專利名稱:重組體桿狀病毒載體中乙型肝炎病毒抗原的表達的制作方法
本發(fā)明涉及生產(chǎn)人體病毒性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及其有關的Pre-S2蛋白質(zhì)的方法。
人體乙型肝炎病毒HBV，即hepadna病毒種群之一是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常見病因。該病毒基因組包括小圓形的、部分是單鏈的脫氧核糖核酸(DNA)物種，在病毒顆粒中與病毒DNA聚合酶相連接。DNA聚合酶的功能使病毒DNA成為雙股形式，以及在感染細胞內(nèi)復制病毒DNA。HBV具有肝細胞向性。人們相信這種向性的分子基礎存在于病毒顆粒的表面蛋白中，在開始感染的某個階段，與存在于受納細胞上的細胞結(jié)構(gòu)(受體)反應。細胞和人體受感染開始可被由人體抗外源病毒蛋白中產(chǎn)生的抗體阻滯。人們通常從急性病開始感染，常常導致長期的慢性病，包括高濃度病毒抗原(某些以所謂22毫微米非感染形式顆粒或澳大利亞病毒抗原)和42毫微米感染病毒(“Dane顆?！?在傳染期的患者血液中循環(huán)的持續(xù)性病毒感染。還在其他體液中發(fā)現(xiàn)病毒和病毒抗原(精液、唾液、鼻咽分泌物、經(jīng)血、腹水、膽汁、淚液、乳液、腦脊髓液等)，及隨環(huán)境傳播的病毒。人體“病原攜帶者”在急性感染期和慢性感染期，對疾病的流行病學都是重要的。
脂膜小球結(jié)構(gòu)形式的所謂22毫微米顆粒(15～22毫微米)是作為受納細胞活性病毒感染的副產(chǎn)品產(chǎn)生的。它主要由包埋在脂膜中的病毒(主要為HBsAg及一些Pre-S2)表面蛋白(抗原)組成。還在患者血液中發(fā)現(xiàn)含這些抗原的其它病毒誘發(fā)結(jié)構(gòu)是絲狀或桿狀結(jié)構(gòu)(有22毫微米寬，但有幾百毫微米長)。HBsAg是用病毒遺傳信息表示蛋白組分的病毒編碼糖蛋白(有多至3個碳水化合物側(cè)鏈的蛋白)，以及用病毒所生長的細胞機器表示碳水化合物組分。像傳染病毒那樣，22毫微米脂類組分和其它顆粒是由病毒所生長的宿主細胞脂膜衍生的。這樣，脂類和碳水化合物組分都可用細胞表示。HBsAg蛋白序列、其內(nèi)在的抗原結(jié)構(gòu)和碳水化合物側(cè)鏈的附著位點，以及植入在脂類內(nèi)的HBsAg蛋白部分都用病毒遺傳序列表示。球形42毫微米傳染的病毒顆粒包括DNA內(nèi)部核心和結(jié)合DNA聚合酶，其包括由7毫微米脂類組成的外殼包圍的核心抗原(HBcAg)和“e”抗原(HBeAg)、HBsAg和一些Pre-S2蛋白。Pre-S2是病毒和其它病毒誘發(fā)結(jié)構(gòu)的微量組分，可代表對HBsAg不完全處理的蛋白質(zhì)前體，因為它含有整個HBsAg序列及在HBsAg的氨基末端(“上游”)大約55個額外氨基酸。
在由BN Fields編的“Virology”(Raven Press)NW.1392頁圖5中表示的包含大約3200堿基長HBV(Robinson，1985年)的限制性內(nèi)切酶位點(Bam HI，Acc I，等)的位置。在部分雙股病毒DNA的完全(長)鏈中DNA具有4個開譯讀碼(ORF)，ORF包括可從互補信使核糖核酸(mRNA)序列轉(zhuǎn)譯成氨基酸(蛋白質(zhì))連接序列的DNA核苷酸序列。ORF-2包含表達處于同相和163個氨基酸“Pre-S”序列下游的大概25，000道爾頓HBsAg(約200個氨基酸)的序列。不能確定HBcAg和Pre-S2蛋白質(zhì)是如何由ORF-2編碼序列衍生而來，ORF-3編碼用于相當于HBcAg(190～220個氨基酸)的主要核心蛋白。ORF-1(多半是病毒聚合酶)和ORF-4的基因產(chǎn)物是否相同還未肯定。
