谷子抗白粉病基因快速鑒定的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是借助于谷子測序全基因組序列，利用植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信 息學(xué)和候選基因策略等方法快速鑒定谷子白粉病基因，該專利主要涉及到谷子全基因組序 列的下載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進(jìn)而鑒定出白粉病基因，屬于植物生 物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷子（Setaria italica)原產(chǎn)于中國，是我國北方較為常見的農(nóng)作物之一。谷子 富含蛋白質(zhì)、維生素 B2、煙酸、鈣、鐵等營養(yǎng)成分。生產(chǎn)上谷子易受到真菌、細(xì)菌、病毒、昆蟲 等多種病害的侵害，其中谷子白粉病為谷子一種較為常見的真菌性病害。此類病害自幼苗 到抽穗均可以發(fā)病，主要危害谷子的葉片，也危害莖桿及穗子。病菌侵染時葉片上開始產(chǎn)生 黃色小點，而后擴大發(fā)展成圓形或橢圓形病斑，表面生有白色粉狀霉層。一般情況下部葉片 比上部葉片多，葉片背面比正面多，霉斑甚至可以覆蓋谷子全葉，這嚴(yán)重的影響到了谷子植 株的光合作用，使其正常新陳代謝受到干擾，造成早衰，產(chǎn)量受到損失。
[0003] 谷子白粉病發(fā)病流行的條件主要有兩個：一是大面積種植感病品種；二是擁有利 于白粉病菌適宜生存的環(huán)境條件。一般谷子種植密度偏大，田間濕度過大或出現(xiàn)植株倒伏 的地塊，發(fā)病往往較為嚴(yán)重。該病一般在7月上中旬至8月初出現(xiàn)發(fā)病中心，8月中旬后隨氣 溫逐漸回升，病株率迅速增加，在適宜的條件下導(dǎo)致大流行。出現(xiàn)病癥時，如果不及時控制 病害的蔓延，往往會給谷子的生產(chǎn)帶來極大的損失。生產(chǎn)上有許多防治此類病害發(fā)生的措 施，如合理密植、合理施肥，藥劑拌種、化學(xué)藥劑噴施等，但這些都不能從根本上解決問題， 選育抗病品種一直以來被認(rèn)為是根治此類病害最有效地方法。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展， 運用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行植物品種的改良已被應(yīng)用到農(nóng)作物的生產(chǎn)中，因此谷子抗病基因的獲 得對于谷子抗病遺傳育種及抗病機制的深入研究具有重要的意義。
[0004] MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發(fā)現(xiàn)ML0(Mildew resistance locus 2)基因?qū)Π追鄄】剐允鞘加?937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集 了很多品種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌（Blumeria graminis f.sp.hordei)所有 己知的生理小種都具有高效抗性。進(jìn)一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以 使大麥對幾乎所有己知大麥白粉病菌的生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發(fā)現(xiàn) 很多植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根 等等。因此挖掘植物中的MLO型抗病基因?qū)χ参锟拱追鄄∮N具有重要的作用。
[0005] 目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等方法。但是由于谷 子的基礎(chǔ)研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時間長而且很難準(zhǔn)確地克隆這些基因。因 此，如何快速鑒定谷子中的MLO型抗病基因?qū)⒊蔀楣茸涌拱追鄄∮N的重要前提。
[0006] 植物比較基因組學(xué)（Comparative Genomics)是基于基因組測序基礎(chǔ)上，對已知的 基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式植 物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆其他植物基因，揭示 基因功能和分子機制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。本專利所采用的方法及思 路：模式植物擬南芥基因組研究已經(jīng)揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上的同源 性克隆谷子MLO型抗病基因，根據(jù)模式植物擬南芥實驗系統(tǒng)上的優(yōu)越性和已知MLO型抗病 基因的特點，快速"捕捉"谷子抗白粉病基因。本專利介紹了以谷子全基因組序列為前提， 結(jié)合比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和候選基因策略等知識，快速挖掘白粉 病基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過結(jié)合植物比較基因組學(xué)、植物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和 生物信息學(xué)等知識，快速挖掘谷子抗白粉病基因。其結(jié)果一方面可用于谷子白粉病基因緊 密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據(jù)。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 主要原理：第一個植物抗白粉病基因（MLO)是從大麥中克隆的，研究發(fā)現(xiàn)此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數(shù)NBS(nucleotide-binding site)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實MLO 型抗病基因已經(jīng)成為植物特有的一類抗白粉病基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物MLO類型基因是一 個基因家族；而且對來源于不同物種的MLO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。谷子基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經(jīng)測序的谷子全基因組中MLO基因家族和已經(jīng)克隆的MLO白粉病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系以及對于維持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定谷子白粉病基因。
[0011] 主要步驟如下：
