專利名稱：：豬白色被毛純合基因型的檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于豬的分子生物學領域。具體地說，本發(fā)明涉及豬白色被毛基因型的純合性檢測方法。
背景技術：
：豬的毛色類型大體可以分為兩類全白色和非全白色，非全白色包括了野豬色、全黑色、全紅色、白底帶黑斑和黑色花斑等各種顏色。毛色都是由基因控制的，其中各基因的顯隱性關系是白色座位基因〉非白色座位基因(Spillmanetal.1906)，Wright在1918年提出豬的白毛色由兩個顯性基因控制的假說，Hetzer在1945年約克夏豬和長白豬)通常I基因是純合的(I/I)。有色品種如巴克夏豬、波中豬、大黑豬、杜洛克豬、皮特蘭豬以及有色的中國品種是隱性基因的純合體(i/i)。目前發(fā)現(xiàn)在I位點除了I和i等位基因外，還有r(Johanssonetal.1992)等其它等位基因，值得注意的是I等位基因對于其它等位基因是顯性的。KIT基因與I基因等位。豬的KIT基因由21個外顯子組成，整個編碼序列長2919bp。對編碼序列中2892bp的片段進行了克隆和RT-PCR產物測序發(fā)現(xiàn)該位點上存在至少三個等位基因i，r，i。它們的顯性等級為I〉T>i。等位基因I對應于完全顯性白毛色，分子結構上除帶有正常KIT基因(稱為KIT1)外，還攜帶含有兩種突變的全長KIT基因拷貝(稱為KIT2),突變之一發(fā)生在內含子18上，缺失四個堿基，導致KIT基因表達失調，稱為調節(jié)突變。另一突變發(fā)生在內含子17的第一個核苷酸位置上，導致G—A的剪接突變，剪接時忽略外顯子17，致使酪氨酸激酶活性受損，稱為結構突變。T等位基因表現(xiàn)為白色或有色毛的斑塊或斑點性狀，斑塊及斑點分界處明顯，無緩沖區(qū)帶。分子結構上既有正常KIT基因(KIT1)，還帶有一個完全一樣的KIT基因(KIT1)全長拷貝，該拷貝增加了KIT基因的表達量，從而影響肥大干細胞生長因子之配體的可利用性，擾亂黑色素細胞前體物的遷移與存活，產生斑塊或斑點表型。i等位基因僅攜帶一個正常KIT基因(KIT1)，黑色素細胞前體物能正常遷移與存活，表現(xiàn)出正常毛色。由于白毛色豬有吸收陽光中紫外線的能力強，抗佝僂病能力高，發(fā)病易從皮膚變化看出，乳腺無色素，胴體美觀，國際市場上受歡迎并且白毛色的豬較有色被毛豬的屠宰成本較低(Rothchildetal.1998)等優(yōu)點，國內養(yǎng)殖戶更傾向于飼養(yǎng)白色豬種。近年來，一些養(yǎng)殖戶從國外引進的以及已有的純白色豬種配種后后代也會出現(xiàn)黑斑，這是由于該純白色豬是等位基因I的非純合個體，因此由于等位基因I對于其它等位基因有顯性作用，其個體的毛色總是表現(xiàn)為純白色，掩蓋了該個體的真實遺傳背景，只有當該個體與其他等位基因I非純合個體交配后其后代才會在毛色表型中顯現(xiàn)出黑斑來。目前，還沒有一項針對該問題且能客觀方便快捷的解決方法。
發(fā)明內容本發(fā)明提供了一種豬白色背毛純合基因型的檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種豬白色被毛純合基因型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟-(1)獲取豬耳組織基因組DNA;(2)確定不同白色被毛基因型的差異；(3)豬白色被毛基因KIT第18內含子的PCR擴增；(4)白色被毛豬基因型I/I的純合性檢測。進一步地，所述步驟(3)具體為根據(jù)美國國立生物技術信息中心GenBank中的豬KIT基因第18內含子序列設計一對引物來體外擴增該突變區(qū)域序列，引物序列如下K18F:5'-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3';K18R:5'-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3'，用此引物以豬基因組DNA為模板進行PCR擴增。進一步地，所述步驟(4)具體為全白色被毛豬基因組DNA中得到的PCR擴增產物經溴化乙錠EB染色，在2.596瓊脂糖10V/cm水平電泳1.5小時后，能清晰看到預計大小為161bp和165bp的兩產物，凝膠成像系統(tǒng)拍照后利用系統(tǒng)自帶分析軟件分析每個個體兩產物的光密度強度并計算其比例，當165bp比161bp的比值達到0.9l范圍，可確定該個體為純合的白色基因型I/I個體，若該比值小于0.9，則可確定該個體為非純合白色基因型。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的豬白色被毛純合基因型快速檢測方法可用于不同被毛顏色豬的檢測，以及控制其后代被毛顏色。