(Eds)，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1981)。
Soberon等(Gene，9，287-305，1980)描述了質粒pBR327，并從F.Bolivar(DepartmentofMolecularBiology，NationalUniversityofMexico，Mexico20DF)那里得到了這個質粒。對熟悉這項工作的人來說用任何一種常規(guī)的方法都可以從存放在美國典型菌種保藏所的大腸桿菌K12即ATCC67187菌株制備pRIT12309質粒DNA，再從質粒pRIT12309復原pBR327。方法如下用EcoRⅠ核酸限制性內切酶消化這種DNA，再用聯結混合物將DNA消化物和轉化感受細胞大腸桿菌K12細腸聯結，使其抗氨卡青霉素或四環(huán)素。有相當數量的轉化體菌落將含有質粒，在質粒中只有pRIT12309的pBR327部份，而不具有任何2μDNA片段。
從質粒pRIT12290(實例3中描述過)得到一個2850bp ClaⅠ-SalⅠ片段，該片段含有TDH3-arg3表達盒和側翼pBR322順序，將該片段再克隆到Cla和Sal位點之間的pRIT12309載體上。將得到的質粒pRIT12314用SalⅠ核酸限制性內切酶消化，并與來自含有酵母Leu2基因的YEp13的2218bp SalⅠ-XhoⅠ片段聯結。圖14是制備pRIT12314的程序表。YEp13可以從美國典型菌種保藏所得到，其登記號為ATCC37115。用聯結混合物轉化JA221菌株的感受細胞，JA221菌株的感受細胞是用Cohen等的方法(見上述)制備的，轉化使之不需要亮氨酸，但抗氨卡青霉素。
JA221菌株可以公開買到，也可以從M.Rosenberg，SmithKline和FrenchLaboratoriesInc.Philadelphia得到，也可以從美國典型菌種保藏所得到，其登記號為ATCC33875。
質粒pRIT12544是從這個轉化作用中形成的一個菌落得到的，在轉化中有一段2218bpSalⅠ-XhoⅠLEU2基因片段被插入質粒pRIT12314的SalⅠ位點上。這種插入傾向于在靠近TDH3-arg表達盒一側創(chuàng)造一個SalⅠ位點。質粒pRIT12544是一種大腸桿菌-酵母穿梭載體。這種載體具有單一的BamHⅠ和SmaⅠ位點，這些位點位于TDH3啟動區(qū)和arg3轉錄末端區(qū)之間，這里很適合插入DNA編碼序列以完成它們從啟動區(qū)開始的表達。圖14是制備pRIT12544的程序表。
(c)質粒pRIT12658的構建按照實例10、A部份所描述的方法制備YEp13的衍生物，pRIT12574的一段3328bp HindⅢ片段，再克隆到pBR322ΔBamHⅠ質粒上(由于T4DNA多聚酶的填入而破壞了BamHⅠ位點)，得到質粒pRIT12608，在這個質粒中BamHⅠ位點位于cs-HBsAg編碼序列的ATG啟始編碼上，這一點是獨特的(圖15)。從含有cs-HBsAg編碼順序，arg3轉錄末端區(qū)和側翼pBR322序列的pRIT12608質粒得一段2550bp BamHⅠ SalⅠ片段，再克隆到質粒pRIT12544(圖15)的BamHⅠ-SalⅠ位點，如上所述，給出質粒pRIT12658(圖15)。在TDH3啟動子的控制下，這一交換就將cs-HBsAg編碼序列放到一個完整的2μ酵母穿梭載體上了。圖15是制備質粒pRIT12658的程序表。
實例11酵母中雜種蛋白的合成根據Ito等(J.Bacteriol.，153，163-168，1983)的方法，用質粒pRIT10912(實例5)，pRIT12573(實例10)，pRIT12574(實例10)，或pRIT12658(實例10)，或質粒pRIT12329(實例9)和pRIT10172(實例2)分別轉化啤酒酵母(S.cerevisiae)DC5或10S44C菌株，并在缺少亮氨酸的液體培養(yǎng)基中(YNB或YNB+80μg/ml組氨酸)培養(yǎng)，在對數生長期中期收集細胞。用離心法收集1-2ml培養(yǎng)物中的細胞，并將其懸浮于含有20%甘氨酸，4%SDS，6M尿素和10%2-巰基乙醇的0.125MTris-HCl(pH6.8)緩沖液50μl中，于100℃溫育5分鐘后，樣品一分為二。按照Laemmli(Nature，227，680，1971)的方法將二份樣品去電泳，分離膠12.5%，堆積膠5%。
用蛋白免疫吸印技術鑒定HBsAg和cs蛋白序列(See.Burnette，Anal.Biochem.，112，195-203，1981;Gershoni and Palade，Anal.Biochem.，131 1-15，1983;Towbin and Gordon，J.Immunol.Methods，72，313-340 1984)。當電泳吸印蛋白于硝酸纖維素濾膜上(Schleicher and Schüll，0.45μ)(Towbin et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，U.S.A.，76 4350-4354，1979)，濾膜在使用前要預先在含3%明膠的PBS中溫育，37℃，1小時，然后用含0.1%吐溫20的PBS洗5次，每次5分鐘。將濾膜的一半在室溫下與含有五種抗cs蛋白的單克隆抗體混合物在含1%明膠的PBS中處理一小時(Dame et al.，Science，225，593-599，1984)。另一半與抗HBsAg，HepYTAS12的單克隆抗體在含1%明膠的PBS中處理。HepYTAS12是一種抗體，抗純的酵母衍生物HBsAg，HBsAg直接抗還原的或變性的抗性抗原決定簇。用含有0.1%吐溫20的PBS洗濾紙片(filter sheets)5次，每次5分鐘。然后放于含有第二次生物素化的羊抗鼠抗體(Amersham)和1%明膠的PBS中，在室溫下溫育一小時。再用含0.1%吐溫20的PBS洗5次，每次5分鐘。再在室就下與鏈親合劑-生物素化的辣根過氧化酶(HRP)復合物(Amersham)溫育30分鐘。濾紙片再用含0.1%吐溫20洗3次，每次5分鐘。最后，放于含有30μlH2O2和HRP顯色劑(含4-氯萘酚(BioRad)，30mg/10ml甲醇)的50ml PBS中溫育?？乖姆肿恿渴峭ㄟ^預先染色的蛋白標計，卵清蛋白，α-胰凝乳蛋白酶朊，β-乳球蛋白，溶菌酶和細胞色素C(BRL)來估算的。
用pRIT12573轉化的酵母菌株DC5和10S44C都能產生一種抗原，它能同抗-cs和抗-HBsAg的抗體反應，其分子量大約是30000Kd。用pRIT12574或pRIT12658轉化的兩個酵母菌株DC5和10S44C產生一種抗原，它能同抗-cs和抗-HBsAg的抗體反應，其分子量為37000Kd。有些低分子量抗原也被指示出來，這表明雜種蛋白有些降解。含有質粒但不具有任何cs和HBsAg順序(pRIT10172)的對照細胞不表現任何反應。含有質粒，但只具有HBsAg順序(pRIT12329或pRIT10912)的對照細胞僅對抗-HBsAg抗體有反應。
這些結果表明，用含有cs編碼序列同相位融合到PreS2-HBsAg編碼序列中的質粒轉化酵母，則酵母細胞中就能合成一種雜種蛋白，它含有cs和HBsAg順序，并具有所希望的分子量。
此外，對pRIT12573和pRIT12574來說在抗-HBsAg反應中帶的強度大體一樣;但在抗-cs反應中，pRIT12574的強度要比pRIT12573的強度高的多。這說明在pRIT12574和pRIT12573中，HBsAg序列是等量的，而前者中cs蛋白的重復抗原決定簇序列要比后者多。
實例12代表CSP抗原決定簇的雜種顆粒的合成含有pRIT10172(實例2)，或pRIT12329(實例9)，pRIT12573(實例10)或pRIT12574(實例10)的啤酒酵母菌株DC5或10S44C，在選擇培養(yǎng)基(200ml YNB或80μg/ml組氨酸)中培養(yǎng)至對數期末期。離心法收集細胞，并懸浮于含0.5%吐溫20，1mM PMSF(苯基甲基磺?；?，2.5%異丙醇的50mM磷酸鈉緩沖液10ml中。用弗氏細胞壓(French Press)破碎細胞兩次，壓力為20000psi(1.38×108Pa)，將細胞懸液離心30000xg，30分鐘。用Lowery等的方法(J.Biol.Chem.，193，265-275，1951)，以牛血清蛋白作標準，測定上清液(粗細胞提取物)中的蛋白總濃度。用放射免疫測定盒(AUSRIAⅡ)(該產品可以從Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois買到)或ELISA盒(Enzygnost-HBsAg micro)(該產品可以從Behringwerke，Marburg，W.Germany買到)測定HBsAg的存在。在用ELISA盒測定時，可以測定HBsAg顆粒中的cs順序的免疫反應能力。用含有0.2%BSA的PBS稀釋樣品至適合的濃度，使其結合到(室溫過夜)固相抗-HBsAg(Enzygnost Kit)上。將固定的HBsAg顆粒在37℃下與抗-cs蛋白的五種單克隆抗體混合物(作為第一抗體)的1/10000稀釋液(用含0.1%BSA的PBS稀釋)溫育一小時，(Dame etal.，Science，225，593-599，1984)。然后同作為第二抗體的生物素化的羊抗鼠Ig(Amersham)的1/500稀釋液(用含0.1%BSA的PBS稀釋)在37℃溫育一小時。用稀釋1/1000倍(含0.1%BSA的PBS)的鏈親合素-生物素化辣根過氧化酶復合物(Amersham)和色原(來自EnzygnostKit)在37℃溫育30分鐘檢查結果。在溫育期間用酶診斷盒(EnzygnostKit)的洗脫液洗盤(trays)四次。用TitertekMultiskan(Dynarech)計，在波長510nM下測定顏色的變化。
粗細胞提取物中蛋白的濃度和AUSRIA活性(表二)的測定表明pRIT12573和pRIT12329對HBsAg的表達水平是相同的。然而pRIT12574的AUSRIA活性大約低10倍。這些提取物的免疫吸印分析表明在上述三種情況下與蛋白質合成有關的HBsAg的量是相同的。
表二粗細胞提取物的AUSRIA活性HBsAgHBsAg蛋白(RIA)ng/mg質?；?mg/ml)(ng/ml)蛋白pRIT10172-5.600pRIT12329S3.357001730pRIT12573cs(24bp)PreS2-S3.640001110pRIT12574cs(192bp)PreS2-S2.8450160ELISA分析表明，在pRIT12573和pRIT12574的提取物中(表Ⅲ)具有能夠表達HBsAg和cs抗原決定簇的結構;并且在pRIT12574提取物和pRIT12573提取物的反應中，前者比后者含有更多的cs和HBsAg抗原決定簇。