人受HBV感染通常包括熟友(常經(jīng)皮膚接觸)血清和含個人之間物質(zhì)的血清的傳輸(此處為血清性肝炎的又一名稱)。該疾病特別流行于發(fā)展中國家，如中國、大洋洲、南太平洋、非洲、中東及南美洲和印度的某些地區(qū)，在東南亞的一些國家中這種患病率很高(5～20%)，然而這種病還發(fā)生在世界的其它地區(qū)，尤其在特殊的少數(shù)民族人群之中，即與慢性病毒攜帶者的密切接觸、與急性乙型肝炎患者的性接觸、受感染母親的新生兒、性亂交者、共用注射針的違法吸毒者、接受血制品的血友病患者、血液滲析患者及與其接觸者，以及醫(yī)護人員(牙醫(yī)師、護士、外科醫(yī)師、臨床化驗室工作人員)。肝癌細胞和乙型肝炎病毒感染的結(jié)合被認為是由于從慢性抗原血癥導致慢性肝炎、肝硬化，然后肝細胞瘤發(fā)展的起始病毒感染。
診斷受乙型肝炎病毒的感染，通常從疾病患者的臨床主診開始，繼之以檢查妨礙患者代謝的生化試驗(轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素等)。在乙型肝炎病毒感染開始以后，產(chǎn)生對HBcAg、HBsAg和HBeAg的抗體，由此鑒定血液中的病毒抗原(包括病毒)(糞便等;1～6月;放射免疫測定〔RIA〕，酶連接的免疫吸附劑測定〔ELISA〕，免疫電泳法，血凝反應等)，或病毒特殊抗體的存在(例如用RIA、ELISA、免疫電泳法、血凝反應等鑒定早期免疫球蛋白M抗HBcAg〔2～8月〕;免疫球蛋白G抗HBeAg〔4～10個月〕和免疫球蛋白G抗HBcAg〔5～6月和終生〕，從而診斷乙型肝炎病毒的感染。
雖然細節(jié)并未肯定，可相信受納細胞中涉及到HBV的感染過程包括基因組從病毒衣殼組分中脫出，病毒DNA移位至細胞核，病毒DNA的合成使DNA基本上成圓形，在基因組中mRNA的轉(zhuǎn)錄和從病毒啟動子完全RNA復制，RNA移位至細胞質(zhì)，病毒蛋白物種從mRNA物種轉(zhuǎn)譯，以及從病毒RNA轉(zhuǎn)錄本的基因組DNA復制的蛋白首次接觸抗原(逆轉(zhuǎn)錄作用)。最后，形成病毒核心結(jié)構(gòu)，包括部分連接核心抗原(蛋白)基因組的雙股DNA形式。轉(zhuǎn)譯以后，HBsAg(和Pre-S2)的處理和移位至細胞表面，在細胞表面發(fā)生核心結(jié)構(gòu)的包膜。病毒從細胞表面釋放使其它細胞受感染。從包含22毫微米顆粒和絲狀形而缺乏病毒DNA但具有HBsAg的未成結(jié)構(gòu)的感染細胞的釋放，也發(fā)生在細胞表面。
乙型肝炎病毒表面抗原和相關的Pre-S2蛋白在診斷疾病中，可用作鑒別患者體液中誘發(fā)病毒抗體的抗原，或者用于產(chǎn)生為了鑒別患者或其它物質(zhì)中病毒抗原的參照抗體。HBsAg和Pre-S2蛋白也可用于預防由于接種的感染。
從活的病毒取得HBsAg和Pre-S2蛋白質(zhì)的現(xiàn)代方法存在著原料不足的不利因素，而任何生產(chǎn)的方法包括對感染的病毒的利用，由于存在著使生產(chǎn)工作者受感染的危險，以及活的病毒傳進所需要的產(chǎn)品中的可能性，所以可能是危險的?，F(xiàn)今采用的應用重組體DNA技術(shù)生產(chǎn)HBsAg和Pre-S2蛋白質(zhì)的方法包括原核細胞的轉(zhuǎn)化已經(jīng)證明不是特別有效的。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，應用以桿狀病毒為基礎的表達載體感染昆蟲或昆蟲細胞，可以很容易地生產(chǎn)出HBsAg和Pre-S2蛋白質(zhì)。
