專利名稱：一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測(cè)方法，用于檢測(cè)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn) 體Al基因ABCA1、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的 變異，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
脂類物質(zhì)具有重要的生物功能，脂肪是體內(nèi)的一種主要能量來(lái)源，但脂肪攝入過 量而運(yùn)動(dòng)量又過少將產(chǎn)生肥胖，并導(dǎo)致一些慢性病的發(fā)生；膳食脂肪總量增加，還會(huì)增大某 些癌癥的發(fā)生幾率。因此有意識(shí)地控制脂肪攝入和積極從事體力或體育活動(dòng)，以消耗攝入 多余的熱量，避免過多的脂肪在體內(nèi)積存。ABCAl 為 ATP-binding cassette transporterAl，abcal (三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn) 體Al)蛋白編碼基因，它以ATP為能源，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇逆 轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)和HDL生成的起始步驟中起重要作用，被稱作RCT守門人。核受體PPARs、LXRs 和FXR對(duì)abcal蛋白的表達(dá)具有調(diào)控作用。ABCAl功能障礙將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)大量的膽固 醇沉積而成為泡沫細(xì)胞，繼而浸潤(rùn)血管壁，促進(jìn)冠心病的發(fā)生發(fā)展。
ABCAl在機(jī)體中最重要的作用是對(duì)高密度脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。高密度脂蛋白是機(jī)體重 要的抵抗心腦血管疾病的大分子，它可以將機(jī)體多余的膽固醇從外周細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)入肝臟內(nèi)， 同時(shí)也可以保護(hù)低密度脂蛋白不受氧化損傷的影響，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞上粘性大分子的表 達(dá)，組織單核分子進(jìn)入血管壁。而ABCAl對(duì)于肝臟內(nèi)和外周細(xì)胞內(nèi)的膽固醇水平可以進(jìn)行 調(diào)節(jié)，主要通過將多余的膽固醇從外周細(xì)胞泵出，與乏脂蛋白apoA-I結(jié)合形成初始狀態(tài)的 高密度脂蛋白，而初始狀態(tài)的高密度脂蛋白通過膽固醇磷酸?；蔀槟懽痛妓嶂闹?應(yīng)轉(zhuǎn)化為成熟的α高密度脂蛋白。決定血清內(nèi)α高密度脂蛋白含量的幾個(gè)因素包括肝臟 內(nèi)ABCAl轉(zhuǎn)運(yùn)酶和apoA-I的含量以及乏脂蛋白apoA-I的含量。ADIPOQ 為 adiponectin，ClQ and collagen domain containing(脂聯(lián)蛋白的 ClQ 和膠原結(jié)構(gòu)域)編碼基因，它編碼一種在結(jié)構(gòu)上與膠原X和VIII以及補(bǔ)體Clq類似的蛋白 質(zhì)。這種基因主要在脂肪組織中表達(dá)，所編碼的蛋白質(zhì)在血液中循環(huán)，并且和代謝以及激素 產(chǎn)生過程有關(guān)。它的突變或異常表達(dá)等都會(huì)引起胰島素等代謝綜合癥。LPL基因編碼脂蛋白脂酶，該酶在心臟、肌肉和脂肪組織中進(jìn)行表達(dá)。LPL以同型 二聚體蛋白的形式行使功能，其分子生物學(xué)的作用包括兩部分，一部分為甘油三脂的水解 酶作用，另一部分則是受體介導(dǎo)的脂蛋白內(nèi)吞作用的橋梁。LPL蛋白上的位點(diǎn)突變?cè)趪?yán)重的 情況下可以導(dǎo)致I型高脂蛋白血癥，而較輕程度上則引起體內(nèi)脂蛋白代謝的紊亂。大樣本量中國(guó)人群研究證實(shí)，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因ABCAl、脂聯(lián)蛋白的ClQ和 膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的變異在中國(guó)人群眾普遍存在。以往 的檢測(cè)方法在對(duì)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因ABCA1、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因 ADIPOQ和脂蛋白脂酶(LPL)基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)的假陽(yáng)性現(xiàn)象無(wú)法很好的排查和解釋。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種準(zhǔn)確率高的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測(cè)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢 測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為第一步、檢測(cè)的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測(cè)者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細(xì)胞樣本；第二步、基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個(gè)被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時(shí)間為 2-2. 5小時(shí)，經(jīng)電泳檢測(cè)后，肉眼可見清晰白色條帶即進(jìn)入下一步檢測(cè)；第三步、熒光定量PCR反應(yīng) 將每一個(gè)被測(cè)者樣本分別放入4個(gè)反應(yīng)孔，同時(shí)檢測(cè)4個(gè)位點(diǎn)，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn) 體Al基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基 因rs320和rs285，并增設(shè)2個(gè)不含DNA模板的NTC空白對(duì)照孔；在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入熒光定量PCR反應(yīng)體系，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為 10 μ 1，由2 μ 1濃度為20ng/ μ 1的被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA模板溶液、1μ 1 IOX 熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 1 μ 1濃度分別為25mM的合成DNA的四種脫氧核苷酸底物d NTP混合液、0. 5 μ 1濃度為25mM的氯化鎂溶液、0. 02 μ 1濃度為5units/ μ 1的Taq DNA聚 合酶溶液、5. 43 μ 1去離子水、0. 225 μ 1濃度為20 μ M的正向引物溶液、0. 225 μ 1濃度為 20 μ M的反向引物溶液、0. 25 μ 1濃度為10 μ M的VIC熒光探針溶液和0. 25 μ 1濃度為10 μ M 的FAM熒光探針溶液組成，其中，4個(gè)位點(diǎn)的正向引物、反向引物、帶VIC熒光探針以及帶 FAM熒光探針序列如下(1)、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 Al 基因 SEQ ID NOl :rs2230806 帶VIC 熒光 A 型探針ACCAAAGGAGAAACTG ；帶FAM 熒光 G 型探針ACCAAGGGAGAAACTG ；正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA；