表Ⅲ固著于固定化抗-HBsAg抗體上的抗原中的HBsAg和cs抗原決定簇粗細胞提取物ELISA(HBsAg)ELISA(cs)來源稀釋OD510nMOD510nM10S44C(pRIT10172)100X0.0000.06510S44C(pRIT12329)100X0.5800.054200X0.3410.041400X0.1880.05610S44C(pRIT12573)100X1.2981.596200X1.0801.299400X0.7020.898800X0.3360.5601600X0.1550.3233200X0.0750.18910S44C(pRIT12574)100X0.6621.678200X0.3701.506400X0.1831.130800X0.0790.7981600X0.0440.4493200X0.0610.205為了測定RIA和ELISA正結構的性質，取1.0ml粗細胞提取物在pH7.4的50mM磷酸緩沖液中與1.5MCsCl混合，用BackmanSW50.1轉頭離心，40000xg，40小時。用上述的RIA和ELISA方法，測定離心收集物中的HBsAg和cs抗體結合活性。結果表明在pRIT12573和pRIT12574的梯度中，HBsAg和cs抗原的活性是相平衡的。它們的梯度密度(rho＝1.20g/cm3)比pRIT12329(rho＝1.18g/cm3)的略高一點。
梯度分布的免疫吸印分析肯定了RIA/ELISA結果。HBsAg和/或cs序列只存在于RIA/ELISA分析中起反應的那些部分里。
這些結果指出，通過pRIT12573和pRIT12574表達而生成的雜種蛋白聚集在顆粒之中，就像上述酵母中合成的22nMHBsAg顆粒。而通過pRIT12573和pRIT12574表達而產生的顆粒確將cs序列暴露在它們的表面，所以它們能同抗-cs抗體起反應。在RIA實驗中，在使用pRIT12574的情況下，這些cs序列部分地阻斷了HBsAg的a因子(AUSRIA活性的主要起作用部分)的通路。
實例13A.雜種顆粒的提純化按實例10的方法，從含有pRIT12574的酵母菌株10S44C制備粗細胞提取物，并用聚乙二醇(PEG)400沉淀，使其澄清，再用具有阻隔100000道爾頓裝置的AMICONDC超過濾。
根據文獻的報道，可以用于進一步純化雜種顆粒的方法有，CsCl離心，羥基磷灰石色層析，和凝膠過濾等。
經用HPLCTSK-3000柱(LKB)分析，從含有pRIT12574酵母細胞提取物制備的純物質有一個主要峰，它具有HBsAg和cs兩種抗原活性。用銀染色法(Wrayetal.，Anal.Biochem.，118，197-203，1981)做SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(Laemmli，Nature，227，680，1971)，顯示出一個主要帶，估計分子量(MW)為37000kD。用醋酸雙氧鈾負染色后進行電鏡觀察，其結果表明顆粒的大小和形狀與酵母衍生的HBsAg相當。
B.雜種顆粒的純化將洗凈的酵母細胞混合于等重的50mM磷酸鈉提取緩沖液(pH8.1)中，緩沖液中補加4mMTitriplexⅢ1%吐溫20，4MMPMSF和10%異丙醇，用細胞磨(DynoMill)破碎細胞制備提取物。
離心11000xg，90分鐘去掉細胞碎片。用1N醋酸將500ml離心的粗提取物調至pH7.2，并加10克膠狀硅(Aerosil 380，Degussa)于4℃振蕩過夜。然后將懸浮離心3500g，一小時，將離心沉淀物在15分鐘內用150ml的0.15M NaCl加2mM PMSF和5mM EDTA液洗三次。將最終的Aerosil沉淀物用含有2%吐溫的25ml 10mM焦磷酸緩沖液(pH4.5)洗脫三小時。向吸附物中滴加1M CaCl2，直使CaCl2終濃度為30mM，并將pH調至7.0。溶液于4℃過夜，再離心6500g，15分鐘。上清液于4℃對2×51 10mM Tris/HCl(pH7.1)緩沖液透析，最后用透析液稀釋4倍。
向稀釋的抗原溶液中加30mM CaCl2和1M NaCl，并調pH至7.1，然后過150ml的苯基-瓊脂糖FF柱，(該柱用相同的CaCl2/NaCl Tris緩沖液平衡過)，流速為30cm/小時。用平衡緩沖液洗柱，直至OD280nM吸收值降至零。最后再用含6M尿素的10mM Tris/HCl pH9.0緩沖液洗脫，其流速同上。
另一種方法是將透析后稀釋四倍的抗原溶液補加20%的(NH4)2SO4(pH7.0)，并且過150ml的苯基瓊脂糖FF柱，(柱子用含20%(NH)SO的10mM Tris/HCl(pH7.0)緩沖液平衡過)，流速30cm/小時。用平衡緩沖液洗柱后，再用10mM Tris/HCl)pH7.1緩沖液洗脫，其流速同上。
收集抗原陽性部分，并進行CsCl梯度離心，于4℃，245000xg，65小時。離心一次或二次。純的雜種cs-HBsAg顆粒的梯度密度為1.23gr/cm3。
實例14雜種顆粒的免疫原性按實例13的方法，從含有pRIT12574的啤酒酵母10S44C菌株制備純的雜種顆粒，將雜種顆粒直接接種實驗動物或者加佐劑氫氧化鋁再接種實驗動物(Youngetal.，Science228，958-962，1985)。
對C57B1/6鼠(6-8周)，豚鼠和兔子于0，21，和49天進行皮下和腹膜內免疫，并于7，28，56，84天取血。將血放于4℃過夜，凝固，分離出血清并放于-70℃直至使用。
將兔子分成兩組，每組2個，每次免疫時使其接受10μg雜種cs-HBsAg蛋白，其量為1ml，其中有一組加佐劑氫氣化鋁，另一組不加。用兩個兔子做對照組，用10μgHeptavaxB(MerckSharpe&Dohme)免疫，接種方式同上。鼠和豚鼠，5個動物一組，每次免疫時分別接受1μg和5μg雜種蛋白，其量為0.5ml。用沒有免疫的動物作對照。
為了測定抗體效應，每組鼠的血清放在一起測定，而豚鼠和兔子的血清單個進行分析。用以重組cs蛋白R32tet32作抗原的ELISA分析方法測定抗cs-抗體的效價(See，Youngetal.，Scinece，228958-962，1985)。用AUSAB盒(AbbottLaboratories)和WHO的參考標準測定抗-HBsAg的效價。
豚鼠和鼠對HBsAg都不產生可估量的抗體效價，不管怎樣反復強化免疫。相反，這兩種動物產生抗-cs抗體，其效價隨強化劑量的增加而增大。在ELISA分析中，用稀釋1600倍的鼠血清和釋稀9000倍的豚鼠血清得到的吸收值為1.0。吸附氫氧化鋁沒有使雜種顆粒的免疫原性加強。
相反，兔子對cs和HBsAg都產生抗體。在抗-cs的ELISA分析中，當吸收值為1.0時，交互效價在800-3200之間。吸附氫氧化鋁的雜種顆粒的抗HBsAg效價在4000-20000muI/ml之間，而用Heptavax免疫的兔子給出的效價是105-106MUI/ml。吸附氫氧化鋁的雜種顆粒提高了免疫效應。
在環(huán)狀體沉淀素反應以及在體外抑制肝胞瘤的子孢子侵染中，鼠、豚鼠和兔子的血清都有強烈的反應(Youngetal.，Science，228，958-962，1985)，(見表Ⅳ)。這兩種反應是指示一種保護性免疫效應。
表Ⅳ環(huán)狀體沉淀素(CSP)反應力和HePG2-A16肝細胞瘤子孢子侵染抑制百分數(%ISI)動物CSP一周后第三次強化(4+2+0)%ISI收集鼠血清149291%兔＃36223096%豚鼠＃11072410100%括號中的數字表示CSP反應力的程度，0-表示CSP反應力為零2+-在子孢子的表面有顆粒沉淀。
4+-從子孢子末端形成線狀物。
實例15疫苗制備下面以這項發(fā)明的一種疫苗為例，說明疫苗的制備方法將溶于緩沖液中的本發(fā)明顆粒邊攪拌邊加到用同樣緩沖液配制的3%氫氧化鋁水溶液中(10mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH6.8;過濾滅菌)，使多肽的終濃度為100μg/ml，鋁離子(Al3+)終濃度為0.5mg/ml。pH保持在6.8?；旌衔镉?℃左右放置過夜。然后加入乙基汞硫代水楊酸鈉至終濃度0.005%。檢測pH值，調至pH6.8。
雖然前面對這項發(fā)明和其申請的所有具體內容進行了充分地說明，但應該懂得此發(fā)明不僅僅限于那些詳述的具體內容，相反，它還包括全部在下列權利要求范圍內對其所進行的改進和修飾。
用酵母生產PreS2-S蛋白和PreS1-PreS2-S蛋白實例將本發(fā)明的PreS2-S蛋白編碼區(qū)插到一種酵母表達載體上，然后轉化到酵母細胞中，發(fā)現其能合成類似真正22nMHBsAg的蛋白顆粒，表面裸露著糖基化PreS2蛋白。以前還沒有人確切地報道過酵母在用HBV基因組的任何一部分轉化后能表達出糖基化產物。
下面的例子是關于除含乙型肝炎表面抗原S蛋白外還含PreS2區(qū)的蛋白，其糖基化形式在酵母中的表達。該蛋白可從酵母細胞中提取純化出，呈顆粒狀，用作人疫苗。酵母細胞表達的PreS1-PreS2-S蛋白也是糖基化的，并且也可以蛋白顆粒的形式從細胞中提取純化出來，用作抗乙型肝炎病毒疫苗。
關于糖基化，下列幾點應予說明1.例25，26和27分別涉及刀豆或蛋白A的結合，衣霉素對EndoH的作用和敏感性。每個例子都證明33Kd的PreS2-S類蛋白是糖基化的。因此，糖基化已用三種不同方法得到了證明。
2.這些試劑大體上有如下特點a)刀豆球蛋白A優(yōu)先與甘露糖殘基結合。
b)衣霉素抑制所有與天冬酰胺形成N-糖苷鍵的糖基化反應。
c)糖苷內切酶H切掉與天冬酰胺相連的含大量甘露糖的寡聚糖，留下一個與天冬酰胺相連的N-乙酰葡糖胺殘基。
3.綜合例25，26，27和上述結果，可以推斷，在PreS2-S蛋白(受衣霉素抑制，對EndoH敏感)的33Kd類蛋白上存在一個以N-端相連的寡聚糖鏈，該糖鏈主要由甘露糖(對EndoH敏感)組成。用衣霉素處理和EndoH消化，觀察到分子量改變(約3000)，表明寡聚糖結構由大約10個糖殘基組成。其大小與酵母核心糖基化物差不多。因此PreS2-S蛋白的三個可糖基化位點，可能只有一個被糖基化。
4.例28和29所述純化方法中都有一個利用糖蛋白上的糖殘基進行親和層析的步驟。
5.苯基硼酸鹽對1，2-順式二元醇基團(空間位置同方向的二個相鄰OH基團)有特異性。
6.晶體瓊脂糖對葡萄糖/甘露糖有特異性。
實例16pRIT12662的構建-一種帶有PreS2-S表達系統(tǒng)的大腸桿菌載體(圖16)。
對前述實例3法所得pRIT12290質粒，用插入一個BamHⅠ-EcoRⅠ合成連接物片段的方法，進行修飾，該連接物編碼TDH3啟動子和ARG3終止區(qū)兩個片段間的PreS2區(qū)N-末端氨基酸。修飾方法如下質粒pRIT12290用BamHⅠ和EcoRⅠ酶消化，然后用堿性磷酸酶脫磷酸。200Pmoles(微微摩爾)脫磷酸連接物GlnTrpBamHⅠ5′GATCCAGTGG3′EcoRⅠ3′GTCACCTTAA5′用1單位T4連接酶與0.1Pmoles的BamHⅠ-EcoRⅠ脫磷酸質粒pRIT12290相連接，然后用于轉化大腸桿菌MM294菌株，使其對氨芐青霉素產生抗性。鑒別出含期望質粒的轉化子，將其保留，該質粒帶有插在BamHⅠ和EcoRⅠ位點間的合成連接物。此質粒定為pRIT12621。以pRIT12621為起始物，下面幾步為，為了將ATG密碼放在與Pre S2區(qū)第二個密碼同相位置，先除去4個多余的堿基對(BamHⅠ位點中心)，然后將帶有Pre S2編碼區(qū)其余部分和完整S編碼區(qū)的EcoRⅠ片段插到pRIT12621的EcoRⅠ位點上，完成整個Pre S2-S編碼區(qū)的構建。