因此根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了生產(chǎn)多肽的一種方法，至少包括HBsAg或Pre-S2蛋白質(zhì)的一種抗原部分，這個方法包括在polyhedrin啟動子的表達控制下，用包括具有用于所說的多肽編碼的一個DNA片段的重組體桿狀病毒表達載體來感染敏感的昆蟲或昆蟲細胞。
本發(fā)明也包括這種重組體桿狀病毒本身。
這樣，本發(fā)明提供包括人體乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和由生長在昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細胞的重組體桿狀病毒合成相關的Pre-S2蛋白的產(chǎn)物。該重組體桿狀病毒可通過帶有傳染性桿狀病毒DNA的昆蟲培養(yǎng)細胞與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生，該質(zhì)粒含有構(gòu)建代表乙型肝炎病毒抗原和代替桿狀病毒多面體(polyhedrin)基因的起始端(5′)編碼序列的基因，但是要在殘余多面體(polyhedrin)啟動子的控制下。表達肝炎抗原的polyhedrin陰性病毒，存在于共轉(zhuǎn)染的子代中是傳染性的。當這些病毒生長于昆蟲或昆蟲培養(yǎng)細胞中時，開始可根據(jù)非表現(xiàn)型polyhedrin來選擇，接著用以表達乙型肝炎抗原。大多數(shù)肝炎抗原由像顆粒的重組體病毒感染細胞分泌，在血清學上和結(jié)構(gòu)上都像22毫微米乙型肝炎顆粒。它們可以用常規(guī)方法如差速離心或平衡梯度離心法和色譜法，從昆蟲提取液或昆蟲培養(yǎng)細胞上清液提純。
昆蟲細胞可以分泌肝炎抗體這個事實，對已經(jīng)注意到過去未能從其他的重組體系統(tǒng)如由酵母細胞分泌抗原來說是十分驚奇的。再者，十分意外的是集中在類似22毫微米顆粒的顆粒中而發(fā)生在一種昆蟲或昆蟲細胞為基礎的系統(tǒng)中。
在本申請中，術(shù)語的定義如下質(zhì)粒(如通常用的pUC8)是含于用受納細胞(如細菌)復制所需序列的雙股DNA的染色體外序列。它是可以通過稱為轉(zhuǎn)化的方法引入細胞的一種復制子。
啟動子是能從連接啟動子的DNA序列(基因)轉(zhuǎn)錄信使核糖核酸(mRNA)的DNA序列。mRNA是某單股DNA的復制，mRNA可用來操縱DNA序列中蛋白質(zhì)的合成(轉(zhuǎn)譯)，通過能識別包括啟動子的DNA序列的RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄作用。
基因是一片借助其內(nèi)在序列(連接的或間斷的)，決定著氨基酸蛋白質(zhì)鏈合成的DNA。
感染是由遺傳物質(zhì)(以DNA形式或病毒)侵入受納細胞，繼而復制該物質(zhì)。在通過病毒或代表病毒的DNA感染的情況下，可從傳染性子代病毒的那些細胞中得到結(jié)果。
轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染涉及將遺傳物質(zhì)如一種或多種DNA引入細胞的實驗方法，使DNA能感染細胞。凡DNA是共線性的，存在發(fā)生重組(交換)過程的可能性?？捎冒◣в刑厥恹}類(通常為有磷酸鹽、硫酸葡聚糖等參加的氯化鈣)沉淀DNA和把生成的混合物用于含有某些DNA的細胞等方法進行轉(zhuǎn)染。
參照附圖更詳細介紹本發(fā)明的HBsAg和Pre-S2的產(chǎn)生圖1圖2表示構(gòu)建本發(fā)明第一重組體轉(zhuǎn)移載體的方法。
圖3表示構(gòu)建本發(fā)明第二重組體轉(zhuǎn)移載體的方法。
圖4(a)圖4(b)表示在用本發(fā)明重組體桿狀病毒感染的昆蟲細胞培養(yǎng)物上清液進行放射免疫測定的結(jié)果。