本發(fā)明有助于明確白色被毛豬的真實白色基因遺傳信息，為控制后代被毛顏色，固定白色被毛豬所具有的優(yōu)點提供技術支持，具有重要的生產意義。圖1為豬白色被毛基因的等位基因組合內含子組成示意圖；其中，A，1/1基因型；B，1/;T基因型；C，1/i基因型。圖2為白色與非白色被毛豬PCR產物瓊脂糖電泳圖；其中，M,pBR322DNA/BsuRIMarker;1，黑斑皮特蘭豬PCR產物結果；2-5，白色被毛豬PCR產物結果。圖3為基因型I/I純合性檢測示意圖；其中，A，不同個體PCR產物瓊脂糖電泳檢測；BC，分析每個泳道對應不同個體的兩內含子擴增產物光密度強度。具體實施方式本發(fā)明提供的豬白色背毛純合基因型的檢測方法，包括以下步驟1.豬耳組織基因組DNA獲取。2.確定不同白色被毛基因型的差異。根據(jù)
背景技術：
可知，豬全白色被毛純合基因型等位基因組合為I/I相當于2個KIT1和2個KIT2，即有兩個正常的18內含子和兩個缺失4堿基的18內含子，其比率應為1;豬全白色被毛非純合基因型中只有一個等位基因I相當于1個KIT1和1個KIT2，而另一個非I等位基因不會再帶有KIT2，因此這種個體KIT基因正常的18內含子和有4堿基缺失的18內含子的比率應該大于1(圖1)。3.豬白色被毛基因KIT第18內含子的PCR擴增。根據(jù)美國國立生物技術信息中心GenBank中的豬KIT基因第18內含子序列(登錄號X93082)設計了一對引物來體外擴增該突變區(qū)域序列，引物序列如下K18F:5'-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3';K18R:5'-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3'，用此引物以豬基因組DNA為模板進行PCR擴增，在全白色被毛豬基因組DNA中預計可得到161bp和165bp的兩個產物，而在非全白色被毛豬基因組DNA中預計只得到一個165bp的產物。在電泳過程中相對于全白被毛個體PCR的兩個產物，非全白色被毛豬基因組的PCR產物只有一個165bp條帶，它不受另外161bp條帶的阻礙而泳動的快一些，因此在電泳圖上其所處位置與非全白被毛豬PCR產物的161bp產物所在位置相當(圖2)。4.白色被毛豬基因型I/I的純合性檢測。全白色被毛豬基因組DNA中得到的PCR產物經溴化乙錠(EB)染色，在2.5%瓊脂糖10V/cm水平電泳1.5小時后，能清晰看到預計大小為161bp和165bp的兩產物，凝膠成像系統(tǒng)拍照后利用系統(tǒng)自帶分析軟件分析每個個體兩產物的光密度強度并計算其比例(圖3)，當165bp比,161bp的比值達到0.91范圍，可確定該個體為純合的白色基因型I/I個體，若該比值小于0.9則可確定該個體為非純合白色基因型。由于PCR的選擇性競爭，在白色被毛純合基因型個體的PCR擴增中，'由于長片段的正常18內含子拷貝數(shù)與短片段的4堿基缺失18內含子拷貝數(shù)相同，引物會稍稍偏向于結合短片段的4堿基缺失18內含子，因而165bp產物比161bp產物比值將會出現(xiàn)大于0.9接近于1的比率值。而在白色被毛非純合基因型個體的PCR擴增中，因為長片段的正常18內含子拷貝數(shù)是較短片段的4堿基缺失18內含子的數(shù)倍，所以引物會優(yōu)先結合到4堿基缺失18內含子序列上進行聚合酶鏈式反應，因此165bp產物比161bp產物比值將小于0.9。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例l實驗動物選取和個體基因組DNA提取在浙江大學動物實驗牧場隨機選取白色被毛約克夏豬后代12頭及對照純種白色被毛約克夏豬2頭和黑色花斑被毛皮特蘭豬2頭，采豬耳組織樣0.3克，用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取耳組織中基因組DNA，所得基因組DNA純度約在80%97%左右，TE溶解后稀釋到終濃度50ng/uL。實施例2豬白色被毛基因KIT第18內含子的PCR擴增用根據(jù)美國國立生物技術信息中心GenBank中的豬KIT基因第18內含子序列(登錄號:X93082)設計的引物(K18F:5'-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG-3';Kl服5'-ACTGGCATTCCGGGGTAG-3')，以豬基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增反應體系為15uL，反應體系組成為50ng基因組DNA，IXPCRbuffer,1.5,1/LMgCl2，0.2pmol/LdNTP和lUTaq酶，正反向引物各O.2umol/L。PCR反應條件為94。C預變性5min，然后進行程序為94。C變性40s，55。C復性40s，72。C延伸40s，30個循環(huán)，最后72。C延伸7min，4。C保存。實施例3基因型I/I的純合性檢測各個體PCR產物經溴化乙錠(EB)染色，在2.5%瓊脂糖10V/cm水平電泳1.5小時后，能清晰看到白色被毛豬都有預計大小為161bp和165bp的兩條帶，黑色花斑皮特蘭豬只有一條帶產物(圖2)。凝膠成像系統(tǒng)拍照后利用系統(tǒng)自帶分析軟件分析每個個體兩條帶的光密度強度并計算正常內含子產物比突變內含子產物比值(圖3)，根據(jù)白色被毛基因型I/I純合子的18內含子PCR產物165bp比161bp的比值應達到0.91范圍，得到具有白色被毛基因型I/I純合子個體4頭(與對照約克夏豬結果相當)，其余均為全白色被毛的基因型非純合子個體，如表1基因型I/I的純合性檢測結果示意表所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4雜交實驗及應用用該方法篩選出的全白色被毛基因I非純合子個體71與黑花斑皮特蘭交配，其后代出現(xiàn)了毛色分離現(xiàn)象，并且后代毛色表型白色仔豬與非白色仔豬數(shù)量比例約為l:l，符合孟德爾遺傳規(guī)律，進一步證實個體71是白色被毛基因I非純合子；同樣篩選出的全白色被毛的基因型I/I純合子個體4-18與57交配，其后代全是全白色被毛個體，這些個體采用本發(fā)明方法測定后均得到大于0.9的比值，如表2基因I純合子個體4-18與57交配的后代基因型I/I純合性檢測結果示意表所示，即這些個體均為白色被毛的基因型I/I純合子個體，我們還用該4-18個體與黑花斑皮特蘭交配，其后代均為全白色被毛個體，這些結果都進一步證實4-18確實是白色被毛的基因I純合子個體。這樣，我們就得到了具有白色被毛的基因型I/I純合子的個體，并且它們和任何顏色被毛的豬交配，其后代均為全白色。這就控制了后代被毛的顏色，固定了白色被毛個體所具有抗佝僂病能力高、發(fā)病易于從皮膚觀察、乳腺無色素、胴體美觀、屠宰成本低、養(yǎng)殖戶更傾向飼養(yǎng)和國際市場上受歡迎等優(yōu)點。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>最后，還需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。權利要求1.一種豬白色被毛純合基因型的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(1)獲取豬耳組織基因組DNA。(2)確定不同白色被毛基因型的差異。(3)豬白色被毛基因KIT第18內含子的PCR擴增。(4)白色被毛豬基因型I/I的純合性檢測。2.根據(jù)權利要求1所述的豬白色被毛純合基因型的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)具體為根據(jù)美國國立生物技術信息中心GenBank中的豬KIT基因第18內含子序列設計一對引物來體外擴增該突變區(qū)域序列，引物序列如下K18F:5,-TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGG—3';Kl服5'—ACTGGCATTCCGGGGTAG-3'，用此引物以豬基因組DNA為模板進行PCR擴增。3.根據(jù)權利要求1所述的豬白色被毛純合基因型的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)具體為全白色被毛豬基因組DNA中得到的PCR擴增產物經溴化乙錠EB染色，在2.59()瓊脂糖10V/cm水平電泳1.5小時后，能清晰看到預計大小為161bp和165bp的兩產物，凝膠成像系統(tǒng)拍照后利用系統(tǒng)自帶分析軟件分析每個個體兩產物的光密度強度并計算其比例，當165bp比161bp的比值達到0.91范圍，可確定該個體為純合的白色基因型I/I個體，若該比值小于0.9，則可確定該個體為非純合白色基因型。全文摘要本發(fā)明公開了一種豬白色被毛純合基因型的檢測方法，包括以下步驟豬耳組織基因組DNA獲取，確定不同白色被毛基因型的差異，豬白色被毛基因KIT第18內含子的PCR擴增，白色被毛豬基因型I/I的純合性檢測。本發(fā)明有助于明確白色被毛豬的真實白色基因遺傳信息，為控制后代被毛顏色，固定白色被毛豬所具有的優(yōu)點提供技術支持，具有重要的生產意義。文檔編號C12Q1/68GK101255478SQ20081006057公開日2008年9月3日申請日期2008年3月28日優(yōu)先權日2008年3月28日發(fā)明者徐寧迎,趙麗莉,趙曉楓,郭曉令申請人:浙江大學