此階段的DNA操作，包括后面要進行的質粒pRIT12621的線性化，缺失和再環(huán)化，都不需要通過用中間質粒轉化進行擴增就可完成。步驟如下30微微摩爾(120μg)的pRIT12621DNA用120單位BamHⅠ線性化。用酚抽提除去限制性內切酶，用乙醇沉淀出質粒，再溶于適宜的緩沖液中，用280單位的綠豆核酸酶消化BamHⅠ單鏈端。核酸酶用酚抽提除去，再用乙醇沉淀出質粒。將這樣處理過的質粒再溶于連接緩沖液中，用10單位T4連接酶再環(huán)化。將含環(huán)化質粒的制品進行酚處理，乙醇沉淀，再溶于適宜的緩沖液中，用EcoRⅠ酶消化。經酚除去EcoRⅠ內切酶和乙醇沉淀后，將0.05pmoles(0.2μg)的DNA再溶于連接緩沖液中，與0.4Pmoles(0.2μg)含838個堿基對的EcoRⅠ片段連接，該片段從pRIT12581分離得到，帶有Pre S2-S蛋白的整個C-末端編碼區(qū)。一種和pRIT12581基本相似的質?？砂慈缦路椒嫿ā］d體pUC9(Amersham和Pharmacia有售)用EcoRⅠ內切酶消化后，用堿性磷酸酶(Shine，U.S.Patent 4，264，731)消化。質粒pRIT10616(ATCC39131)用EcoRⅠ和AccⅠ限制性內切酶消化。帶有Pre S2-S部分編碼區(qū)、有826bp的EcoRⅠ-AccⅠ片段通過丙烯酰胺凝膠制備電泳和電洗脫法回收。用約0.4Pmoles(0.2μg)所得片段與10 Pmoles按前述實例8方法退火粘接得到的下列12bp合成連接物混合，混合物用T4連接酶處理后，再用限制性內切酶EcoRⅠ消化。
IleTyrStop5′ATACATTTAACG3′AccⅠEcoRⅠ3′TGTAAATTGCTTAA5′在此處理過的混合物中加入0.2μg經EcoRⅠ消化和堿性磷酸酶處理過的pUC9載體，載體制備方法如前所述。將混合物用T4DNA連接酶處理后，用常規(guī)方法轉化大腸桿菌K12感受態(tài)細胞，使其對氨芐青霉素具抗性。檢測轉化子形成的菌落是否存在這種質粒，該質粒由2650bp的pUC9載體和838bp的EcoRⅠ片段組成，該片段則由826bp的EcoRⅠ-AccⅠPreS2-S片段和12bp的AccⅠ-EcoRⅠ合成接頭組成。這樣檢測出的質粒，其結構是否正確，可用Maxam和Gilbert的化學修飾法(MethodsinEnzymology，65.499，1980)測基因序列驗證。序列分析最好從pUC9多聚接頭單一旁側限制內切點開始。
用含前面處理所得pRTI2621質粒DNA和pRIT12581質粒的838bp的EcoRⅠ片段的混合物，按前引Cohen等人方法轉化大腸桿菌MM294菌株。找出EcoRⅠ片段取向正確的質粒轉化體，該質粒定為pRIT12662(見圖1A和圖16)。圖1A是制備pRIT12662的操作過程圖解。圖16是pRIT12662的限制性內切酶圖譜。用Maxam和Gilbert的化學修飾法(MethodsinEnzymology，65，499，1980)對pRIT12662的PreS2區(qū)進行序列分析，以核實編碼區(qū)在N-末端讀碼是否如下MetGlnTrpAsnSerAAACAAACAAAATGCAGTGGAATTCCpTDH3preS2-ScodingregionDNA操作熟練者會懂得，通過適當的體外載體DNA操作，pRIT12662載體也可用來在PreS2區(qū)引入下一步DNA的功能序列。PreS2編碼序列具有內切酶EcoRⅠ，PstⅠ和BamHⅠ的限制性內切點。這些位點中的任何一個都可用于引入編碼所需肽鏈的DNA功能序列，與PreS2區(qū)發(fā)生同相位融合。這一融合將是這種類型PreS2-引入序列-PreS2-S。這些限制性切點也可經體外操作創(chuàng)造出其它載體，為DNA功能序列的插入提供其它位點或讀碼。比如用Botstein等人方法(Science，229，1193-1201，1985)就可做到這一點。
實例17pRIT12377和一種表達PreS2-S蛋白的酵母質粒pRIT12660的構建按例10(B)所述方法獲得質粒pRIT12309，用SalⅠ內切酶消化，與帶有酵母LEU2基因、2218bp大小的XhoⅠ-SalⅠ片段連接，該片段通過消化YEp13，再用丙烯胺凝膠電泳純化獲得。按前述Cohen等人的方法，用經連接的混合物轉化大腸桿菌K12菌株JA221細胞，并使其帶有氨芐青霉素抗性和亮氨酸自養(yǎng)雙重標記。菌杜JA221從M.Rosenberg，SmithKline和French實驗室(Philadelphia，Pennsylvania，U.S.A.)得到，可向美國典型菌種保藏所，登記號33875。從一個轉化體菌落細胞中檢測出一種質粒pRIT12377，其含插在pRIT12309質粒的SalⅠ位點上的一個2218bp大小的LEU2XhoⅠ-SalⅠ片段。
片段在載體上的取向，使得在載體上pBR327部分的AvaⅠ側又產生了一個SalⅠ位點。pRIT12377是一種大腸桿菌-酵母菌的穿梭載體，它在這二種生物中都具有必要的選擇、復制和保持功能。從pRIT12662(實例16)得到的含3050個堿基對的HindⅢ片斷、含Pre S2-S表達體系，用丙烯酰胺凝膠電泳純化后，經T4聚合酶處理，再連接到已用BamHⅠ酶切開的pRIT12377質粒上，然后用T4聚合酶修復。這一制品用來轉化大腸桿菌MM294菌株，使其對氨芐青霉素產生抗性，方法按前述Cohen等人的方法。這樣得到一種帶有pRIT12660質粒的大腸桿菌轉化體。圖17是制備pRIT12660的操作過程圖解。
pRIT12660質粒用于轉化兩種釀酒酵母菌株，即DC4cir菌株和10S44Ccir°菌株，轉化方法按Hinnen等人方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.79，2157-2161，1987)。
遵照1986年8月18日布達佩斯條約，這二個菌株DC5cir°和10S44Ccir都保存在美國典型菌種保藏所，菌株登記號分別為ATCC20820和ATCC20818。
實例18pRIT12662質粒的PreS2區(qū)用Maxam和Gilbert化學修飾法(Proc.Natl.Acad.Sci.，74，560-564，1977)對pRIT12662質粒的PreS2區(qū)進行序列分析。當與另一種adw2血清型(Valenzuetaetal.，1980-表Ⅰ第11頁)病毒比較時發(fā)現有4個堿基對發(fā)生了改變，導致三種氨基酸的變化。在位置45，丙氨酸殘基取代了蘇氨酸殘基;在位置34，苯丙氨酸殘基取代了亮氨酸殘基;在位置11，絲氨酸取代了異亮氨酸殘基。這最后一個殘基的變化影響了迄今為止在所有血清型中都不會變化的一個殘基(Loetal.，Biochem.Biophys，Res.Com.，2，382-388，1986)。
實例19攜帶聚合人血清清蛋白(PHSA)受體的顆粒的合成帶有pRIT12660或pRIT12363的酵母菌株DC5 cir°或10S44C cir°培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基〔200ml YNB+80μg/ml組氨酸(DC5 cir°)或YNB(10S44C cir°)〕中培養(yǎng)至對數期(pRIT12363除無肝炎衍生基因外，與pRIT12660完全相同;pRIT12363只帶有S基因)。細胞經離心收集后再懸浮于pH8.0、50mM磷酸鈉溶液中，其中含0.5%吐溫-20(聚乙烯月桂山梨聚糖單酯)，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟化物)和2.5%異丙醇。用弗氏細胞壓在20000psi(1.38×108Pa)壓力下，壓榨細胞兩次，使其破碎。懸液于30000xg離心30分鐘。上清液(細胞粗抽提物)中總蛋白濃度用Lowry等人方法(J.Biol.Chem.193，265-275，1951)測定，以牛血清清蛋白為測定標準。用放射免疫測定儀(AUSRIAⅡ)測定HBsAg相關物質的存在，這種裝置可從Abbott實驗室買到。結果(表Ⅴ)表明pRIT12660指導合成與HBsAg顆粒在抗原上相關的物質。在酵母菌株DC5 cir°和10S44C cir°中，該物質的表達水平，按AUSRIA活力計算，大體相同。
在測定聚人血清清蛋白(pHSA)(Pontissoetal.，J.VirolMethods，6，151-159，1983)受體的放射免疫測定中，帶有pRIT12660的細胞的抽提物反應陽性，而帶有pRIT12363的細胞，其抽提物反應為陰性。在上述條件下測定聚牛血清清蛋白，無反應。
將帶有pRIT12660質粒的細胞抽提物進行CsCl平衡離心，表明AUSRIA陽性物質的離心帶在rho＝1.20g/cm3左右，和血清或酵母HBsAg衍生顆粒相同。在此梯度部分回收的物質，pHSA試驗陽性。
前面提到的結果表明，帶有pRIT12660的酵母細胞合成了一種HBsAg相關蛋白，它們聚集成類似血清中22nm顆粒的結構，表面暴露出一個pHSA受體。
表ⅤA細胞粗抽提物中AUSRIA活力蛋白HBsAg相關抗HBsAg相關抗菌株質粒mg/ml原性ng/ml原性ng/ml蛋白DC5cir°pRIT1266013.47522DC5cir°pRIT1266012.6755510S44Ccir°pRIT1266010.8655610S44Ccir°pRIT126609.56631實例20在用pRIT12660轉化的酵母細胞中發(fā)現有4種S-相關蛋白得到了表達為了分析帶pRIT12660質粒細胞表達的HBsAg相關蛋白的單聚體，在三角瓶或發(fā)酵罐中用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞至對數期，離心收集細胞。
在壓緊的細胞(0.1克)中先加入20μl40mMPMSF異丙醇溶液，然后加入200μl聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品緩沖液(0.125MTris-HCl，pH6.8，含20%甘油，4%SDS，6M尿素和10%的2-巰基乙醇)。將樣品振蕩混勻，分成2-20μl等分試樣，用樣品緩沖液進一步稀釋至終體積40μl，于100℃溫育5分鐘，然后按Laemmli方法(Nature，227，680，1971)通過12.5%分離膠，5%濃縮膠進行凝膠電泳。
用電吸印法(Towbin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.76，350-4354，1979)將蛋白吸印到硝化纖維濾膜(0.45μm，BioRad)上后，將濾膜放入含3%明膠的PBS液中，于37℃預溫育1小時。然后將該濾膜和單克隆抗體一起溫育，該抗體(monoclonal 6 obtained form H.Thomas，Royal Free Hospital，London，England)直接針對人衍生抗原HBsAg的變性和減弱抗性的抗原決定簇。將濾膜與下列物質逐個溫育，以測定抗體的結合生物素化的羊抗鼠Ig(RPN1021，Amersham，用含1%明膠的PBS稀釋250倍)，鏈親合素-生物素化的辣根過氧化物復合物(RPN1051，Amersham，用含1%明膠的PBS稀釋400倍)，最后是50ml PBS溶液，用30ml H2O2和含4-氯-1-萘酚(BioRad)的HRP顯色劑30mg甲醇溶液10ml配成。每次溫育后，濾膜都要用含0.1%吐溫20的PBS液洗，然后再進行下一步溫育。
免疫吸印顯示的4條與S蛋白(p23)相關的蛋白帶，用單克隆抗體法測定出這四種蛋白的分子量約為33Kd，30Kd，28Kd和25Kd。S-相關物質多數是在33Kd蛋白帶中，其遷移速度比Stibbe和Gerlich(Virology，123，436-442，1982)所描述的gp33蛋白要稍快些。最小的蛋白帶遷移速度比酵母合成的S蛋白(p23)要快。
實例21四種S-相關蛋白(33Kd，30Kd，28Kd和25Kd)聚集成顆粒帶有pRIT12660(實例16)質粒的酵母細胞粗提取物制備方法同實例19或加入等重量抽提緩沖液(200mMTris，3MNaCl，10mMEDTA，10mM乙二醇雙-β-氨基乙醚-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)，4mMPMSF，10%異丙醇)，用Dynomill細胞磨將酵母細胞磨碎的方法得到細胞粗提取物，于30000xg離心45分鐘。
用大家熟悉的起濾法，CsCl平衡離心法和羥磷灰石層析法從細胞粗提取物中部分純化出pRIT12660指導合成的蛋白顆粒。用Western吸印分析法測出的4條S-相關蛋白帶隨這些純化步驟的進行而得到純化。對平衡離心后AUSRIA陽性CsCl部分進行的免疫吸印分析(如實例20所述)表明，4種S-相關蛋白帶在每部分都以同樣的比例出現。
因此，這類物質以均勻的形式分布在整個梯度峰部分。
實例2233Kd和30Kd蛋白攜帶著聚人血清清蛋白受體人血清清蛋白(Sigma，A8763)用戊二醛(Merck，A-12179)處理后聚合，按Pontisso等人的方法(J.Virol.Methods，6，151-159，，973)純化。用Western吸印法測定這4種S-相關蛋白對PHSA的反應性。pRIT12660指導合成的顆粒(實例21)經部分純化后，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后按實例20方法轉移到硝化纖維濾膜上。將濾膜與下列物質逐個進行溫育，PHSA(15μg/ml，用1%明膠的PBS液配成)，兔抗人清蛋白抗血清(Behringuerker，ORCB 04/05，用含1%明膠的PBS液稀釋250倍)，生物毒化的驢抗兔Ig(Amersham RPN 1004，用含1%明膠的PBS液稀釋250倍)，鏈親合素-生物素化的竦根過氧化物酶(Amersham RPN 1051，用含1%明膠的PBS液稀釋400倍)，最后是實例20所述H2O2和4-氯-1-萘酚。
兩條最大的S-相關蛋白帶(33Kd和30Kd)和PHSA反應，兩條最小的蛋白帶(28Kd和25Kd)不和PHSA反應。
實例2333Kd和30Kd蛋白帶有對PreS2-S蛋白的PreS2區(qū)有特異性的序列合成一段有26個氨基酸殘基的肽鏈，其23個殘基與Pre S2-S蛋白N-末端26個氨基酸殘基的23個相對應(NH2-Met-Glu-Trp-Asn-Ser-THr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Alu-Gly-Cys-COOH)，用C-末端與
血藍蛋白(Peninsula Laboratories)的關鍵點偶聯起來。在兔子皮下免疫注射100μg Freund氏完全佐劑結合物(相當于20μg肽)，8天和15天后再用100μg Freund氏完全佐劑結合物強化，在28天，69天，149天用100μg PBS結合物強化。抗體效價提高后，每隔一定時間取血樣，將血清和固定在固相的合成肽鏈一起溫育，從而測定血清稀度。用碘化蛋白A(New England Nuclear)檢測與固相肽鏈結合的抗體。選擇抗肽效價高于或等于1/5120的血清用于免疫吸印試驗。試驗所用血清要稀釋100倍，或部分純化出IgG后。用Na2SO4(每毫升血清加120mg)沉淀法部分純化出IgG，溶于PBS中，再用14%Na2SO4沉淀。將IgG溶液過PD10柱(Pharmacia)脫鹽。
用生物素化的驢抗兔Ig，鏈親合素-生物素化的竦根過氧化物酶和H2O2加4-氯-1-萘酚測定免疫吸印濾膜上的這些抗體對S-相關蛋白的反應性。方法同實例22。
pRIT12660指導合成的蛋白顆粒(實例21)經部分純化后用SDS聚丙烯凝膠電泳分離，再按實例20方法將蛋白轉移到硝化纖維濾膜上。從帶有pRIT12363質粒的酵母中純化出的顆粒中分離出的S-蛋白(p23)也進行凝膠電泳。免疫吸印表明，二個最大的S-相廣蛋白帶(33Kd和30Kd)與抗肽抗體反應，而二個最小的(28Kd和25Kd)卻不反應。S-蛋白(p23)不與抗肽抗體反應。
實例24自然感染患者的人抗乙型肝炎抗體識別33Kd和30KdPreS2-S蛋白上的抗原決定簇，這個決定簇不存在于S蛋白上。
按實例20描述的免疫吸印方法，檢測了從乙型肝炎抗體陽性患者(Belgian Red Cross，100-150 IU/ml，Lot 85A08)收集的γ球蛋白對四個S相關蛋白的反應性。pRIT12660編碼的顆粒部分純化制備物(實例21)用SDS溶解，蛋白質經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜片上。轉移后，膜片與抗乙型肝炎γ球蛋白(含1%明膠的PBS稀釋10倍)溫育。按實例20描述的方法，依次與生物素化的綿羊抗人免疫球蛋白Ig(Amersham RPN 1003，用含1%明膠的PBS稀釋至1/250)、鏈親和素-生物素化的竦根過氧化物酶溫育，最后與H2O2和4-氯-1-萘酶溫育，檢測了抗體的結合。
兩個最大的S相關蛋白帶(33Kd和30Kd帶)與人的抗體反應，兩個最小的S相關蛋白帶(28Kd和25Kd帶)沒有反應。pRIT12363轉化的酵母細胞內顆粒上的S蛋白(p23)與這些人的抗體沒有反應。這些結果表明從感染著獲得的γ球蛋白專一性地識別在變性和還原的PreS2-S蛋白上的抗原決定簇，這個決定簇在變性和還原的S蛋白上并不存在。已經知道人血清和酵母來源的S蛋白上的抗原決定簇主要是構象性的。
實例10A33Kd蛋白種類中帶有含甘露糖的寡糖結構按實例20描述的方法，pRIT12660轉化的10S44Ccir°細胞部分純化顆粒制備物的PreS2-S蛋白經電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜片上。由pRIT12363轉化酵母菌純化的顆粒S蛋白和來自感染者血清的HBsAg顆粒S蛋白也進行電泳。感染者血清由聯邦德國、哥延根大學醫(yī)學微生物W.H.Gerlich博士提供。
按實例20描述的方法，硝酸纖維素膜片的一半與50μg/ml刀豆蛋白A(Calbiochem，A級)在10mM Tris(pH7.5含150mM NaCl，1mM CaCl，1mM MnCl20.05%吐溫20)中溫育，再與30μg/ml辣根過氧化物酶在10mM Tris(pH7.5，含150mM NaCl，0.05%吐溫20)中溫育，最后與H2O2及4-氯-1-萘酚溫育。
每次溫育之間，膜片用pH7.5，含150mMNaCl，0.05%吐溫20的10mMTris漂洗(Hawkes，AnalBiochem，123，143-146，1982;Clegg，AnalBiochem，127，389-394，1982)。硝酸纖維素膜片的另一半與單克隆抗體6溫育，按實例20描述的方法處理。
33Kd蛋白帶與刀豆球蛋白A-過氧化物酶試劑反應，而30Kd，28Kd及25Kd蛋白帶都沒有反應。來源于pRIT12363轉化細胞的S蛋白也沒有反應。當有0.1Mα-甲基甘露糖苷存在時，刀豆球蛋白與33Kd蛋白的結合消失。
實例26一個寡糖結構是N-型糖苷聯接在天冬酰胺上pRIT12660和pRIT12377(實例17)轉化的細胞生長在選擇性培養(yǎng)基上(對于DC5 cir°用YNB+80μg/ml組氨酸，對于10S44C cir°用YNB)。長到OD620nm＝0.2時，加衣霉素(Calbiochem)至終濃度為10μg/ml，培養(yǎng)物在30℃溫育30分鐘，然后按每毫升20μCi加入35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmol)(New England Nuclear)再溫育15分鐘。衣霉素處理和未處理的細胞培養(yǎng)物(標記過的)各2ml，小離心機上離心，收集細胞再懸浮于40μl 1%SDS中，加入0.3g玻璃珠(直徑0.45-0.50mm)，用Vortex混合器振蕩2分鐘，分散細胞。
免疫沉淀基本按Julius等人(Cell，36，309-318，1984)方法進行。胞溶產物在100℃加熱3分鐘，用0.5毫升含1%TritonX100，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS的PBS稀釋，在100℃下再加熱1分鐘。
煮沸過的抽提物中加入25μl10%預洗過的免疫沉淀素(Formalin固定的葡萄球菌A細胞，BethesdaResearchLaboratories)的上清液，在0℃下溫育30分鐘?；旌衔镌谛‰x心機上離心5分鐘，上清液加入2.5微升對S蛋白專一的單克隆抗體6(參見實例20)，這個混合物在0℃下溫育1小時。另加入25微升免疫沉淀素，在0℃下溫育30分鐘。免疫復合物經離心收集(小離心機上離心5分鐘)，再依次用含2摩爾/升脲的PBS，1%巰基乙醇的PBS，最后用PBS洗。這樣洗過的復合物重新懸浮在實例20描述的電泳樣品緩沖液中。
帶有105cpm的樣品進行濃度為12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(參見實例20)，電泳后凝膠用含10%乙酸的40%甲醇固定，用熒光檢測放大劑(Amplify，Amersham)處理，真空下干燥在濾紙上，在-70℃下用柯達X-Omat S膠片曝光。
這里表明pRIT12660轉化的細胞，不存在衣霉素時，含成33Kd蛋白;存在衣霉素時，合成30Kd蛋白。而在pRIT12377轉化細胞的相應樣品中、兩種蛋白帶都不存在。
這些結果表明在酵母細胞株PC5cir中，表達了33Kd的PreS2-S蛋白，這個蛋白帶有一個與天冬酰胺N-型糖苷聯接的寡糖部分。很可能只有一個寡糖鏈與33Kd形式的PreS2-S蛋白連接，它比核心糖化物稍大一些。
實例27這個寡糖結構是富含甘露糖類型的。
pRIT12660轉化細胞的粗提液，或者從這些粗提液得到的部分純化的PreS2-S顆粒制備物(實例21)，用內切-N-乙酰葡萄糖胺酶(EndoH;EC.3.2.1.96)處理，這個酶來自褶皺鏈霉菌(Streptomycesplicatus)，從NewEnglandNuclear獲得。
在0.1%SDS溶液中，部分純化的顆粒(50μl450μg蛋白/ml)在100℃煮沸3分鐘，用pH5，100mM檸檬酸鈉稀釋10倍。240μl混合物中加入2.4μlEndoH(74μg/ml)。加入或末加過EndoH的樣品均在37℃溫育4小時。EndoH處理和未處理的樣品，均按實例20描述的方法，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析和免疫吸印分析，后者用對S蛋白專一的單克隆抗體檢測，結果表明有EndoH處理時，33Kd的蛋白帶消失，而出現31Kd的蛋白帶，這個31Kd的蛋白帶仍能與前面描述過的刀豆球蛋白一過氧化物酶試劑反應，其它帶(30Kd，28Kd和25Kd)的位置在EndoH處理下并不改變位置。延長溫育時間和增加EndoH濃度的結果相同。這表明連接在33Kd蛋白上的寡糖結構是富含甘露糖類型的，它的大小和核心糖化物相當。
實例28包含PreS2-S蛋白顆粒的純化洗過的酵母，經研磨得到包含PreS2-S蛋白的酵母粗提物。研磨是在細胞磨中，用與抽提液等重量的緩沖液來進行的。緩沖液為pH8.1，50mM磷酸鈉(含有4mMEDTA，1.0%吐溫20，4mMPMSF和10%異丙醇)，或為pH9.0，200mMTris-HCl緩沖液(含有3.0MNaCl，10mMEDTA，10mMEGTA即乙二醇雙乙胺-N，N′-四乙酸，1%吐溫20，4mMPMSF和10%異丙醇。
將均勻物質的pH相應地調至8.0或9.0，再在30000xg下離心45分鐘。
500ml酵母粗提液的pH調至pH7.2，加入10g膠狀硅(Aerosil380Degussa)，膠狀上清在4℃下攪拌過夜，再低速離心。Aerosil小球，用150ml0.15MNaCl分三次洗。在37℃下，再用250ml含2%吐溫20的10mM焦磷酸緩沖液在3小時內一次洗脫，得到微黃色，稍發(fā)乳光的解吸溶液。這個溶液加到50ml的苯基硼酸化的瓊脂糖層析柱(Amicon)上，(用pH9.0，10mM焦磷酸緩沖液平衡)、上樣流速為15ml/小時。
進一步用2倍柱體積的平衡緩沖液洗滌層析柱，再反方向用pH7.2，含100mM山梨醇糖的50mMTris洗脫，流速為15ml/小時。收集洗脫收峰組分，將pH調至8.1后加到-DEAE-Fractogel(TSK層析柱上(用pH8.1，50mMTris平衡過)，用含有75mMNaCl的相同緩沖液的顆粒洗脫下來。這個步驟以后，殘留的核酸被除去(每20μg蛋白質中少于1μg核酸)，結果如表Ⅵ所示。
表Ⅵ包含PreS2-S蛋白顆粒的兩步純化S相關蛋白(mg)蛋白質脂類多糖組分毫升(放射免疫測定法)(mg)(mg)(mg)粗提液50011.31460052867850Aerosil解吸物2705.96385554249PBA柱流出液3152.83＊365360267PBA柱洗脫液702.82.952.5＊沒有充分糖基化的蛋白質保留在層析柱上。
按這個實例28得到的pRIT12660轉化細胞抽提液，再經過氯化銫離心純化的物質，醋酸雙氧鈾染色后用于電鏡檢查。檢查結果表明存在直徑約19微米的分散顆粒，這些雜種顆粒中，每100μg蛋白質包含5-20μg吐溫20。
實例29扁豆素瓊脂糖的親和層析這個實例中，扁豆素瓊脂糖(Pharmacia)的親和層析取代了苯基硼酸瓊脂糖層析步驟。
按實例28方法得到的50mlAerosil解吸物，加到5ml扁豆素瓊脂糖層析柱上，層析柱用平衡緩沖液如含0.14MNaCl，0.3%吐溫20的10mMTris緩沖液(pH7.2)平衡過，層析柱再用2倍柱床體積的平衡緩沖液如Tris緩沖液(pH7.2)洗滌，在平衡緩沖液中加入對扁豆素專一的糖添加物如0.5Mα-甲基甘露糖苷，這種緩沖液洗脫結果如表Ⅶ所示。
表Ⅶ在純化包含PreS2-S蛋白顆粒過程中，扁豆素瓊脂糖親和層析的應用體積S相關蛋目(μg)組分(ml)(放射免疫測定)總蛋白質粗提物10021703gAerosil解吸物501700138mg扁豆素瓊脂糖柱的流出液50428-扁豆素瓊脂糖柱的洗脫液12.59251.26mg電鏡檢查表明這里得到的純化雜種顆粒中，每100μg蛋白質包含5-50μg吐溫20。
實例30PreS2-S顆粒的免疫原性在兩種鼠系Bal b/c(H2-d)和NMR1(H2-Q)中研究了pRIT12660(實例16)轉化細胞抽提液中制備的顆粒的免疫原性。這些顆粒在注射前用Al(OH)3吸附，腹腔注射老鼠(5只/組)，劑量為0.3μg放射免疫測定反應物質。免疫后一個月，鼠放血，同組鼠的血清收集在一起，收集的血清用AUSAB試劑盒(Abbott Labs)，參照世界衛(wèi)生組織方法，測定了抗S蛋白抗體的效價，再根據Hollinger公式(Hollinger et al.)in Szmuness et-al.，des.Viral Hepatitis，PhilledlphiaFranklin Institute Press，451-466，1982)轉化成mIu/ml單位?？筆re S2抗體用固相測定法(放射免疫測定)檢測，測定中，實例23提供的合成的Pre S2肽吸附在塑料上，結合的抗體用125Ⅰ標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G檢測。結果表明在表Ⅷ上，表明在兩種鼠系中，pRIT12660轉化細胞的顆粒誘導抗S蛋白和抗Pre S2肽的抗體，在NMR1中抗Pre S2肽抗體的效價比在Bal b/c中高。這種顆粒誘導的抗S蛋白的效價比更高劑量的pRIT12363轉化細胞顆粒誘導的抗S蛋白效價高出2-3倍，后者中沒有Pre S2序列。Pre S2決定簇增強了S決定簇的反應。當合成的Pre S2肽和缺乏Pre S2的顆粒一起注射時，這種增強作用并不出現。并且，僅有合成的Pre S2肽也不能誘發(fā)抗Pre S2抗體。
這種結果暗示獲得抗PreS2反應需要同一個顆粒上的PreS2決定簇與S決定簇的聯合，而且這種聯合導致抗S蛋白反應的加強。
涉及這里的與PreS2-S顆粒相關的免疫原性的研究結果總結在表Ⅷ上。
表ⅧPreS2-S顆粒的免疫原性抗S蛋白抗抗PreS2肽抗S相關抗體的效價(2)體的效價(3)原的劑量＊(1) mIU/ml mIU/ml注射的制備物(μg)(1)Balb/cNMRlBalb/cNMRl酵母來源的S顆粒1.7140471902(由pRIT12363編碼)酵母來源的S顆粒1.55748116304(由pRIT12363編碼)+0.08ug合成的PreS2肽0.08ug合成的PreS2肽-2104酵母來源的PreS2-S顆粒0.3334424188120(由pRIT12660編碼)(1)用AUSRIA試劑盒(AbbottLabs)測定。以倫敦國家生物學標準研究所schild博士提供的、國際上推薦的參考制備物為標準。
(2)用AUSAB試劑盒(AbbottLabs)測定。按世界衛(wèi)生組織的標準。
(3)用固相放射免疫測定法測定，合成的PreS2肽吸附在塑料上。
效價指能給出有意義的抗體結合的稀釋度，(為陰性對照血清值的2.5倍)。
酵母中完整的PreS1-PreS2-S蛋白編碼序列表達的實例實例31酵母中表達PreS1-PreS2-S蛋白的質粒pRIT12845的構建。
第一步，TDH3啟動子區(qū)域與PreS1N端編碼區(qū)融合，后者來自乙型肝炎病毒的基因組。出發(fā)質粒為pRIT12792，它攜帶的一個495bpNcoⅠ-XbaⅠ片段，包括了除最后一個天冬酰胺密碼外的全部PreS1-PreS2編碼序列。NcoⅠ位點與乙型肝炎病毒PreS1序列中163位氨基酸ATG密碼重疊，NcoⅠ-XbaⅠ片段的序列如圖4A所示。
與質粒pPRIT12792基本相似的質粒pRIT12793(5940bp)來自美國典型菌保藏中心，按1986年9月5日布達佩斯協(xié)議規(guī)則，登記號為ATCC67193。來自質粒pRIT12793的一個495bPNocⅠ-XbaⅠ片段，能使PreS1-PreS2編碼序列完全恢復。這個片段與圖4A所示的序列相差一個核苷酸，這個片段的3′末端序列為ACGAACTAATAATCTAGA，下面劃線標明的是差異的核苷酸。在下面的實例中，可以用pRIT12793代替pRIT12792。pRIT12792和pRIT12793中包含有NcoⅠ-XbaⅠ片段，它是用體外DNA操作方法，從乙型肝炎病毒(血清型adw)的PreS1-PreS2區(qū)域中獲得，乙型肝炎病毒先克隆在質粒pRIT10616中，質粒pRIT10616從美國典型菌種保藏中心獲得，登記號為ATCC39131。
52μg的pRIT12792，先用NcoⅠ和XbaⅠ限制性內切酶消化，再用綠豆核酸酶處理以消除5′端延伸。將600ng(Zpmol)處理并純化的495bp的NcoⅠ-XbaⅠ片段與170ng(0.02pmol)pRIT12314載體連接，載體已用BamHⅠ和SmaⅠ切開并用綠豆核酸酶處理過。質粒pRIT12314包括了啤酒酵母完整的2微米片段和一個表達框架，表達框架中，一個BamHⅠ-SmaⅠ-EcoRⅠ接頭將TDH3啟動子和ARG3終止區(qū)域隔開。
前面實例10(B)上有pRIT12314構建過程的更詳細描述。按Cohen等人(引文見前)方法，將上述連接混合物轉化大腸桿菌MM294，用氨芐青霉素抗性平板篩選得到六個轉化子，其中的質粒上PreS1-PreS2片段以正確的方向插入者命名為pRIT12843(a…f)(圖18)。
第二步，將S基因6的編碼區(qū)域插入到上述質粒pRIT12843(a…f)中，重新構建了PreS1-PreS2-S完整基因。
這可按下列方法進行質粒pRIT12843(a…f)用BamHⅠ和SalⅠ酶切消化。BamHⅠ位點在在PreS2區(qū)域的起始位置上，SalⅠ位點在來自于pBR327的ARG3終止子后面。從質粒pRIT12843(a…f)純化出最大的BamHⅠ-SalⅠ片段(10，400bp)，從pRIT12660(實例16)中得到BamHⅠ-SalⅠ小片段，80μg前者(0.012μmol)與300ng后者(0.11pmol)連接。pRIT12660的BamHⅠ-SalⅠ小片段(4800bp)包含了一部分PreS2-S編碼序列，它后面跟有ARG3終止子序列和酵母的Leu2序列。連接后，按Cohen等人(引文見前)方法，用各種質粒pRIT12843(a…f)轉化大腸桿菌MM294，得到一系列氨芐青霉素抗性的克隆。這些克隆包含的質粒命名為pRIT12845(a…f)。pRIT12845(a…f)制備流程圖如圖18所示。按Ito等人(引文見前)方法，用質粒pRIT12845(a…f)分別轉化啤酒酵母10S44Ccir°細胞株，用商品AUSRIA試劑盒檢測細胞粗提物，篩選了酵母轉化單克隆的培養(yǎng)物。細胞粗提物是通過將再懸浮于含0.5%吐溫20，2mMPMSF和5%異丙醇的pBS中細胞破碎而制備的。六種用pRIT12845(a…f)分別轉化的轉化子中，各取一個檢測。在六個被檢的轉化子中，有五個呈AUSRIA陽性反應。
為了確定用AUSRIA檢測的S相關抗原性蛋白的大小，將上面描述的樣品按實例20方法進行免疫吸印分析。在5個AUSRIA陽性的轉化子中，有四個的S相關蛋白約39Kd，一個轉化子(抽提物a)的S相關蛋白約23Kd，抽提液e中有39Kd蛋白表達的酵母轉化子，其質粒定為pRIT12845，參見圖18。
實例32PreS1-PreS2-S蛋白裝配成顆粒，顆粒帶有多聚人血蛋白的受體，在顆粒表面有PreS1的抗原決定簇。
用pRIT12845、pRIT12660或pRIT12377轉化酵母菌10S44Ccir°，用pRIT12363轉化酵母株DC5cir°，這些細胞的粗提物按實例19的方法制備?？偟鞍踪|濃度，HBsAg相關抗原性及多聚人血清蛋白受體的測定按實例19的方法進行)。結果表明pRIT12843和pRIT12660(參見實例10)轉化的10S44C.cir°細胞抽提液中，有強烈的多聚人血清蛋白結合活力，而在pRIT12377轉化的10S44Ccir°細胞及pRIT12363轉化的DC5cir°細胞抽提液中，不存在這種結合活力。
pRIT12845轉化的10S44C cir°細胞粗提物進行氯化銫平衡離心(實例12描述)，用AUSRIA測定法測定氯化銫組分的HBsAg相關抗原性;表明抗原帶在rho＝1.2g/cm3左右，氯化銫組分的免疫吸引分析證實了這一點。按實例12描述的方法，用ELISA測定法測定了氯化銫組分的Pre S1抗體結合活力。抗原結合到固相的HBsAg抗體上后，再與單克隆抗體MA18/7實例31)溫育，然后按實例12所述方法，用生物素化的抗鼠免疫球蛋白，鏈抗生蛋白-生物素化的辣根過氧化物酶復合物及色原檢測。
在氯化銫梯度上，發(fā)現PreS1專一性抗性體結合活力與HBsAg相關抗原性共平衡。這些結果表明pRIT12845轉化的10S44Ccir°細胞產生的PreS1-PreS2-S蛋白裝配成顆粒，與血清來源的22nmHBsAg顆粒一樣。這些顆粒在表面暴露了PreS1專一性順序作為多聚人血清蛋白的受體。從這些顆粒在AUSRIA試驗中的活力水平以及PreS1-PreS2-S蛋白在免疫吸印分析中的反應強度，可以得出這樣的結論在顆粒中，由于PreS1順序的存在，顆粒的S蛋白決定簇被部分破壞。
實例33pRIT12845轉化的酵母中表達了兩個帶有PreS1、PreS2和S蛋白抗原決定簇的蛋白，分子量約為38Kd和45Kd。
在pRIT12845轉化的細胞中表達的HBsAg相關蛋白的單體，按實例20描述的方法分析。
比較了轉化細胞蛋白質和人血清中純化的HBsAg顆粒(血清型ad)的蛋白質遷移率和免疫反應性。(后者由聯邦德國哥廷根大學醫(yī)學微生物系W.H.Gerlich提供)。
蛋白質分析的三個免疫反應試劑-識別S蛋白抗原決定簇的單克隆抗體(由H.Thomas提供，見實例20)。
-合成的PreS2肽所誘導的多價抗血清(實例23描述)-對PreS1肽抗原決定簇專一的單克隆抗體MA18/7，由Heermann等人描述(J.Virol.52，396-402，1984)。
免疫吸印分析表明pRIT12845轉化的10S44C細胞的蛋白質中，有兩個對上面描述過的三種免疫反應試劑都有反應。這兩個蛋白質分子量約為38Kd和45Kd，分子量測定以Heermann等人(J.Virol;52，396-402，1984)測血清HBsAg蛋白的遷移為基礎。pRIT12845編碼的38KdPreS1-PreS2-S蛋白比HBsAg顆粒的PPreS1-PreS2-S蛋白遷移稍快，人血清的HBsAg顆粒(ad血清型)上的P39蛋白質中PreS區(qū)域設想為119個氨基酸(Heermann等J.Virol.52，296-402，1984)而pRIT12845編碼的PreS1區(qū)域為108個氨基酸。
上面的結果表明;pRIT12845轉化的酵母細胞表達了兩個蛋白質;分子量大約為38Kd和45Kd，它們帶有PreS1，PreS2及S蛋白質的抗原決定簇。
實例3445Kd的PreS1-PreS2-S蛋白的種類中帶有富含甘露糖類型的N-型糖苷鍵聯接的寡糖鏈。
pRIT12845轉化的細胞在等重的10mM磷酸鈉緩沖液(PH7.4，含2%SDS，8mMEDTA)中，用等重的玻璃珠(直徑為0.45-0.50mm)，在Vertex型混合器上攪拌分散。
離心后，上清液在100℃加熱4分鐘。
用40ml的25mM檸檬酸鈉(PH5.0)稀釋10μl煮沸過的上清液，再加入2μlEndoH(74μg/ml)(參見實例27)。加了和未加EndoH的樣品在37℃溫育2.5小時。
按實例20描述過的方法，將EndoH處理和未處理的樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫吸印分析。
印跡用單克隆抗體6(S蛋白專-)和MA18/7(PreS1肽專一)分析(參見實例33)。
用單克隆抗體6和MA18/7進行的免疫吸印分析表明;在EndoH處理時，45Kd的帶消失而出現41Kd的帶。38Kd帶的遷移率不受EndoH處理的影響。
這些結果表明，45Kd的PreS1-PreS2-S蛋白以種類中帶有一條富含甘露糖的N-型糖苷鍵聯連結構的寡糖鏈。
實例3538Kd的PreS1-PreS2-S蛋白以亞胺鍵形式共價連接十四烷酸。
pRIT12845，pRIT12660或pRIT12377轉化的酵母10S44Ccir°細胞株在YNB培養(yǎng)物中生長至0.D620nm為0.4。
20ml細胞培養(yǎng)物用1mCi的3H標記的十四烷酸(New England Nuclear)標記60分鐘，然后離心收集。細胞用涼水洗滌，再懸浮在100ml 5mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.4，含3mMDTT，1% SDS，1mMPMSF)中，加入100mg玻璃珠，用Vortex型混合器劇烈攪拌六次，每次30秒鐘，使細胞破裂，每次攪拌之間用冰浴冷卻。在Eppendorf離心機5414上離心1分鐘，除去碎片(Towler and Glaser，Proc，Natl Acad Sci 83，2812-2816，1986)，在室溫下，20μl抽提物用7μl新配制的4M羥胺(pH10，含20mM甘氨酸)處理3.5小時。
羥胺處理及未處理的樣品按實例26描述過的方法，進行SDS-聚丙烯酰胺電泳和熒光檢測。沒用羥胺處理的樣品也按實例20描述的方法，用單克隆抗體6(識別S蛋白抗原決定簇)進行免疫吸印分析。
免疫吸印分析結果和實例20及實例33的結果相同。
熒光檢測表明一個標記的38Kd蛋白帶只存在于pRIT12845轉化細胞的細胞抽提液中。這種標記對羥胺是穩(wěn)定的，說明3H-十四烷酸的標記是以亞胺鍵形式存在的。pRIT12660轉化細胞的抽提物中沒有特異標記蛋白的檢出。
這些結果表明38Kd的PreS1-S2-S蛋白上存在以亞胺鍵形式共價連接的十四烷酸。一般來說十四烷酸通過與氨基末端甘氨酸形成亞胺鍵而與蛋白質共價連接。這就表明起始的甲硫氨酸已經從PreS1-PreS2-S蛋白中除去，而位于第二位的甘氨酸殘基就可以與十四烷酸起?；磻?。
實例36利用PreS1載體插入功能性DNA編碼序列起始物為質粒pRIT12793 DNA(見前述實例31)。pRIT12793的一個495bp的NcoⅠ-XbaⅠ片段上包含了Pre S1-Pre S2編碼序列。pRIT12793質粒DNA用NcoⅠ酶切后用T4DNA聚合酶補齊粘性末端，再用XbaⅠ內切酶消化，這個NcoⅠ/T4DNA聚合酶/XbaⅠ片段聚丙烯酰胺凝膠電泳純化后插入到經SmaⅠ和XbaⅠ酶消化的載體pUC12上，克隆載體pUC12可以從Amersham(Little Chalfont，Bucks，Unitted Kingdom)和pharmacia(Piscataway，NJ)購買。圖5B表示質粒pRITX的構建過程。在質粒pRITX的Pre S1-Pre S2區(qū)域中，有一個單一NcoⅠ位點與Pre S1區(qū)域的ATG起始密碼子重疊，有一個XbaⅠ位點在Pre S2肽C末端編碼序列的TAA終止下游附近;有一個單一BstX位點靠近Pre S1肽N末端的編碼區(qū)域。
有經驗的人會知道，包含有PreS1-S2序列的載體pRITX或類似衍生載體上，通過在PreS1區(qū)的BstX位點的插入，能進一步引入功能性的DNA編碼序列，以產生同框架融合的有意義肽段。
并且，功能性的DNA編碼序列可以通過BstX與BamHI，或與EcoRI核酸內切酶的聯合酶解pRITX或其衍生物而引入。功能性DNA編碼序列在這些位點之間的插入，除去了大部分的PreS1編碼區(qū)和PreS2末端的部分序列。這種融合將是PreS1-引入的功能DNA編碼序列-PreS2區(qū)域類型的。一旦這種融合產生，它們可以重組到其它的質粒上，這些質粒包含PreS1-PreS2-S的剩余序列，和在大腸桿菌及啤酒酵母中保持和復制的必需序列，如在實例16A所示。
實例37HTLVⅢ病毒蛋白與PreS2-S序列中PreS2區(qū)域的肽融合產生新的雜種顆粒HBVPreS2-S編碼序列中PreS2區(qū)域也可以用來插入或融合其它病毒抗原的肽段序列，這些病毒包括引起人類愛滋病的反轉錄病毒如已知的HIV，HTLV-Ⅲ或LAV病毒。
HIV病毒基因組的克隆已由RatnerL.等人(Nature，313，277-2841985)和ShawG等人(Science，226，1165-1171，1984)描述。從這個基因組的克隆中，可以得到各種亞片段作為功能性的DNA編碼序列，它對應的有意義的肽區(qū)域融合到PreS2-S序列上形成新的雜種顆粒，這種顆粒帶有HIV病毒蛋白質的抗原決定簇。這種雜種顆?？梢宰鳛轭A防HIV感染的人用疫苗的基礎。
下面例舉的是許多有意義肽區(qū)的一部分。
a.C7肽這個肽區(qū)是緊靠著外殼蛋白前體排列位點的45個氨基酸延伸。由starcich.B.R.等人(Cell45，637-648，1986)定義。
b.肽121這個肽區(qū)是一些反轉錄病毒穿膜的外殼蛋白中相對保守的氨基酸順序(參見CiancioloG.J.et，al(Scieme，230，453-455，1985)。這個順序被認為參與了反轉錄病毒誘導的免疫抑制病理過程(Snyderman，R.andCiancislo，G.J.ImmunolToday，5.240，1984)。
C.Dressman肽是一個合成肽段，相當于HIV外殼糖蛋白前體的735-752位氨基酸順序Kennedy，R.C.等人(Science，231，1556-15591986)用它來免疫兔子，兔的抗血清用于研究誘導的抗體對HIV外殼蛋白質的識別。結果表明這個區(qū)域能夠誘導對天然糖蛋白的免疫應答。
A.從HTLV-Ⅲ中分離的C7肽DNA序列與PRIT10911PreS2-S區(qū)的融合。
起始物是質粒pBH10-R2，包含從BH10分離的HIV克隆的基因組。這個質粒由R.C.GallaNationalInstitutesofHealth，Bethesda，M.D)提供。一個從pBH10-R2中切下的病毒DNA來源的3108bpSalⅠ-XhoⅠ片段，克隆到pUC18中SalⅠ和XhoⅠ位點之間，得到質粒pRIT12901。這個SalⅠ-XhoⅠ位點之間，得到質粒pRIT12901。這個SalⅠ-XhoⅠ片段的限制性酶切圖譜如圖IB所示。質粒pUC18由NorranderJ.等人(Gene26，101-106，1983)描述，可從PharmaciaInc，Piscataway，N.J.購買。
為了產生這種融合，pPIT12901質粒DNA用BglⅡ和MboⅡ核酸內切酶消化，經丙烯酰胺凝膠電泳分離，電洗脫得到一117bp片段(參見圖IB)。這個DNA片段用綠豆核酸酶處理除去單鏈延伸，再與pRIT10911質粒DNA連接(參見前面實例5)。pRIT10911先用BamHI核酸內切酶消化并用綠豆核酸酶處理過。從這個連接混和物中分離出質粒pRIT12893。在pRIT12893中，pRIT12901的BglⅡ-MboⅡ的117bp片段插入到pRIT10911上。測定了TDH3啟動子和HTLV-Ⅲ的117bpBglⅡ-MboⅡ片段(綠豆核酸酶處理并插入pRIT12893上)融合聯接區(qū)的核苷酸序列，發(fā)現這個片段BglⅡ位點末端多余的10個核苷酸被切除。聯結區(qū)序列是5′ATGGAGGAGGAGATATGAGGGA3′這里，第一個劃線的AGT密碼子在來自pRIT10911質粒的TDH3啟動子區(qū)域，第2個劃線ATG密碼在C7肽片段的內部。第2個ATG密碼子與一個TGA終止密碼重疊，這個終止密碼與第一個ATG密碼子閱讀框相同。pRIT12893上融合區(qū)域3′末端DNA序列的測定表明MboⅡ-綠豆核酸酶處理的HTLV-Ⅲ片段的末端與pRIT10911上的PreS2序列的同框架融合的序列是正確的，如圖2B所示。
再用HindⅢ核酸內切酶消化pRIT12893質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳分離純化，電洗脫后得到-3250bp片段。這個3250bpHindⅢ片段再插入質粒YEp13的HindⅢ位點，得到質粒pRIT12894，這個質粒的DNA按Ito等人(引文在前面實例10方法轉化到亮氨酸缺陷的酵母細胞株DC5和10S44C上。
pRIT12894的C7-PreS2-S融合DNA在酵母中轉錄，翻譯，從TDH3的ATG密碼子起始，到TGA密碼子(上面的序列中劃了線的)終止，將合成一個小的5肽，從第2個AGT密碼子(在C7肽序列內部)起始將合成C7-PreS2-S融合肽。這個融合肽僅包含C7肽的38個氨基酸，而在完整的BglⅡ-MboⅡ-綠豆核酸酶處理的C7序列中包含45個氨基酸序列。值得重視的是從相同的連接混合物(與pRIT12893相同)恢復的其它質粒，能夠測出來，并測定序列以確定它們是否帶有完整的融合片段。
B.相當于肽121的DNA序列與pRIT10911的PreS2-S區(qū)的融合。
為了產生這種融合，用HhaⅠ和HindⅢ內切酶消化pRIT12901的DNA(見前面A部分)，得到一個230bp的片段，如圖1B所示。這個片段經丙烯酰胺凝膠電泳強化，電洗脫后用T4DNA聚合酶補齊單鏈并延伸，這樣處理和純化的片段接到事先用BamHI消化并用綠豆核酸酶處理的pRIT10911 DNA上，從連接混合物中得到質粒pRIT12897。pRIT12897上，HIV DNA的230bp片段以正確閱讀框插入pRIT10911上的Pre S2序列，形成融合物，如圖3B所示。然后用HindⅢ內一切酶消化pRIT12897質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫后得到一個3365bp片段，它包含TDH3啟動子，HIV-Pre S2-S融合物和ARG3終止子。這個3365bp片段連接到事先用HindⅢ消化過的質粒YEp13上，形成質粒pRIT12898，然后按Ito等人(引文在前面實例10上)方法，用質粒pRIT112898轉化亮氨酸缺陷的酵母細胞株DC5和10S44C上。
C.相當于Dreesman肽的DNA序列與pRIT10911的Pres2區(qū)的融合。
按常規(guī)方法合成兩條單鍵，再退火合成得到一個60bp的DNA片段，序列如下5′GATCTCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA3′3′AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT5′5′GACAGAGACAGATCCCCG3′3′CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC5′
這個片沒有BglⅡ的5′及BamHⅠ的3′單鏈延伸，大約200ng的雙鏈片段與300ng的BamHI酶消化的pRIT10911質粒DNA混合并連接。從這個連接混合物中鑒定并得到了質粒pRIT12899，在pRIT12899上，60bp的片段從BamHI位點插入pRIT10911，產生了一個同閱讀框架的融合物，如圖4B所示。用HindⅢ酶消化pRIT12899質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳純化，電洗脫得到一個3200bpHindⅢ片段，這個HindⅢ片段插入YEp13的HindⅢ位點，產生質粒pRIT12900，然后接Ito等人方法，用pRIT12900質粒DNA轉化亮氨酸缺陷的酵母細胞株DC5和10S44C。
實例38pRIT12894和pRIT12898編碼的融合蛋白的表達。
質粒YEp13，pRIT12363，pRIT10912，pRIT12894或pRIT12898轉化的酵母細胞株DC5或10S44C分別生長在缺乏亮氨酸的液體培養(yǎng)基(YNB+80μg/ml組氨酸或僅有YNB)。細胞蛋白質按實例11描述的方法進行免疫吸印分析，用識別對變性和還原有抗性的人HBsAg上的抗原決定簇的單克隆抗體作為第一抗體(單克隆抗體6由英國倫敦皇家免費醫(yī)院的H.Thomas提供)。質粒pRIT10912在前面實例5已經描述，pRIT12894和pRIT12898在前面實例37已經描述。pRIT12363帶有HBV的S基團，融合到來自插入到一個酵母載體質粒的pRIT12377(實例10，前面部分B)，即pRIT12322(實例8)的2800bpHindⅢ片段上的TDH3啟動子。在TDH3啟動子控制下，產生HBsAg。
免疫吸印分析表明用pRIT12894轉化的酵母細胞株DC5或10S44C的總細胞蛋白中，有一個S相關蛋白，分子量約為32Kd。用pRIT12898轉化時，S相關蛋白約為45Kd，而pRIT10912轉化DC5時，S相關蛋白分子量約為29Kd。
質粒pRIT12363，pRIT10912或pRIT12894轉化的酵母細胞株DC5的粗提液按實例12描述的方法制備。蛋白質濃度和AUSRIA活力也按實例12描述的方法測定。這些粗提液按上面描述的方法進行免疫吸印分析。
這些粗提物經氯化銫平衡離心(按實例12描述的方法)，用AUSRIA測定法測定氯化銫各組分的HBsAg相關抗原性，結果表明抗原帶在rho＝1.2g/cm3左右。這一點也被氯化銫各組分的免疫吸印分析所證實。
這些結果表明pRIT12894轉化的酵母細胞株DC5產生的32Kd融合蛋白質，裝配成與人血清來源22nmHBsAg一樣的顆粒。從用AUSRIA試劑盒測定的這些顆粒的活力水平以及在免疫吸印分析中32Kd蛋白的反應強度，可以得到結論C7肽順序的存在，引起了顆粒上S蛋白決定簇的部分妨礙和破壞。
從這些結果可以得到結論將pRIT12894或pRIT12898轉化到酵母細胞株DC5或10S44C上，相應地專一性合成32Kd和45Kd蛋白，它們都帶有S蛋白抗原決定簇。
有經驗的人會知道，從pRIT12894和pRIT12898和pRIT12900轉化的酵母細胞培養(yǎng)物中，可以用常規(guī)的方法抽提和純化帶有HIV病毒肽段抗原決定簇的雜種顆粒。這種純化的顆粒可以加上佐劑如氯氧化鋁或磷酸鋁制備成人用疫苗。推薦的劑量為1-1000μg蛋白，可用常規(guī)試驗確定。這里例舉的發(fā)明，包括了帶有有意義的HIV抗原決深簇的雜種顆粒，它來自于HIV病毒蛋白其它肽區(qū)序列與HBVPreS2-S區(qū)編碼序列的融合，這一點也是可以理解的。
權利要求
1.一種制備轉化的真核宿主細胞的方法，該方法包括用一載體轉化真核宿主細胞，這種載體是一重組的DNA分子與一調節(jié)區(qū)相連接構成，調節(jié)區(qū)包含有一功能性的DNA編碼序列，這一序列同相位的與HBV的Pre S2-S蛋白的Pre S2-S區(qū)的蛋白相融合。這里的功能性的DNA編碼序列還可編碼瘧原蟲(Plasmodium)的環(huán)狀體蛋白，或HIV包膜基因序列如HIV C7蛋白，HIV肽121蛋白或HIV Dreesman肽。
2.權利要求1的方法，其中宿主是酵母細胞。
3.權利要求2的方法，其中宿主屬于酵母屬(genus Saccharomyces)
4.權利要求3的方法，其中宿主屬于啤酒酵母屬(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。
5.權利要求4的方法，其中宿主是DC5、DC5 cir°，10S44C或10S44C Cir°菌株。
6.一制備帶有乙型肝炎表面擴原蛋白(HBsAg)雜種顆粒的方法，該雜種顆粒包含和/或存在有由功能性DNA編碼序列編碼的一種肽，該方法包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用載體已轉化的真核宿主細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離此顆粒物質，其中所述載體是一重組的DNA分子與一含有功能性DNA編碼序列同相位與HBV的Pre S2-S蛋白序列中的Pre S2區(qū)部分相融合的調節(jié)區(qū)相連接構成，這里的功能性DNA編碼序列還可編碼瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白，或HIV的包膜基因序列。如HIV C7蛋白，HIV肽121蛋白，或HIV Dreesman肽。
7.制備轉化的宿主細胞的方法，包括用HBV的Pre S1蛋白編碼區(qū)轉化宿主細胞。HBV的Pre S1蛋白編碼如下的氨基酸順序-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln Ala
8.權利要求7的方法，其中該編碼是由重組的DNA載體構成。
9.權利要求7的方法，其中宿主是酵母細胞。
10.權利要求9的方法，其中宿主屬于酵母屬。
11.一種制備蛋白的方法，該蛋白是由權利要求7所述的Pre S1蛋白編碼區(qū)編碼的，該方法包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用該區(qū)轉化的宿主細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離此蛋白質。
12.一種制備轉化的宿主細胞的方法。它包括用HBV的Pre S2蛋白編碼區(qū)或HBV Pre S2-S蛋白編碼區(qū)轉化宿主細胞，其中Pre S2蛋白部分編碼如下的氨基酸順序Thr-55 -50 orMet-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40 -30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn
13.權利要求12的方法，其中該編碼區(qū)是由重組DNA載體組成。
14.一種制備由權利要求12的Pre S2或Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白的方法，它包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用該編碼區(qū)轉化的宿主細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離此蛋白質。
15.一種制備由權利要求12所述的Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的顆粒的方法，它包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用該編碼區(qū)轉化的宿主細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離此蛋白質。
16.一種制備轉化的酵母細胞的方法，它包括用由Pre SlPre S2-S蛋白編碼順序與一調節(jié)區(qū)相連接的重組DNA載體來轉化酵母宿主細胞。