圖5表示從HBV感染患者的血液中分離確實為22毫微米顆粒與上述這種上清液的顯微攝影對比。
圖6表示通過本發(fā)明重組體桿狀病毒感染的昆蟲細胞隨時間而變化的HBV抗原的產(chǎn)生。
按下述進行本發(fā)明重組桿狀病毒的構(gòu)建從患者血液中分離乙型肝炎病毒(adw亞類)的DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HI將DNA消化成特殊碎片(見BN Fields編的“Virology”，Raven Press，NW 1392頁圖5)。限制性內(nèi)切酶識別DNA的特殊核苷酸序列，在或鄰近那些序列處催化水解。根據(jù)酶的特異性，生成的產(chǎn)物都有“鈍”端，其中每個衍生的DNA片段的兩個DNA鏈都是等長的，在切割位點都不重疊，也不具有一個單鏈長于另一個鏈的“粘性”末端，由限制性內(nèi)切酶消化的產(chǎn)物最容易用具有互補“粘性”末端的其它酶(連接酶)重連接(例如被連接的Bam HI消化DNA產(chǎn)物一起回復或回復到Bam HI消化另一個DNA的產(chǎn)物)。當DNA片段是有“鈍”端時，連接還是可能的。
用Bam HI限制性內(nèi)切酶消化的HBV DNA產(chǎn)生約1400 HBV DNA堿基對的片段，該堿基對包圍(見圖1，圖2，L單鏈順時針方向5′至3′)“Pre-S2”區(qū)的附加部分、所有HBsAg ORF-2編碼序列和鄰近3′序列。大量必需的HBV序列轉(zhuǎn)移后，可按下述進行基因的重新構(gòu)建。
將含HBsAg序列的Bam HI衍生片段連接到細菌質(zhì)粒pUc8的Bam HI位點(圖1，圖2)，該pUc8質(zhì)粒在特定細菌細胞中復制，并在外來序列如HBV DNA序列插入后，重組體pUc8質(zhì)粒可以被復制、克隆和選擇。重組體pUc8-HBs可用這些方法衍生，即分離并用Bam HI消化它的DNA，然后回收含大量HBsAg基因的Acc I和生成的DNA大片段(圖1，圖2)。將該片段連接到合成寡核苷酸序列，正確地構(gòu)建HBsAg轉(zhuǎn)譯終止序列，提供連續(xù)處理的限制位點(如Bam HI位點)，以及提供代表切割Hind Ⅲ序列的末端序列(“粘性”末端)。這種連接之后，這些產(chǎn)物重新連接到預先用Bam HI和Hind Ⅲ(圖1，圖2)消化的pUc8質(zhì)粒，導致形成和回收重組體質(zhì)粒pHBsYK2。這種重組體質(zhì)粒的DNA用Bam HI消化，分離含HBV序列的片段，并將其連接到以pAcRP6表示的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。在連接前，轉(zhuǎn)移載體pAcRP6用Bam HI切割。在細菌中克隆后，得到以pAcRP6-HBsYK14表示的重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體(圖1，圖2)。轉(zhuǎn)移載體pAcRP6-HBsYK14保存在美國典型菌種保藏委員會，登記號為ATCC 67203(1986年9月12日)。
由Possee(5Virus Research 43頁，1986年)，Matsuura等67J.Gen.Virol 67期1515頁，1986年)介紹pAcRP質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體的來源。質(zhì)粒pAcRP6類似于由Smith、Summers和Fraser(Mol.and Cell.Biol.1983年3卷No.12，2150～2165頁)所介紹的從Autographa Californica核多面體病毒(AcNPV)衍生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體，具有合成寡核苷酸短“聯(lián)結(jié)子”序列，含有Bam HI限制性內(nèi)切酶識別位點代替polyhedrin基因殘基-8～+175。