反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG ；(2)、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NOl :rs2241766 帶VIC 熒光 G 型探針CGGGCATGACCAGG ；帶FAM 熒光 T 型探針CGGTCATGACCAGG ；正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；(3)、脂蛋白脂酶基因 SEQ ID NOl :rs320 帶VIC 熒光 G 型探針AAGCGTTTATACT ；帶FAM 熒光 T 型探針AAGCTTTTATACT ；正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；
反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT ；(4)、脂蛋白脂酶基因 SEQ ID NOl :rs285 帶VIC 熒光 C 型探針TTAGCAGCTGTGG ；帶FAM 熒光 T 型探針TTAGTAGCTGTGG ；
正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；將反應(yīng)孔和空白對(duì)照孔在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱50°C、2分鐘， 95°C、10分鐘，然后再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘，反應(yīng)結(jié)束，取出后再放入 熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的 ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四張圖；第四步、SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號(hào)的4個(gè)圖和NTC空白對(duì)照進(jìn)行比 較，每個(gè)位點(diǎn)存在三種不同的信號(hào)，純VIC熒光信號(hào)、VIC和FAM雜合熒光信號(hào)以及純FAM熒 光信號(hào)，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；(1)、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 Al 基因 rs2230806
在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為AA基因 型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為AG基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；(2)、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766 在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為TT基因 型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為GT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；(3)、脂蛋白脂酶基因rs320 在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為TT基因 型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為GT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；(4)、脂蛋白脂酶基因rs285 在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為CC基因 型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為TT基因型。本發(fā)明所需檢測(cè)的DNA可以利用口腔粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)行抽提獲得。采用口腔粘膜 上皮細(xì)胞采樣方法和器材進(jìn)行樣本采集。樣本的DNA抽提利用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì) 胞的DNA抽提并進(jìn)行DNA濃度和純度的測(cè)定。本發(fā)明4個(gè)位點(diǎn)的基因分型分別采用PCR技 術(shù)及TaqMan^MGB技術(shù)進(jìn)行分型。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，基因分型的準(zhǔn)確率達(dá)到了 99%以上，重 復(fù)性達(dá)到了 100%。本發(fā)明增加了一對(duì)內(nèi)參因物的設(shè)計(jì)避免了假陽(yáng)性現(xiàn)象，同時(shí)適用于大樣 本量的基因分型檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)準(zhǔn)確率高，可重復(fù)性強(qiáng)。


圖1為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因SEQ ID NOl :rs2230806基因分型圖；圖2為脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NOl :rs2241766基因分型圖。