[0012] 1)谷子全基因組序列的下載及其MLO型基因的采集
[0013] 首先從谷子測序基因組數(shù)據(jù)庫（http ://www. phytozome. net/search. php)下載 谷子全基因組序列；使用"DNAT00LS"軟件對獲得的谷子全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)建立數(shù) 據(jù)庫，然后用 pram數(shù)據(jù)庫（蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http ://pfamjanelia. org/search/sequence) 中的隱馬爾可夫模型（HMM)對MLO結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的谷子全基因組氨基酸序 列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp (E-Value=O. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用已 經(jīng)公布的MLO型基因序列，對谷子基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，獲得候選基因序列。
[0014] 2)谷子MLO型基因家族的鑒定
[0015] 將上述結(jié)果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pram(E-Value=LO)進(jìn)行 分析，去除無'ML0'結(jié)構(gòu)域的基因序列（圖1)。再將抗病基因序列通過MEGA3. 1軟件提供 的ClustalW工具（多序列比對程序）進(jìn)行多序列比對，去除重復(fù)序列。
[0016] 3)通過植物MLO型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定谷子MLO型白粉病基因
[0017] 由于先前的研究已經(jīng)證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統(tǒng) 發(fā)育樹同一區(qū)組，因此在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和谷子MLO型基因一起聚類分析，以獲得谷子抗白粉病基因 (圖 2)。
[0018] 4)谷子白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對
[0019] 利用BioXM2. 6軟件將谷子MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的MLO 白粉病基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成Fasta格式的文件，將這些文件導(dǎo)入BioEdit7. 0軟件，運 用此軟件中Clustal軟件進(jìn)行多序列比對，揭示白粉病基因重要氨基酸殘基及區(qū)域的保守 性。從而進(jìn)一步鑒定谷子的白粉病基因（圖3)。
[0020] 本發(fā)明的積極效果：
[0021] 1)縮短了谷子白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規(guī)方 法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本 發(fā)明基于植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)方法快速挖掘谷子白粉病基因，不僅可以 縮短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0022] 2)谷子（Setaria italica)是重要作物之一。由于谷子遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源 多樣性低，因此通過常規(guī)的分子標(biāo)記（RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鑒定谷子白粉病基因比較 困難。通過鑒定的白粉病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記（SNP、SCAR等），可以快速的 用于抗病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種年限，提高 育種效率。
[0023] 3)為闡述谷子抗白粉病分子機制奠定了基礎(chǔ)。谷子抗白粉病基因的鑒定，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)等研究 抗白粉病的分子機制提供了基因資源，有利于快速闡述谷子抗白粉病的作用機理。
【附圖說明】
[0024] 圖1谷子MLO基因的鑒定；
[0025] 本圖顯示的是12個MLO型基因鑒定結(jié)果，每一個基因都含有一個' ML0'保守結(jié)構(gòu) 域。
[0026] 圖2植物MLO基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析及其谷子MLO型白粉病基因的鑒定；
[0027] 擬南芥是植物科學(xué)研究的模式植物，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥的15個MLO型 基因（其中3個基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SMLO)、大麥白粉病基因 （HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和 谷子MLO型基因聚類分析。共鑒定出1個谷子MLO型白粉病基因。圖中斜體標(biāo)記的基因就 是谷子白粉病基因。
[0028] 圖3谷子MLO型白粉病基因的比對分析；
[0029] 1個谷子白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)進(jìn)行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區(qū)域的保守型。圖中TM1-TM7表示谷子MLO型白粉病基因的7個轉(zhuǎn)模區(qū)域；黑色圓點表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)；I和II表示對白粉菌侵染 重要的氨基酸區(qū)域。
【具體實施方式】
[0030] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出谷子白粉病基因。具體實施過程如下：
[0031] 1)谷子MLO型基因的采集
[0032] 為了獲得谷子全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、辣椒、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構(gòu)建HMM模型，從谷子基因組序 列中檢索MLO型基因；其次以不同作物中已經(jīng)發(fā)表的MLO基因序列作為靶序列（來自DFCI 數(shù)據(jù)庫：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC31594