其原始polygedrin ATG密碼子計作+1至+3(參見Hooft van Iddekinge，Smith和Summers 131 Virology 561頁，1983年)。該Bam HI位點只是在通過Bam HI酶可以在該位點上完全消化的質(zhì)粒中的Bam HI位點。此外，可用桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。還可構(gòu)建pAcRP6質(zhì)粒衍生物，其中，放置合成Bam HI-Sma I-Bam HI短結(jié)合器序列代替Bam HI聯(lián)結(jié)子，可以在它們唯一Sma I位點消化質(zhì)粒。
pAcRP6-HBsYK14重組體轉(zhuǎn)移載體用于Spodoptera frugiperda昆蟲細胞與從AcNPV分離的傳染性DNA共轉(zhuǎn)染。從共轉(zhuǎn)染、重組體、polyhedrin-negative的子代病毒中，通過感染細胞的克隆中缺乏肉眼可見的polyhedra來鑒定和回收這些病毒，并將空斑克隆在S.frugiperda培養(yǎng)細胞中。重組體病毒如AcNPV-HBsYK14用來表達昆蟲和昆蟲培養(yǎng)細胞中的HBsAg。為了測定HBV抗原用感染的昆蟲培養(yǎng)細胞上清液，從1/1連續(xù)稀釋至1/64，對125I示蹤的抗HBV進行放射免疫測定。結(jié)果示于圖4，由此可見稀釋和結(jié)合抗體之間存在線性關系。
對細胞上清液(ⅰ)、凈化的細胞上清液(ⅱ)、20x濃縮的細胞上清液(ⅲ)和含真實的22毫微米顆粒的血清(ⅳ)，進行顯微鏡檢查(圖5)，結(jié)果證明用本發(fā)明的重組體轉(zhuǎn)移載體感染的昆蟲細胞產(chǎn)生的顆粒與22毫微米HBV抗原難以區(qū)分。
用重組體病毒AcNPV-HBsYK14和起始(未轉(zhuǎn)換)病毒AcPNV感染昆蟲細胞，對每一種病毒，測量隨時間變化的HBV抗原的產(chǎn)生，可以看到只有轉(zhuǎn)換載體得到陽性的測定結(jié)果。
據(jù)證明Pre-S2對提高HBsAg的免疫性是重要的，為此構(gòu)建第二重組體轉(zhuǎn)移載體，這種載體含有HBsAg和整個必需的上游Pre-S2序列。將代表在pHBsYK2質(zhì)粒DNA中缺少Pre-S2上游序列的合成寡核苷酸連接至含從pHBsYK2 DNA回收的HBV序列的Bam HI衍生片段的兩端。除了連續(xù)操作所需的限制性內(nèi)切酶序列(例如Xho I)和用于合成Pre-S2蛋白的ATG轉(zhuǎn)譯起始密碼子以外，寡核苷酸具有適當末端序列可使“粘性”末端連接到Bam HI衍生DNA的末端(見圖3)。然后將寡核苷酸的連接產(chǎn)物和Bam HI衍生pHBsYK2片段連接到質(zhì)粒PJM119和重組體質(zhì)粒，該重組體質(zhì)粒含有回收的寡核苷酸序列，并用序列分析證明(圖4，PJM119-PsSYK25)，具有HBsAg序列的55個氨基酸Pre-S2上游的整個編碼區(qū)，并在3′末端相反方向具有重復的寡核苷酸序列(超出HBsAg基因的TAA轉(zhuǎn)譯終端密碼子的范圍)。質(zhì)粒PJM119-PsSYK25的DNA用Xho I消化，通過用DNA聚合酶的克列諾夫片段和適宜的脫氧核糖核苷三磷酸鹽處理，末端成為鈍端，將產(chǎn)物連接到含有唯一Sma I位點的pAcRP6轉(zhuǎn)移載體。得到圖3所示的帶有基因排列的重組體(pAcRP6-PsSYK27)。