圖3為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs320基因分型圖；圖4為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs285基因分型圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測(cè)方法第一步、檢測(cè)的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測(cè)者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細(xì)胞樣本；第二步、基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個(gè)被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時(shí)間為2小 時(shí)，經(jīng)電泳檢測(cè)后，肉眼可見清晰白色條帶即進(jìn)入下一步檢測(cè)；第三步、熒光定量PCR反應(yīng)將每一個(gè)被測(cè)者樣本分別放入4個(gè)反應(yīng)孔，同時(shí)檢測(cè)4個(gè)位點(diǎn)，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn) 體Al基因( ABCAl) rs2230806、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ) rs2241766 和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320和rs285，并增設(shè)2個(gè)不含DNA模版的NTC空白對(duì)照孔；在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入熒光定量PCR反應(yīng)體系，其總體積為10μ 1，即2μ 1濃度為 20ng/ μ 1的被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA溶液、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖 液(ABI Master Mix)、0. 1 μ 1濃度分別為25mM的合成DNA的四種脫氧核苷酸底物d NTP 混合液、0. 5 μ 1濃度為25mM的氯化鎂溶液、0. 02 μ 1濃度為5units/ μ 1的Taq DNA聚合酶 (ΤIANGEN Taq DNA Polymerase)、5. 43 μ 1 去離子水、0. 225 μ 1 濃度為 20 μ M 的正向引物、 0. 225 μ 1濃度為20 μ M的反向引物、0. 25 μ 1濃度為10 μ M的VIC熒光探針和0. 25 μ 1濃 度為 ομ M的FAM熒光探針，其中，4個(gè)位點(diǎn)的正向引物、反向引物、帶VIC熒光探針以及帶 FAM熒光探針如下ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 Al 基因(ABCAl)SEQ ID NOl :rs2230806 帶VIC 熒光 A 型探針ACCAAaGGAGAAACTG帶FAM 熒光 G 型探針ACCAAgGGAGAAACTG正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ)SEQ ID NOl :rs2241766 帶VIC 熒光 G 型探針CGGgCATGACCAGG
帶 FAM 熒光 T 型探針CGGtCATGACCAGG正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NOl :rs320 帶VIC 熒光 G 型探針AAGCgTTTATACT帶FAM 熒光 T 型探針AAGCtTTTATACT正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NOl :rs285 帶VIC 熒光 C 型探針TTAGcAGCTGTGG
帶 FAM 熒光 T 型探針TTAGtAGCTGTGG正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA
將反應(yīng)孔和空白對(duì)照孔在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱50°C、2分鐘， 95°C、10分鐘，然后再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、1分鐘，反應(yīng)結(jié)束，取出后再放入 熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因(ABCAl) rs2230806、脂 聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ)rs2241766和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320 和rs285四張圖；第四步、SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號(hào)的4個(gè)圖和一個(gè)NTC空白對(duì)照進(jìn)行 比較，每個(gè)位點(diǎn)存在三種不同的信號(hào)，純VIC熒光信號(hào)、VIC和FAM雜合熒光信號(hào)以及純FAM 熒光信號(hào)，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；(1)、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體 Al 基因(ABCAl) rs2230806如圖1所示，為ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體Al基因SEQ ID NOl :rs2230806基因分型圖，坐 標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為AA基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為AG基因 型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)受檢樣本，根據(jù)點(diǎn)所處的區(qū)域和 位置和顏色可以進(jìn)行基因型判斷。
(2)、脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因(ADIPOQ)rs2241766如圖2所示，為脂聯(lián)蛋白的ClQ和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NOl :rs2241766基 因分型圖，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為TT基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū) 域點(diǎn)為GT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)受檢樣本，根據(jù)點(diǎn) 所處的區(qū)域和位置和顏色可以進(jìn)行基因型判斷。(3)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320 如圖3所示，為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs320基因分型圖，坐標(biāo)軸左下區(qū)域 點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為TT基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為GT基因型、坐標(biāo)軸右 下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)受檢樣本，根據(jù)點(diǎn)所處的區(qū)域和位置和顏色可 以進(jìn)行基因型判斷。(4)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs285 如圖4所示，為脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs285基因分型圖，坐標(biāo)軸左下區(qū)域 點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為CC基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右 下區(qū)域點(diǎn)為TT基因型。圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)受檢樣本，根據(jù)點(diǎn)所處的區(qū)域和位置和顏色可 以進(jìn)行基因型判斷。
權(quán)利要求
一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為第一步、檢測(cè)的樣品類型與采樣方法用采樣拭刮被測(cè)者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細(xì)胞樣本；第二步、基因組DNA的抽提方法采用硅膠吸附法抽提每一個(gè)被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時(shí)間為2-2.5小時(shí)，經(jīng)電泳檢測(cè)后，肉眼可見清晰白色條帶即進(jìn)入下一步檢測(cè)；第三步、熒光定量PCR反應(yīng)將每一個(gè)被測(cè)者樣本分別放入4個(gè)反應(yīng)孔，同時(shí)檢測(cè)4個(gè)位點(diǎn)，即ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285，并增設(shè)2個(gè)不含DNA模板的NTC空白對(duì)照孔；在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入熒光定量PCR反應(yīng)體系，所述PCR反應(yīng)體系的總體積為10μl，由2μl濃度為20ng/μl的被測(cè)者口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA模板溶液、1μl 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.1μl濃度分別為25mM的用于合成DNA的四種脫氧核苷酸底物d NTP混合液、0.5μl濃度為25mM的氯化鎂溶液、0.02μl濃度為5units/μl的Taq DNA聚合酶溶液、5.43μl去離子水、0.225μl濃度為20μM的正向引物溶液、0.225μl濃度為20μM的反向引物溶液、0.25μl濃度為10μM的VIC熒光探針溶液和0.25μl濃度為10μM的FAM熒光探針溶液組成，其中，4個(gè)位點(diǎn)的正向引物、反向引物、帶VIC熒光探針以及帶FAM熒光探針序列如下(1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因SEQ ID NO1rs2230806帶VIC熒光A型探針ACCAAAGGAGAAACTG；帶FAM熒光G型探針ACCAAGGGAGAAACTG；正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA；反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG；(2)、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因SEQ ID NO1rs2241766帶VIC熒光G型探針CGGGCATGACCAGG；帶FAM熒光T型探針CGGTCATGACCAGG；正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；(3)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1rs320帶VIC熒光G型探針AAGCGTTTATACT；帶FAM熒光T型探針AAGCTTTTATACT；正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT；(4)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1rs285帶VIC熒光C型探針TTAGCAGCTGTGG；帶FAM熒光T型探針TTAGTAGCTGTGG；正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；將反應(yīng)孔和空白對(duì)照孔在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘，反應(yīng)結(jié)束，取出后再放入熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因rs2230806、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四張圖；第四步、SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號(hào)的4個(gè)圖和一個(gè)NTC空白對(duì)照進(jìn)行比較，每個(gè)位點(diǎn)存在三種不同的信號(hào)，純VIC熒光信號(hào)、VIC和FAM雜合熒光信號(hào)以及純FAM熒光信號(hào)，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；(1)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1基因rs2230806在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為AA基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為AG基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；(2)、脂聯(lián)蛋白的C1Q和膠原結(jié)構(gòu)域編碼基因rs2241766在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為TT基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為GT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；(3)、脂蛋白脂酶基因rs320在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為TT基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為GT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為GG基因型；(4)、脂蛋白脂酶基因rs285在檢測(cè)結(jié)果圖中，坐標(biāo)軸左下區(qū)域點(diǎn)為空白對(duì)照、坐標(biāo)軸左上區(qū)域點(diǎn)為CC基因型、坐標(biāo)軸右上區(qū)域點(diǎn)為CT基因型、坐標(biāo)軸右下區(qū)域點(diǎn)為TT基因型。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的基因型檢測(cè)方法，其特征在于，具體步驟為檢測(cè)的樣品類型與采樣方法基因組DNA的抽提方法；熒光定量PCR反應(yīng)；以及SNP基因型分析。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)準(zhǔn)確率高，可重復(fù)性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101845510SQ20101020500
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者傅詠南, 毛丹丹, 王校 申請(qǐng)人:上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司