17.一種制備由Pre S1-Pre S2-S蛋白編碼序列編碼蛋白的方法，它包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用Pre S1-Pre S2-S蛋白編碼序列與一調節(jié)區(qū)相連接的重組DNA載體轉化的酵母細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離蛋白質。
18.一種制備含有由Pre S1-Pre S2-S蛋白編碼序列編碼的多肽組成的顆粒的方法，它包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用由Pre S1-Pre S2-S蛋白編碼序列與一調節(jié)區(qū)相連接組成的重組DNA載體轉化的酵母細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離此顆粒。
19.一種制備轉化的酵母細胞的方法，它包括用由如下的Pre S1-S2蛋白編碼序列與一調節(jié)區(qū)相連結構成的重組DNA載體轉化酵母宿主細胞。Pre S1區(qū)-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Ieu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPre S2區(qū)-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn
20.一種制備由權利要求19所述Pre S1-Pre S2蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白的方法。
21.一由一功能性的DNA編碼序列同相位的與HBV的Pre S2-S蛋白質編碼序列的Pre S2區(qū)部分相連接組成的重組DNA分子。其中功能性的DNA編碼區(qū)含有Pre S2編碼序列，Pre S1編碼序列或完整的Pre S1-Pre S2編碼序列，瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白質編碼序列，或HIV的編碼序列，如HIV的包膜(蛋白)基因序列如HIV的C7蛋白質編碼區(qū)，HIV肽121編碼區(qū)或稱HIV Dreesman肽編碼區(qū)。
22.一由一重組DNA分子與一調節(jié)區(qū)相連接構成的重組載體。其中DNA分子含有一功能性的DNA編碼序列，且這一編碼序列同相位的與HBV Pre S2-S蛋白編碼序列中的Pre S2區(qū)部分相融合，而調節(jié)區(qū)中含有TDH3啟動子。
23.一由一重組DNA分子與一調節(jié)區(qū)相連接組成的重組載體。其中DNA分子含有一功能性的DNA編碼序列，這一編碼序列同相位的與HBV的Pre S2-S蛋白編碼區(qū)中的Pre S2區(qū)部分相融合。其中功能性的DNA編碼序列含有Pre S2編碼序列，Pre S1編碼序列或完整的Pre S1-Pre S2編碼序列，瘧原蟲的環(huán)狀體蛋白編碼序列，或HIV的編碼序列如HIV的包膜(蛋白)基因序列，如HIV C7蛋白，HIV肽121蛋白或稱HIVDreesman肽。
24.含有一個192堿基對的Sau 3A酶切片段的權利要求23的載體，這一片段編碼惡性瘧原蟲(P.faliciparum)的環(huán)狀體(CS)蛋白中的16個四肽重復序列，上述片段可以從包含有惡性瘧原蟲環(huán)狀體蛋白編碼序列的WR201質粒中的StuⅠ-RSaⅠ片段用Sau 3A酶解再減去前頭52個堿基對衍生而來。
25.包含額外環(huán)狀體蛋白DNA的Sau 3A酶解片段的權利要求24的載體。
26.一包含與一調節(jié)區(qū)相連接的重組DNA分子的重組載體。其中DNA分子含有一功能性的DNA編碼序列，并與HBV的Pre S2-S蛋白編碼序列中的Pre S2區(qū)部分同相位相連。其中功能性DNA編碼序列含有全部的或部分的Pre S2蛋白編碼序列。
27.權利要求26的載體中的功能性的DNA編碼序列具有如下的氨基酸編碼序列PRE-S2區(qū)-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn.
28.權利要求26的載體中的功能性DNA編碼序列包含全部或部分Pre S1-Pre S2蛋白編碼序列。
29.權利要求28的載體中的功能性DNA編碼序列編碼如下的氨基酸序列PRE-S1區(qū)-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPRE-S2區(qū)-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn.
30.一用重組載體轉化的真核生物宿主細胞，其中所說的載體是指權利要求25的載體。
31.權利要求30所說的宿主是一酵母細胞。
32.制備含有乙型肝炎表面擴原(HBsAg)蛋白的雜種顆粒的方法，雜種蛋白中包含有或存在有功能性DNA編碼序列所編碼的肽，制備方法包括用適當的培養(yǎng)基培養(yǎng)用載體已轉化的真核宿主細胞和從細胞裂解物或這種宿主培養(yǎng)物的提取物中分離顆粒物質，其中所說的載體是指權利要求25的載體。
33.用權利要求32的方法制備的一種顆粒。
34.包含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白的雜種免疫顆粒，其中所說的顆粒中含有或存在有功能性DNA所編碼的肽。
35.由權利要求34所述的顆粒組成的疫苗，這種疫苗含有一定量的膠粒，具有免疫保護作用。
36.由權利要求34所述顆粒和多價吸附劑組成的一種膠粒。
37.由權利要求36所述的膠粒組成的疫苗，這種疫苗含有一定量的膠粒，具有免疫保護作用。
38.HBV的Pre S1蛋白編碼區(qū)編碼如下的氨基酸序列-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln Ala
39.一由權利要求38所述的Pre S1蛋白編碼區(qū)與一調節(jié)區(qū)相連接而組成的重組DNA載體。
40.一含有權利要求38所述的Pre S1蛋白編碼區(qū)的轉化宿主細胞。
41.由權利要求38所述的Pre S1蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白質。
42.由權利要求38所述的Pre S1蛋白編碼區(qū)編碼的一定量蛋白組成的具有免疫保護作用的疫苗。
43.HBV的Pre S2蛋白編碼區(qū)或HBV Pre S2-S蛋白編碼區(qū)，其中Pre S2部分編碼如下的氨基酸序列Thr-55 -50 orMet-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40 -30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn
44.一由權利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白編碼區(qū)與一調節(jié)區(qū)相連接構成的重組DNA載體。
45.一包含權利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白編碼區(qū)的轉化宿主細胞。
46.由權利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白。
47.由權利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的一定量蛋白組成的具有免疫保護作用的疫苗。
48.一由權利要求43所述的Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白組成的顆粒。
49.由權利要求43所述的Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的、一定量顆粒組成的具有免疫保護作用的疫苗。
50.一種由權利要求48所述的顆粒和多價吸附劑組成的膠團。
51.由權利要求50所述的一定量的膠團組成的具有免疫保護作用的疫苗。
52.一由Pre S1-Pre S2-S蛋白編碼序列與一調節(jié)區(qū)相連接構成的重組DNA載體。其中Pre S1-Pre S2部分編碼下列氨基酸序列PRE-S1區(qū)-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPRE-S2區(qū)-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn
53.一被權利要求52所述的載體轉化的酵母宿主細胞。
54.由權利要求52的載體上的Pre S1-Pre S2-S序列編碼制備的蛋白。
55.由權利要求54所述的一定量的蛋白組成的具有免疫保護作用的疫苗。
56.一由Pre S1-Pre S2-S蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白組成的顆粒。
57.由權利要求56所述的一定量顆粒組成的具有免疫保護作用的疫苗。
58.一由權利要求56所述的顆粒和多價吸附劑組成的膠團。
59.由權利要求58所述的一定量膠團組成的具有免疫保護作用的疫苗。
60.Pre S1-Pre S2蛋白編碼序列含有如下的氨基酸序列Pre S1區(qū)-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Ieu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPre S2區(qū)-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn
61.一由權利要求60所述的Pre S1-Pre S2蛋白編碼序列與一調節(jié)區(qū)相連接構成的重組DNA載體。
62.一被權利要求61所述載體轉化的酵母宿主細胞。
63.由權利要求60所述的Pre S1-Pre S2蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白。
64.一種由權利要求60所述的由Pre S1-Pre S2蛋白編碼區(qū)編碼的一定量的蛋白組成的具有免疫保護作用的疫苗。
65.一由Pre S1功能性的DNA編碼序列-Pre S2-S蛋白質編碼序列與一表達控制序列相連接構成的重組DNA載體。
66.一被權利要求65所述的載體轉化的酵母宿主細胞。
67.由權利要求66所述宿主表達的蛋白質。
68.由權利要求67所述的一定量的蛋白組成的具有免疫保護作用的疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒抗原和含有這些抗原的雜種抗原，以及利用DNA重組技術將上述抗原的編碼基因克隆到酵母中。上述抗原對制備疫苗，如乙型肝炎病毒疫苗或瘧疾疫苗，是很有價值的。
文檔編號C12N1/16GK1031395SQ8810048
公開日1989年3月1日 申請日期1988年1月30日 優(yōu)先權日1987年1月30日
發(fā)明者特里薩·卡貝桑, 米歇爾·德懷爾德, 雜杰爾·哈福德 申請人:史密斯克蘭-Rit公司