上述pAcRP6-PsSYK27重組體轉(zhuǎn)移載體用于Spodoptera frugiperda昆蟲細胞及從AcNPV分離得到的傳染性DNA的共轉(zhuǎn)染。從這些共轉(zhuǎn)染、重組體、polyhedrin陰性的子代病毒中，鑒定這些病毒，將空班克隆到培養(yǎng)的S.frugiperda細胞中。重組體病毒用于表達昆蟲和昆蟲培養(yǎng)細胞中的Pre-S2 HBsAg。
涉及本文的重組體載體和轉(zhuǎn)化的病毒已經(jīng)另外儲存以美國形式培養(yǎng)收集如下(1)E.coli MC1061(pAcRP6-HBsYK14)-ATCC 67220(2)E.coli MC1061(pAcRP6-PsSYK27)-ATCC 67221(上述兩者于1986年9月25日保存)(3)A.californica AcNPV-PsSYK27(4)A.californica AcNPV-HBsYK14-VR 2158(上述兩者于1986年12月30日保存)
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)至少含有一種HBsAg或Pre-S2蛋白質(zhì)的抗原部分的多肽的方法，該方法包括用一種含有重組體桿狀病毒的表達載體，在一種polyhedrin啟動子的表達控制下，感染敏感的昆蟲或昆蟲細胞，所說的重組體桿狀病毒具有用于上述多肽編碼的一種DNA片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中重組體桿狀病毒具有Polyhedrin-非表現(xiàn)型(negative phenotype)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2的方法，其中重組體桿狀病毒是從Autographa californica核多角體病毒衍生出的重組體桿狀病毒。
4.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求
的方法，其中表達載體是由含有所說的DNA片段和所說的桿狀病毒的感染性DNA的重組體轉(zhuǎn)移載體的重組作用而形成的。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4的方法，其中所說的重組作用是由用含有所說的DNA片段和所說的桿狀病毒的感染性DNA的重組體轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染敏感的昆蟲或細胞來進行的。
6.根據(jù)上述的任何一項權(quán)利要求
的方法，其中所說的DNA片段含有Bam HI插入的轉(zhuǎn)移載體pAcRP6-HBsYK14(ATCC 67203)。
7.一種重組體桿狀病毒，具有至少為HBsAg或Pre-S2蛋白質(zhì)的一種抗原部份編碼的DNA片段。
8.一種能夠在細菌中繁殖并適應于應用桿狀病毒重組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，所說的桿狀病毒具有用于至少一種HBsAg或Pre-S2蛋白質(zhì)的抗原部份編碼的DNA片段。
專利摘要
本發(fā)明介紹在昆蟲和昆蟲培養(yǎng)細胞中，人體乙型肝炎病毒(HBV)抗原的表達。用重組體桿狀病毒感染受納昆蟲和受納細胞。在桿狀病毒polyhedrin基因啟動子的控制下，重組體桿狀病毒具有必需的插入桿狀病毒基因組的人體HBV基因，并代替病毒polyhedrin蛋白的起始(5′)編碼順序。
文檔編號C12N15/866GK87106266SQ87106266
公開日1988年6月29日 申請日期1987年9月8日
發(fā)明者戴維·H·L·畢曉普, 康賜永 申請人:戴維·H·L·畢曉普, 康賜永導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan