專利名稱：：多態(tài)性位點基因型預(yù)測抑郁癥及藥效的用途、方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及5羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(5-HTT)基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抑郁癥患病程度、抗抑郁藥藥效的用途。本發(fā)明還涉及一種通過測定5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型，預(yù)測抑郁癥患病程度、抗抑郁藥藥效的方法和試劑盒。本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：抑郁癥(Majord印ression)是以情緒低落、快感缺乏和興趣喪失等精神心理癥候群為主要表現(xiàn)并伴有其他心理和軀體癥狀的情感障礙。抑郁癥的臨床表現(xiàn)差異很大，其主要的臨床表現(xiàn)可以分為核心癥狀和伴隨癥狀(心理癥狀群和軀體癥狀群)兩大類。抑郁的核心癥狀包括心境或情緒低落，興趣缺乏以及樂趣喪失，這是抑郁的關(guān)鍵癥狀。其中，情緒低落是指病人體驗到情緒低、悲傷；興趣缺乏是指病人對各種以前喜愛的活動缺乏樂趣；樂趣喪失是指病人無法從生活中體驗到樂趣，或曰快感缺失(anhedonia)。以上三種主征是相互聯(lián)系的，可以同時出現(xiàn)或只以其中某一、二種突出。絕大多數(shù)抑郁癥病人伴隨有明顯的焦慮癥狀和睡眠障礙等，有時也能成為患者突出的主訴。焦慮癥狀表現(xiàn)為主觀焦慮和軀體焦慮兩種類型。主觀的焦慮顯示為焦慮情緒、緊張、害怕、恐懼、對未來的莫名的擔(dān)憂等；軀體焦慮顯示為心悸、氣短、出汗、口干、尿頻等癥狀。嚴(yán)重焦慮的病人可以表現(xiàn)出激越、易怒、無原因的發(fā)火，甚至出現(xiàn)傷人、自傷等行為。焦慮的癥狀常常與睡眠障礙相關(guān)聯(lián)，主要表現(xiàn)為入睡困難和睡眠感的缺失。抑郁癥狀和焦慮癥狀常常合并存在，并與睡眠障礙一起成為構(gòu)成抑郁癥狀群的常見癥狀。抑郁癥的發(fā)病機理尚不清楚，目前認(rèn)為單胺(包括兒茶酚胺和5羥色胺等)類物質(zhì)在其中發(fā)揮重要作用。5-羥色胺(5-HT)水平或功能改變與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展存在密切的關(guān)系。位于5-HT神經(jīng)元的突觸前膜上的5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(5-hydroxytryptaminetransporter,5-HTT)在5-HT系統(tǒng)中起著重要的作用(MeyerJ"H，HouleS，SagratiS.etal.Brainserotonintransporterbindingpotentialmeasuredwithcarbonll-labeledDASBpositronemission"tomography:effectsofmajordepressiveepisodesandseverityofdysfunctionalattitudes.ArchGenPsychiatry.2004:61:1271-9)。5-HTT與突觸間隙中的5-HT結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運到神經(jīng)元的軸突末端。神經(jīng)刺激后5-HTT調(diào)節(jié)5-HT快速去除和5-HT釋放循環(huán)。5—HTT位于神經(jīng)末梢突觸前膜，接近中腦、腦干中縫核的5-HT神經(jīng)元樹突及其投射區(qū)域，如下丘腦，邊緣系統(tǒng)，基底節(jié)和大腦皮層，特別是前額葉，有12個疏水跨膜(TM)區(qū)域。人類5-HTT基因名稱為SCL6A4(溶質(zhì)載體家族6即神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，成員4，solutecarrierfamily6，member4)，位于17ql1.1-17ql2，跨越37.8kbp，包括14個外顯子，編碼630個氨基酸的蛋白。5-HTT基因的轉(zhuǎn)錄活性由位于轉(zhuǎn)錄起始點上游的1.4kb5'區(qū)域命名為5-羥色胺T啟動子區(qū)(5-HTTLPR)進(jìn)行調(diào)節(jié)的，由44bp插入和缺失形成7和s兩種等位基因。在非翻譯區(qū)域有三個變異1位于5-HTTLPR和轉(zhuǎn)錄起始位點間的380bp缺失，在體內(nèi)不穩(wěn)定，可能涉及5-HTTLPR依賴機制。2VNTR(可變數(shù)目串連重復(fù))位于第2內(nèi)含子區(qū)域的可變數(shù)目的串連重復(fù)。33'UTR區(qū)域的腺苷酸位點G-T的顛換。抑郁癥是多基因遺傳疾病，具有很高的生物學(xué)異源性。長期以來對于抑郁癥的診治幾乎完全憑借醫(yī)生的臨床經(jīng)驗，主觀性強、缺乏客觀的生物學(xué)標(biāo)志，使抑郁癥的診斷治療水平落后于其他軀體疾病。同時，常規(guī)抗抑郁藥治療僅約1/2—2/3的患者有臨床療效，能夠達(dá)到臨床緩解的更低至1/3—1/2，并且抗抑郁藥物臨床起效慢，通常服藥4一6周后才能充分發(fā)揮抗抑郁效果(BermanRM,NarasimhanM,CharneyDS:Treatment-refractorydepression:definitionsandcharacteristics.DepressAnxiety.1997;5:154-164)，而不同患者使用同一種藥物其療效和副反應(yīng)上有很大區(qū)別。這些問題長期困擾著臨床醫(yī)生。對于復(fù)雜性疾病進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)的研究為了解疾病的發(fā)病機理、疾病的診斷及疾病易感性研究提供了重要基礎(chǔ)。93X的人類基因都存在SNP，通常為雙等位基因，是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記物。基因組DNA序列的變異，被認(rèn)為是決定人們的疾病易感性和藥物反應(yīng)的重要因素。為了更早地更全面地防治抑郁癥，迫切需要對于抑郁癥及其藥物治療進(jìn)行早期預(yù)測，本發(fā)明即提供一種新的預(yù)測抑郁癥患病嚴(yán)重程度及藥物治療的用途、方法以及試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過研究與抑郁癥患病嚴(yán)重程度相關(guān)的基因多態(tài)性位點基因型，提供5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抑郁癥嚴(yán)重程度的用途。同時，本發(fā)明提供5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度的用途。在本發(fā)明中，"抑郁癥"是指以情緒低落，快感缺乏和興趣喪失等精神心理癥候群為主要表現(xiàn)并伴有其他心理和軀體癥狀的情感障礙。抑郁癥的臨床表現(xiàn)包括核心癥狀和伴隨癥狀兩大類。抑郁的核心癥狀包括情緒低落(或心境低落)、興趣缺乏以及樂趣喪失。其中，情緒低落的病人體驗到情緒低，悲傷；興趣缺乏是指病人對各種以前喜愛的活動缺乏樂趣；樂趣喪失是指病人無法從生活中體驗到樂趣，或曰快感缺失(anhedonia)。焦慮和睡眠障礙是抑郁癥的伴隨癥狀。本發(fā)明另一個要解決的技術(shù)問題是提供5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型預(yù)測抗抑郁藥物藥效的用途。同時，本發(fā)明還提供5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抗抑郁藥物對抑郁癥核心癥狀藥效的用途。在本發(fā)明中，"抗抑郁藥物"是指選自5-羥色胺再攝取抑制劑(selectiveserotoninreuptakeinhibitors,SSRI)、選擇性5-HT及去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制齊U(serotonin-norepinephrinereuptakeinhibitor,SNRI)、5-HT受體拮抗劑/再攝取抑制劑(serotoninantagonist/reuptakeinhibitor,SARI)、NE及特異性5-HT能抗抑郁藥(noradrenergicandspecificserotonergicantidepressant,NaSSA)。其中，SSRI類藥物包括氟西汀(fluoxetine)、帕羅西汀(Paroxetine)、舍曲林(Sertraline)、氟伏沙明(Fluvoxamine)、西月太普蘭(Citalopram)禾口S-西月太普蘭(Escitalopram)。SNRI類藥物包括文拉法辛(venlafaxine)和度洛西汀(duloxetine)。SARI類藥物包括曲唑酮(Trazodone)、奈法唑酮(Nefazodone)。NaSSA類藥物包括米氮平(Mirtazapine)。其中，抗抑郁藥物優(yōu)選SSRI類藥物，更加優(yōu)選SSRI類藥物中的氟西汀。在本發(fā)明中，5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型優(yōu)選"5-HTT的13C/T多態(tài)性位點基因型"，5-HTT的13C/T多態(tài)性位點基因型"是指5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因(SCL6A417qll.l-17q12)位于13內(nèi)含子處的多態(tài)性位點基因型，在該位點存在C/T的單核苷酸多態(tài)性(NCBISNPID:rs2054847)，即當(dāng)兩條染色體相應(yīng)位置均為"C"時，該位點基因型為"5-HTT13CC純合型"；當(dāng)兩條染色體相應(yīng)位置分別為"C"和"T"時，該位點基因型為"13CT雜合型"；當(dāng)兩條染色體相應(yīng)位置均為"T"時，該位點基因型為"13TT純合型"。在本發(fā)明中，5—HTT的基因型多態(tài)性還進(jìn)一步通過確定13C/T多態(tài)性位點附近與之存在連鎖不平衡的其它多態(tài)性位點的基因型而實現(xiàn)。優(yōu)選地，所述其它多態(tài)性位點包括無義突變位點、錯義突變位點以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點。在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥嚴(yán)重程度較重；(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥嚴(yán)重程度較輕。在本發(fā)明提供的實施方案中，當(dāng)(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度較重；(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度較輕。在本發(fā)明提供的又一個實施方案中，當(dāng)(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測抗抑郁藥的藥效較好；(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測抗抑郁藥的藥效較差。在本發(fā)明提供的實施方案中，當(dāng)(1)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測抗抑郁藥針對抑郁癥核心癥狀的藥效較好；(2)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測抗抑郁藥針對抑郁癥核心癥狀的藥效較差。本發(fā)明還提供了通過測定來自受試者的生物樣品中5—HTT基因13C/T多態(tài)性位點基因型，預(yù)測個體抑郁癥患病嚴(yán)重程度、抑郁癥核心癥狀患病嚴(yán)重程度、預(yù)測抗抑郁藥的藥效和抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效的方法。其中，當(dāng)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較重，抑郁癥核心癥狀患病程度較重，服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較好，抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較好；當(dāng)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較輕，抑郁癥核心癥狀患病程度較輕，服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較差，抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較差。在本發(fā)明所述的方法，可以使用包括選自以下的差異核酸分析技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性、PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR-序列特異寡核苷酸法、序列測定、PCR-序列特異性引物法、PCR-熒光法、PCR指紋圖法、寡核苷酸連接分析、熒光能量共振轉(zhuǎn)移的檢測法、生物芯片、核酸芯片、質(zhì)譜技術(shù)、基因掃描、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、酶或化學(xué)錯配切割法、Taqman生物檢測方法、納米技術(shù)。PCR、PCR-RFLP、生物芯片、序列測定、基因掃描基因型檢測方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的方法。Taqman技術(shù)是一種運用熒光技術(shù)進(jìn)行實時定量PCR的方法。生物芯片是指采用廣島原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影相機(CCD)對雜交信號的強度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量或質(zhì)量。納米技術(shù)利用功能化的金納米顆粒，顆粒直徑范圍在10—40nm。特異性的寡核苷酸序列附著于金納米顆粒表面，通過特異性的分子雜交、特異性的熒光信號系統(tǒng)或者其他顯色系統(tǒng)使信號得到富及放大，從而得到基因型的信息。其中優(yōu)選的檢測方法為PCR、PCR-RFLP、Taqman技術(shù)、生物芯片、核酸芯片或者納米技術(shù)。本發(fā)明對于多態(tài)性位點基因型的檢測方法的說明并非是對于檢測方法的限定，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的生物技術(shù)方法通過檢測本發(fā)明的多態(tài)性位點基因型來預(yù)測個體抑郁癥患病程度、抗抑郁藥藥效的方法均屬于本
發(fā)明內(nèi)容，還可以進(jìn)一步包括采用常規(guī)的生物技術(shù)方法通過檢測本發(fā)明的多態(tài)性位點功能型基因型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或者表達(dá)產(chǎn)物的差異間接反映相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點來預(yù)測生物樣品中個體抑郁癥患病程度、抗抑郁藥藥效的方法。在本發(fā)明中，所述的生物樣品選自血液樣品、體液樣品、組織樣品和培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選的，所述樣品為血液樣品。其中血液樣品包括外周血細(xì)胞、白細(xì)胞、血清等，體液樣品包括尿液、唾液、組織液、腦脊液、體腔滲出液等，組織樣品包括口腔粘膜試子、毛發(fā)、皮膚、活檢組織、組織樣分泌物、排泄物樣本等。本發(fā)明還提供了用于預(yù)測個體抑郁癥患病嚴(yán)重程度、抑郁癥核心癥狀患病嚴(yán)重程度、預(yù)測抗抑郁藥的藥效和抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效的試劑盒。在本發(fā)明提供的試劑盒中，當(dāng)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較重，抑郁癥核心癥狀患病程度較重，服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較好，抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較好；當(dāng)5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較輕，抑郁癥核心癥狀患病程度較輕，服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較差，抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較差。在本發(fā)明提供的試劑盒中，可以包括用于檢測生物樣品中5—HTT基因的13C/T多態(tài)性位點基因型的多態(tài)性分型寡核苷酸探針和進(jìn)行檢測的反應(yīng)體系。其中，寡核苷酸探針能特異地與含有所述5—HTT基因的13C/T多態(tài)性位點的核酸雜交。寡核苷酸探針優(yōu)選包含SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探針。等位基因特異性探針的序列為VIC-5，TCAGGCACQACATTT3，-NFQ(SEQIDNo.3)FAM-5，TCAGGCACMCATTT3，-NFQ(SEQIDNo.4)在本發(fā)明提供的試劑盒中，可以包括用于擴(kuò)增含5—HTT基因的13C/T多態(tài)性位點的5—HTT基因片段的特異性引物、能夠特異性識別并切斷所述位點處特異性核酸序列的限制性內(nèi)切酶及其緩沖液。其中，限制性內(nèi)切酶優(yōu)選為AvaII。在上述試劑盒中，還可以進(jìn)一步包括核酸提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和陽性對照模板。其中，PCR反應(yīng)試劑含有四種脫氧單核苷酸、耐熱DNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液；陽性對照模板包括含有5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點的純合型、雜合型和/或純合型序列的PCR產(chǎn)物、克隆核酸、克隆質(zhì)粒、直接合成的核酸序列或基因組DNA。引物序列為正向引物5，GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG3，(SEQIDNo.1)反向引物5，AGAAACTCAATGACTGTGCATCAAGA3，(SEQIDNo.2)本發(fā)明又提供了一種基因芯片，其中包含用于測定5-HTT的多態(tài)性位點基因型的多態(tài)性分型寡核苷酸探針；其中所述基因芯片優(yōu)選為DNA芯片。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的所有技術(shù)方案不受限于任何理論，本發(fā)明對于位點基因型的檢測方法的說明也并非是對于檢測方法的限定，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)的生物技術(shù)方法通過檢測本發(fā)明的多態(tài)性位點基因型來預(yù)測以抑郁癥患病程度、抗抑郁藥物藥效為核心的其他發(fā)明均屬于本
發(fā)明內(nèi)容，還可以進(jìn)一步包括采用常規(guī)的生物技術(shù)方法通過檢測本發(fā)明的多態(tài)性位點基因型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或者表達(dá)產(chǎn)物的差異間接反映相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性位點來預(yù)測抑郁癥患病程度、抗抑郁藥物藥效的事例。如下實施例對本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白所有實施例只是為了更好地理解本發(fā)明，其在任何意義上均不是為了限制本發(fā)明的內(nèi)容。具體實施例方式實施例1測定5—HTT基因13C/T多態(tài)性位點基因型預(yù)測抑郁癥嚴(yán)重程度的效果一.研究對象1患者來源全國12家精神專科醫(yī)院和綜合醫(yī)院精神科或心理科門診患者。2納入標(biāo)準(zhǔn)年齡》18歲的男女病人；根據(jù)美國精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第四版(Diagnosisandstatisticmanualformentaldisorder-IV，DSM-IV)確診為重性抑郁癥(majord印ressivedisorder),既往無躁狂或輕躁狂發(fā)作史。單純的心境惡劣障礙(dysthymia)不在納入之列；HAMD17項總分》16分；根據(jù)研究者的觀點，病人必須能夠配合所有的研究步驟。3排除標(biāo)準(zhǔn)*既往精神病史l)不能除外其他器質(zhì)性或藥物引起的繼發(fā)性抑郁癥或雙向情感障礙；2)有嚴(yán)重自殺傾向、木僵狀態(tài)、強迫癥、暴食癥或其他嚴(yán)重精神障礙病史；3)有酒或其他物質(zhì)依賴或濫用證據(jù)者。*其他病史1)手術(shù)后一年康復(fù)期；2)1年內(nèi)有過胃潰瘍、慢性腹瀉等胃腸道疾病、肝膽疾病(慢性肝炎、肝硬化、膽道結(jié)石等)、原發(fā)性慢性腎病、腎功能不全等影響氟西汀正常吸收、代謝、分布和排泄功能的患者；3)有嚴(yán)重腦外傷史；或有其他嚴(yán)重合并癥，如腦卒中、心臟病、糖尿病、心功能不全等慢性進(jìn)行性或惡化的器質(zhì)性疾病等；4)實驗室或體格檢查發(fā)現(xiàn)明確軀體或神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。*藥物治療史l)最近六個月接受過電抽搐治療(ECT)，或長期使用長效的抗精神病藥物或氟西汀；2)最近三個月內(nèi)曾經(jīng)接受系統(tǒng)(治療劑量4周以上)的抗抑郁藥物治療；3)最近四周內(nèi)服用過任何抗精神病藥物或抗抑郁藥物，不管劑量多大或療程多長；4)最近兩周內(nèi)使用過單胺氧化酶抑制劑；5)必須長期合并使用具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的藥物或可能影響情緒的藥物者；6)對氟西汀過敏生育史妊娠或哺乳期婦女。目前未采取醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的有效避孕措施因而有可能懷孕者二研究方法1評定工具和方法(1)診斷標(biāo)準(zhǔn)美國精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第四版(AmericanPsychiatricAssociation.DiagnosticandStatisticalManualDisorder(DSM-IV).4th，Washington:psychiatricAssociation,1994.320-327)重性抑郁的診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)診斷量表遺傳學(xué)研究用診斷檢查(N固bergerJ.J.，Blehar，M.,Kaufmann,C.，etal.Diadgnosticinterviewforgeneticstudies;Rationale，uniquefeaturesandtraining;NIMHGeneticsInitiative,Arch.Gen.Psychiatry.1994)第三版(3)嚴(yán)重程度評定量表(張明園主編精神科量表評定手冊，湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1998):Hamilton抑郁量表(HAMD)17項版本HAMD量表將癥狀群相應(yīng)的分為5類因子(ClearyM，GuyW.FactoranalysisoftheHamiltondepressionscale.DrugsExpClinRes1975;1:115-20.)，包括遲滯因子(HAMD條目1，7，8，14);睡眠癥狀因子(HAMD條目4，5，6);Maier癥狀因子(HAMD條目1，2，7，8，9，10);焦慮/軀體化因子(HAMD條目10，11，12，13，15，17);核心因子(HAMD條目1，2,3,7，8);校驗因子^AMD總分-焦慮因子分-睡眠因子分(HAMD條目1，2，3，7，8，9,14，16)。。臨床總體療效評定量表CGI(ClinicalGlobalImpression):是美國NIMH修訂的1976年版本。疾病嚴(yán)重程度SI(severityofillness),采用0—7分的8級記分方法，根據(jù)具體病人的病情與同一研究的其他同類病人比較，做出評定。(4)流行病學(xué)問巻所有參加者在第1天回答流行病學(xué)問巻，內(nèi)容包括疾病史、3個月內(nèi)或者3個月至1年內(nèi)有無負(fù)性生活事件；職業(yè)史包括就業(yè)經(jīng)歷、工作性質(zhì)、日常職業(yè)活動和職業(yè)暴露等；生活習(xí)慣體育鍛煉、生活節(jié)奏、睡眠情況、吸煙與被動吸煙情況、飲酒及飲茶情況等；日常膳食情況飲食習(xí)慣，每日蔬菜、水果、肉類、副食品攝入情況等。2研究過程(1)經(jīng)過篩選合格的患者第l天完成Hamilton抑郁量表和臨床總體印象(CGI)評定，完成治療中出現(xiàn)的副作用量表的基線評定，遺傳學(xué)研究用診斷檢查(DIGS)及流行病學(xué)問巻等(2)符合標(biāo)準(zhǔn)的病人進(jìn)入藥物治療期。給與氟西汀分散片口服，每日20毫克，早晨或上午口服。治療觀察期6周。治療前一天，治療第一、二、四、六周末各進(jìn)行一次臨床隨訪。(3)血樣采取和基因型測定采集患者靜脈EDTA抗凝全血10ML，采血后充分混勻，分裝，放于一20°C凍存，于3個月內(nèi)完成DNA提取及基因型分析。三實驗室部分1提取宿主細(xì)胞的基因組DNA:(1)血中加入30ml紅細(xì)胞裂解液，緩慢搖勻，室溫靜置10分鐘，期間，搖動數(shù)次，徹底裂解紅細(xì)胞；(2)于4。C、2000轉(zhuǎn)離心/分，IO分鐘，去上清，將沉淀之白細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)震蕩器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，搖勻，加白細(xì)胞裂解液置15ml，混勻37。C水浴20分鐘后取出，置冷水中；(3)加冷的蛋白沉淀液4ml，混勻后放在-20。C冰箱5分鐘，取出于4。C、3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。將上清液倒入己加好15ml異丙醇的50ml離心管中緩慢搖動數(shù)次，至DNA絮狀物析出；(4)將析出的DNA絮狀物移至另一1.5ml已裝入75%乙醇的濾紙上，使液體揮發(fā)干；(5)加DNA水化液1.5ml,置搖床，搖動過夜，備用；(6)DNA濃度的測定采用紫外分光光度法，分別測定260nm及280nm兩個波長下的OD值，以O(shè)D260nmX50所得值為DNA濃度。并以0D260nm/0D280nm比值估計DNA純度。2使用Taqman方法檢測5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點基因型(1)用PCR儀擴(kuò)增5-HTT功能基因多態(tài)位點及其側(cè)翼序列，在5ulPCR反應(yīng)體系中含有基因組DNA10ng，2.5ul的Taqman2XUniversalPCRMasterMixNoAmpErase跳(組成成份包括AmpliTaqGoldDNAPolymerase,dNTPswithDutp，PassiveReference，以優(yōu)化的緩沖液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及兩段帶熒光報告基團(tuán)的等位基因特異性探針各0.16uM.引物序列為正向引物5，GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG3，(SEQIDNo.1)反向引物5，AGAAACTCAATGACTGTGCATCAAGA3，(SEQIDNo.2)等位基因特異性探針的序列為VIC-5，TCAGGCACQACATTT3，-NFQ(SEQIDNo.3)FAM-5，TCAGGCACJACATTT3，-NFQ(SEQIDNo.4)PCR反應(yīng)條件預(yù)循環(huán)95'CIO分鐘；92'C15s，60'Cl分鐘循環(huán)50次。(2)在7900型熒光定量PCR儀上檢測熒光信息，進(jìn)行基因型結(jié)果判定將完成PCR反應(yīng)的PCR板放入7900型熒光定量PCR儀上，選用"AllelicDiscrimination"程序，進(jìn)行掃描與結(jié)果的判斷發(fā)出FAM熒光者的基因型為T/T純合子；發(fā)出VIC熒光者的基因型為C/C純合子；發(fā)出兩種熒光者的基因型為C/T雜合子。四統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。采用卡方分析基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。描述性統(tǒng)計對連續(xù)變量做是否符合正態(tài)分布的分析，不符合首先采用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，使之符合正態(tài)分布。推斷性統(tǒng)計P值統(tǒng)計學(xué)計算時，給出具體P值。P〈0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料t檢驗，單因素方差分析和多元回歸分析。計數(shù)資料采用卡方法、校正卡方檢驗。結(jié)果15-HTT等位基因和基因型分布情況基線期761例患者入選研究，其中425例(56%)的血樣進(jìn)行了DNA檢測基因型。5-HTT等位基因和基因型分布情況參見表1。其中CC基因型患者的比例低，將CC和CT基因型患者合并為含有C等位基因的一組患者，簡稱C+，TT基因型的患者不含C等位基因，簡稱為C-。進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗x2=0.839，P=0.36，符合Hardy-Weinberg平衡，說明樣本來自遺傳平衡的群體。表15-HTT基因型和等位基因頻率(N=425)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>25-HTT基因型分析中遺傳模型的選擇三個基因型的患者在基線期HAMD總分的均值分別是TT型(n=278):23.19±5.23，CT型(n=135):21.98±4.62和CC型(n=12):20.83±4.06。TT型與CT型患者HAMD總分比較，差異有顯著性(校正性別，年齡，本次病程，單次/復(fù)發(fā)和l年內(nèi)有無生活事件等因素之后，P=0.043)，CT型與CC型患者HAMD總分比較，差異無顯著性(校正因素同上，P=0.425)，因此采用顯性遺傳模型將CT型和CC型患者合并為一組(C+型)和TT型(C一型)患者進(jìn)行比較。3基線期資料和5-HTT基因型比較計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗(使用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示)，其中本次病程、發(fā)作次數(shù)和CGI—SI采用非參數(shù)檢驗，使用中位數(shù)(最小值最大值)表示?；€期測得5-HTT基因型的患者425例?；颊咝詣e，此次發(fā)病年齡，首次發(fā)病年齡，發(fā)作次數(shù)，民族，婚姻狀況，受教育年限、單次或復(fù)發(fā)，本次病程，發(fā)病前3個月內(nèi)有無負(fù)性生活事件等在5-HTT基因型之間無差異；而TT基因型在發(fā)病前1年內(nèi)出現(xiàn)負(fù)性生活事件的頻率、CGI-SI分?jǐn)?shù)、HAMD總分高于含C+型患者，有統(tǒng)計學(xué)意義。其中TT基因型患者1年內(nèi)有負(fù)性生活事件比例是C+基因型有負(fù)性生活事件比例的1.86倍(95%CI:1.23-2.83)。見表2。表2基線期資料和基因型入選患者測得基因型患者(n=425)n=761TT(n=278)C+(n=147)2P計數(shù)資料性別(M/F)341/420137/14170/770.1060.744民族(漢/其他)708/31266/10136/50.5970.963婚姻(有配偶/無)398/333133/13379/631.1770.278單發(fā)/復(fù)發(fā)498/24589/18344/1010.2460.620ly內(nèi)生活事件(有/無)312/449132/14648/998.6600.003*3m內(nèi)生活事件(有/無)131/63048/23016/1313.0620.080憂郁性(是/否)535/178194/69103/390.0710.790計量資料入選患者n=761TTn=278C+n=147本次發(fā)作年齡y34.20±12.8432.47±12.3234.38±13.38-1.4360.152首次發(fā)作年齡y33.06±12.4831.00±11.6633.58±13.25-1.9060.058教育年限y11.29±4.3011.76±3.6511.40士4.060.9020.368本次病程w16(1144)12(1~144)12(2120)0.811發(fā)作次數(shù)0(028)0(0~9)0(028)0.098CGI-SI4(07)5(0~7)4(36)—0.045一"表示非參數(shù)檢驗4基線期HAMD總分與基因型的關(guān)系比較不同基因型抑郁癥患者抑郁嚴(yán)重程度之間的差異。由于使用回歸分析和t檢驗分析方法結(jié)果一致，同時使用回歸分析便于我們與校正變量后的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，所以在表格中顯示的是回歸分析采用校正前后的2組數(shù)據(jù)。校正因素同前。不同基因型患者的HAMD總分的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TT基因型患者的HAMD總分顯著的高于C+基因型的患者。見表3。該結(jié)果說明，該基因位點多態(tài)性與抑郁癥的嚴(yán)重程度有關(guān)，TT基因型病人抑郁癥更為嚴(yán)重。5基線期因子分與基因型的關(guān)系比較不同基因型抑郁癥患者各個癥狀群嚴(yán)重程度之間的差異。分析方法同前，不同基因型患者的遲滯因子、核心因子、Maier因子分?jǐn)?shù)有統(tǒng)計學(xué)意義。我們根據(jù)結(jié)果設(shè)立校驗因子，校驗因子分?jǐn)?shù)-HAMD總分一(焦慮因子分?jǐn)?shù)+睡眠因子分?jǐn)?shù))，并比較基因型的差異，分析方法同上。TT基因型患者在遲滯因子、核心因子、Maier因子和校驗因子分?jǐn)?shù)顯著的高于C+基因型的患者。見表3。6基線期HAMD各條目分?jǐn)?shù)與基因型的關(guān)系對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，對于經(jīng)過轉(zhuǎn)換后仍不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗分析。結(jié)果顯示TT基因型患者的HAMD量表條目1抑郁心境，條目2罪惡感和條目7工作興趣喪失這3項條目評分高于C+型的患者。見表4。我們的研究顯示TT基因型和C+基因型的患者相比，在發(fā)病年齡，性別等方面無統(tǒng)計學(xué)的差異；然而TT基因型患者報告的l年內(nèi)負(fù)性生活事件多，HAMD總分和CGI-SI分?jǐn)?shù)高，表明抑郁癥狀評定嚴(yán)重；TT基因型患者遲滯因子，核心因子和Maier因子的分?jǐn)?shù)高，表明對單個癥狀的嚴(yán)重程度的評定上抑郁心境、罪惡感和工作興趣喪失明顯。在研究中使用的5個因子中某些條目有重疊，例如遲滯因子和核心因子共同擁有條目1，7，8，Maier因子中包含了焦慮方面條目的評定，因此對因子分析的結(jié)果需要結(jié)合校驗因子的分析進(jìn)行綜合評定。本研究顯示TT基因型主要影響的是抑郁患者的核心癥狀，而對睡眠和焦慮方面的影響相對較小。5-HTT13C/T(rs2054847)基因多態(tài)性能夠修飾抑郁癥病人對負(fù)性生活事件的感知，修飾抑郁癥的嚴(yán)重程度，并且主要是修飾抑郁癥的核心癥狀，即主觀抑郁、興趣喪失等癥狀的嚴(yán)重程度而與焦慮、睡眠等癥狀關(guān)系不大。TT純合子抑郁癥病人傾向于罹患更為嚴(yán)重，而且更為典型的抑郁癥。表3基線期HAMD總分、因子分與基因型多元回歸分析<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表4基線期HAMD條目分?jǐn)?shù)與基因型關(guān)系纟檢驗和*非參數(shù)檢驗均值/條目12345*6*78_TT型(278)2.861.401.191.221.121.112.611.71C+型(147)2.671.071.091.331.141.122.371.58P0.0020.0000.3320.1810.8000.8090.0020.161均值/條目眉腦gio11121314*1516*17TT型(278)1.202.041.590.921.230.820.960.580.64C+型(147)1.231.981.600.901.180.711.000.430.50P0.7240.4820.9520.7090.4600.2560.6750.0630.072實施例2氟西汀藥物療效與5羥色胺轉(zhuǎn)運體基因多態(tài)性的關(guān)系一研究對象1患者來源見實施例1。2研究藥物氟西汀(Fluoxetine)，美國禮來公司生產(chǎn)，商品名百優(yōu)解。批號A022974，A042635,A057046,A060206,A077246)，(每日1次,每次1片，每片20mg，共43天)，固定劑量。3臨床研究過程(1)研究過程經(jīng)過篩選合格的患者第1天完成Hamilton抑郁量表和臨床總體印象(CGI)評定，完成治療中出現(xiàn)的副作用(TESS)量表的基線評定，遺傳學(xué)研究用診斷檢查(DIGS)及流行病學(xué)問巻等；醫(yī)生指導(dǎo)患者口服氟西汀一片(20mg)，向病人介紹藥物治療的特點和常見的副反應(yīng)。預(yù)約隨訪，指導(dǎo)填寫隨訪日記，發(fā)放一周藥物和隨訪日記本。第242天患者每日在晨間口服氟西汀一粒，并填好服藥日記?；颊哂陂_始服藥后第8、15、29、43日到醫(yī)院復(fù)査(其間可以有前后2天的允許范圍)，由醫(yī)生進(jìn)行HAMD、CGI、TESS等檢查。醫(yī)生復(fù)核病人的服藥情況，并發(fā)放下周服用的藥物。同時，藥物治療期間每周電話隨訪2次，督促病人按時服藥，填寫隨訪記錄，監(jiān)測副反應(yīng)和癥狀轉(zhuǎn)歸的處置。復(fù)診前一天，由協(xié)調(diào)員電話提醒患者次日復(fù)診及復(fù)診時攜帶服藥日記和未服完的藥品以及已服用的藥物的包裝盒，用于核對病人的服藥情況。(2)合并使用藥物在氟西汀藥物治療期間不得合并使用其它抗抑郁藥物，盡量不合并使用各種主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，包括抗精神病藥物、抗抑郁藥物、抗躁狂藥物、抗癲癇藥物等。對于治療中出現(xiàn)明顯睡眠障礙的病人，可以短期(不超過2周)合并使用羅拉西泮(〈6mg)、氯硝西泮(<6mg)、硝基西泮(<15mg)或艾司唑侖(<3mg)其中一種。在治療的最后兩周內(nèi)盡量不合并應(yīng)用此類藥物，以免影響最終結(jié)果的評定。(3)隨訪期間特殊情況的處理研究過程中醫(yī)生應(yīng)注意觀察患者的病情轉(zhuǎn)歸，一旦發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥、病情惡化、或嚴(yán)重的副反應(yīng)、或患者任何時候提出退出觀察，都應(yīng)及時終止研究。研究中尤其在治療的前兩周，醫(yī)生應(yīng)注意觀察患者有無自殺傾向及其他嚴(yán)重情緒異常。應(yīng)向患者家屬詳細(xì)交待病人病情和本次研究的目的，尤其是病人的自殺意念和行為。服用藥物本身可能引起的胃腸道不適、焦慮、激惹、失眠、性功能障礙或皮疹等反應(yīng)。由醫(yī)生視嚴(yán)重程度及時處理，并在病例報告表(CRF)上做好記錄。如果患者存在漏服藥物，或未經(jīng)醫(yī)生允許服用其他藥物等情況，需認(rèn)真記錄用量、服用時間和藥物名稱等，連續(xù)漏服3天以上(不含3天)、或累積漏服8天以上(不含8天)，要退出研究。服藥量在方案規(guī)定劑量的80120%之間的病人為依從性良好者。醫(yī)生對病人的服藥情況應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的追蹤觀察。包括在每次隨訪時向病人詳細(xì)介紹用藥方法以及藥物常見的副反應(yīng)，讓病人將服藥后剩下的空藥盒和泡板回收并査驗，督促病人記隨訪日記等。二數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。描述性統(tǒng)計:對連續(xù)變量做是否符合正態(tài)分布的分析，不符合首先采用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，使之符合正態(tài)分布。推斷性統(tǒng)計:P值統(tǒng)計學(xué)計算時，給出具體P值。P《0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料單因素方差分析和多元回歸分析。計數(shù)資料采用卡方法、校正卡方檢驗、Logistic回歸分析等。基線期761例患者中602例(79.1%)完成了43天治療隨訪評估。三基因型和療效關(guān)系1療效評估標(biāo)準(zhǔn)(1)隨訪時條目分?jǐn)?shù)，因子分?jǐn)?shù)和HAMD總分。(2)減分和減分率基線分?jǐn)?shù)減去隨訪時分?jǐn)?shù)的得分作為減分。減分率是(減分/基線分?jǐn)?shù))X100%。(3)緩解(remission):抗抑郁藥治療6周結(jié)束時HAMD評分〈=7分作為臨床緩解標(biāo)準(zhǔn)(KellerMB.Remissionversusresponse:Thenewgoldstandardofantidepressantcare.JClinPsychiatry2004;65:53-59)。(4)有效(respond):抗抑郁藥治療6周結(jié)束時HAMD治療前后減分率下降〉=50%作為有效(StassenHH,AngstJ，Delili-StulaA.Severityatbaselineandonsetofimprovementindepression:meta-analysisofimipramineandmoclobemideversusplaceboEurPsychiatry1994;9:129-136)。2研究結(jié)束時總分減分與基因型的關(guān)系校正性別、年齡、本次病程、單發(fā)/復(fù)發(fā)、基線HAMD分?jǐn)?shù)、生活事件等因素，進(jìn)行回歸分析。校正前回歸分析顯示在治療第29d和結(jié)束時(43d)TT基因型患者HAMD減分(10.18±5.74，13.91±6.20)高于C+基因型HAMD減分(8.81土5.65，12.41±5.68)，在校正上述變量后這種趨勢仍然存在。見表5。3探討研究結(jié)束時有效率和基因型的關(guān)系校正性別、年齡、次病程、單發(fā)/復(fù)發(fā)、生活事件等，進(jìn)行Logistic回歸分析。在研究結(jié)束時(43d)，TT基因型患者有效率是74.7%(162/217)丄+基因型有效率是69.6%(78/112)，有效率TT型呈現(xiàn)高于C+型患者的趨勢。4探討研究結(jié)束時緩解率和基因型的關(guān)系進(jìn)行Logistic回歸分析、校正變量為性別、年齡、本次病程、單發(fā)/復(fù)發(fā)，l年內(nèi)生活事件、基線HAMD分?jǐn)?shù)等。在研究結(jié)束時(第43天)，TT基因型患者緩解率(48.3%，44/112)是C+型患者的緩解率(39.3%，105/217)的1.68倍(R2=0.096，P=0.036)。5分析因子減分與基因型的關(guān)系在研究結(jié)束時(43d),TT基因型患者的核心、遲滯和Maier因子減分高于C+型患者，有統(tǒng)計學(xué)意義；其中核心因子和Maier因子減分的差異是從治療的第15d開始出現(xiàn)的，說明涉及抑郁癥的核心癥狀群的因素的減分在TT基因型上出現(xiàn)的早。見表6、7。6校驗因子與基因型的關(guān)系在第一部分研究中我們設(shè)立的校驗因子(HAMD總分減去睡眠和焦慮因子的分值)，計算其隨訪時的減分值。在研究結(jié)束時校驗因子減分TT型是7.75，C+型是6.47,研究基因型對因子減分的影響，校正變量同上，顯示TT型校驗因子減分顯著的高于C+型患者(t=-2.413，P=0.016)，證明了TT型患者除睡眠和焦慮以外的抑郁的核心因子減分顯著。抑郁癥患者使用氟西汀治療后，TT基因型患者的總分減分多于C+基因型患者，且有效率和緩解率顯著高于C+基因型患者，說明TT基因型患者服用氟西汀后癥狀改善強于服用同樣藥物的C+基因型患者。在43天時，服用氟西汀的TT基因型患者的核心因子減分、遲滯因子減分和Maier因子減分高于C+型患者，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明TT基因型患者服用氟西汀后癥狀的改善主要表現(xiàn)在核心癥狀改善，對于睡眠、焦慮等軀體性癥狀的改善與服用氟西汀后的C+基因型患者的治療效果區(qū)別不明顯。TT基因型患者與C+基因型患者相比，隨訪期間核心因子減分和Maier因子減分的改善差異是從治療的第15天開始出現(xiàn)的，說明涉及抑郁癥的核心癥狀群的因素的減分在TT基因型患者上出現(xiàn)的早，表明TT基因型患者使用SSRI類抗抑郁藥物在治療早期就能明顯改善抑郁癥核心癥狀。說明SSRI類抗抑郁藥氟西汀治療抑郁癥的療效受到5-HTT13C/T(rs2054847)多態(tài)性的修飾。TT基因型病人治療后總體療效顯著提高，而且主要反映在抑郁癥核心癥狀好轉(zhuǎn)顯著加快，最終療效顯著提高。表7隨訪期間HAMD總分減分與基因型<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>正變量性別，年齡，本次病程，單發(fā)/復(fù)發(fā)，l年內(nèi)生活事件，基線分?jǐn)?shù)TT基因型與C+基因型相比，*P<0.05表9TT基因型與C+基因型隨訪43d時因子減分的多元回歸分析減分標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)R2PBeta睡眠-0.0050.0000.926焦慮/軀體化-O.0290.0010.609核心-0.1920.0370.001遲滯-0.1490.0220.007Maier因子-0.1320.0170.018校正因素性別，年齡，本次病程，基線分?jǐn)?shù)，l年內(nèi)生活事件等實施例3:試劑盒及其實施方法本實施例例證性地提供一種預(yù)測抑郁癥發(fā)生風(fēng)險的試劑盒，由以下組分組成(1)紅細(xì)胞裂解液含有NH4C1，KHC03,EDTA;(2)白細(xì)胞裂解液含有蛋白酶K(Sigma)、RNaseA(Promega)、NaCl、5XTris、EDTA、SDS;(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH7.4)(4)核酸儲存液1M三羥甲基氨基甲垸-鹽酸(Tris-HC1，pH8.0);(5)PCR反應(yīng)混合液1.Oml[100mMTris-HC1，100mMKC1，pH8.3(20°C)];5.0幽gC12(AppliedBiosystem);各O.4mMdATP,dCTP，dGTP，dTTP，無菌雙蒸10水配制，pH7.0(BioBasicInc.);PRCP基因的多態(tài)性位點基因型檢測引物(上海生工生物工程有限公司)；(6)TaqDNA聚合酶(AppliedBiosystems)(5U/W):保存緩沖液20mMTris-HC1(PH8.0)，lOOmMKC1，0.1mMEDTA，ImMDTT，0.5%NP40,0.5%(v/v)Tween20，50%甘油；(7)陽性質(zhì)粒含有5—HTT基因的多態(tài)性位點雜合基因型個體全血標(biāo)本，或者含有5—HTT基因的多態(tài)性位點雜合基因型的質(zhì)粒；(8)陰性對照經(jīng)DNAaseI(Promega)處理的雙蒸水；(9)內(nèi)切酶緩沖體系(10X);(10)限制性內(nèi)切酶；(11)PCR用水；(12)IOX電泳上樣緩沖液0.25%溴酚蘭(Sigma)，40%(w/v)蔗糖水溶液。上述試劑盒可例如用于測定5—HTT基因的13C/T多態(tài)性位點基因型1提取宿主細(xì)胞的基因組DNA:(1)血中加入30ml紅細(xì)胞裂解液，緩慢搖勻，室溫靜置IO分鐘，期間，搖動數(shù)次，徹底裂解紅細(xì)胞；(2)于4。C、2000轉(zhuǎn)離心/分，IO分鐘，去上清，將沉淀之白細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)震蕩器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，搖勻，加白細(xì)胞裂解液置15ml,混勻37'C水浴20分鐘后取出，置冷水中；(3)加冷的蛋白沉淀液4ml，混勻后放在-20'C冰箱5分鐘，取出于4'C、3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。將上清液倒入己加好15ml異丙醇的50ml離心管中緩慢搖動數(shù)次，至DNA絮狀物析出；(4)將析出的DNA絮狀物移至另一1.5ml已裝入75%乙醇的濾紙上，使液體揮發(fā)干；(5)加DNA水化液1.5ml,置搖床，搖動過夜，備用；(6)DNA濃度的測定采用紫外分光光度法，分別測定260nm及280nm兩個波長下的OD值，以O(shè)D260nmX50所得值為DNA濃度。并以0D260nm/0D280nm比值估計DNA純度。2使用Taqman方法檢測5—HTT(5羥色胺轉(zhuǎn)運體)基因的C/T多態(tài)性位點基因型(1)用PCR儀擴(kuò)增5—HTT功能基因多態(tài)位點及其側(cè)翼序列，在5ulPCR反應(yīng)體系中含有基因組DNA10ng，2.5ul的Taqman2XUniversalPCRMasterMixNoAmpEraseUNG(組成成份包括AmpliTaqGoldDNAPolymerase,dNTPswithDutp，PassiveReference,以優(yōu)化的緩沖液)，及0.72uM的正向引物，0.72uM的反向引物及兩段帶熒光報告基團(tuán)的等位基因特異性探針各0.16uM.引物序列為正向引物5，GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG3，(SEQIDNo.1)反向引物5，AGAAACTCAATGACTGTGCATCAAGA3，(SEQIDNo.2)等位基因特異性探針的序列為VIC-5，TCAGGCAC&ACATTT3，-NFQ(SEQIDNo.3)FAM-5'TCAGGCA(^ACATTT3，-NFQ(SEQIDNo.4)PCR反應(yīng)條件預(yù)循環(huán)95'CIO分鐘；92'C15s，60'Cl分鐘循環(huán)50次。(2)在7900型熒光定量PCR儀上檢測熒光信息將完成PCR反應(yīng)的PCR板放入7900型熒光定量PCR儀上，選用"AllelicDiscrimination"程序，進(jìn)行掃描與結(jié)果的判斷發(fā)出FAM熒光者的基因型為T/T純合子；發(fā)出VIC熒光者的基因型為C/C純合子；發(fā)出兩種熒光者的基因型為C/T雜合子。根據(jù)基因型測定結(jié)果預(yù)測抑郁癥發(fā)生風(fēng)險如實施例l所述。序歹U表<110>北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司<120>多態(tài)性位點基因型預(yù)測抑郁癥發(fā)生及預(yù)后的用途、方法和試劑盒<130〉122212223〈160〉4〈170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉39〈212>DNA<213>人工合成〈400〉1gtaataaaatattatttattttgattttggctcctgctg39<210〉2〈211〉26<212>DNA〈213〉GTAATAAAATATTATTTATTTTGATTTTGGCTCCTGCTG〈400〉2agaaactcaatgactgtgcatcaaga26<210>3<211>15<212>DNA〈213>人工合成<400〉3tcaggcacgacattt15<210〉4<211>15〈212>DNA〈213>人工合成〈400>4tcaggcacaacattt1權(quán)利要求1.5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抑郁癥嚴(yán)重程度的用途。2.5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度的用途。3.5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抗抑郁藥物藥效的用途。4.5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測抗抑郁藥物對抑郁癥核心癥狀藥效的用途。5.如權(quán)利要求3或4所述的用途，其中所述的抗抑郁藥物選自5-羥色胺再攝取抑制劑、選擇性5-HT及NE再攝取抑制劑、5-HT受體拮抗劑/再攝取抑制劑、NE及特異性5-HT能抗抑郁藥。6.如權(quán)利要求l一4中任一項所述的用途，其中所述5-HTT的多態(tài)性位點基因型至少包含13C/T多態(tài)性位點。7.如權(quán)利要求6中所述的用途，其中所述5-HTT基因的多態(tài)性位點基因型進(jìn)一步包含與13C/T多態(tài)性位點存在連鎖不平衡的多態(tài)性位點，包括無義突變位點、錯義突變位點以及位于基因內(nèi)含子部位、基因調(diào)節(jié)部位的多態(tài)性位點。8.如權(quán)利要求6中所述的用途，其中(1)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥嚴(yán)重程度較重；(2)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥嚴(yán)重程度較輕。9.如權(quán)利要求6中所述的用途，其中(1)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度較重；(2)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度較輕。10.如權(quán)利要求6中所述的用途，其中(1)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測抗抑郁藥的藥效較好；(2)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測抗抑郁藥的藥效較差。11.如權(quán)利要求6中所述的用途，其中(1)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較好；(2)所述5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較差。12.通過測定來自受試者的生物樣品中5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點基因型，預(yù)測個體抑郁癥患病嚴(yán)重程度、預(yù)測抗抑郁藥的藥效的方法，其中當(dāng)5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較重、服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較好；當(dāng)5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較輕、服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較差。13.如權(quán)利要求12所述的方法，從所述生物樣品中通過差異核酸分析技術(shù)的測定5-HTT基因的基因型。14.如權(quán)利要求12所述的方法，測定5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點基因型使用選自以下的差異核酸分析技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR-等位基因特異性寡核苷酸探針法、PCR-序列特異寡核苷酸法、測序法、PCR-序列特異性引物法、PCR-熒光法、PCR指紋圖法、寡核苷酸連接分析、熒光能量共振轉(zhuǎn)移的檢測法、生物芯片、核酸芯片、質(zhì)譜技術(shù)、基因掃描、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、酶或化學(xué)錯配切割法、Taqman生物檢測方法、核酸分子雜交技術(shù)、納米技術(shù)。15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的生物樣品選自血液樣品、體液樣品、組織樣品和培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選的，所述生物樣品為血液樣品。16.用于預(yù)測抑郁癥患病程度或抗抑郁藥藥效的試劑盒，其中當(dāng)5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較重、服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較好；當(dāng)5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較輕、服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較差。17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測生物樣品中5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點基因型的多態(tài)性分型寡核苷酸探針和進(jìn)行檢測的反應(yīng)體系。18.如權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述寡核苷酸探針能特異地與含有所述5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點的核酸雜交。19.如權(quán)利要求17-18任一項的試劑盒，其中所述寡核苷酸探針包括包含SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的探針。20.如權(quán)利要求16的試劑盒，所述試劑盒包括用于擴(kuò)增含5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點的5—HTT基因片段的特異性引物、能夠特異性識別并切斷所述位點處特異性核酸序列的限制性內(nèi)切酶及其緩沖液。21.如權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述特異性引物如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。22.如權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述限制性內(nèi)切酶為AvaII。23.如權(quán)利要求20-22任一項的試劑盒，其中所述試劑盒還包括核酸提取試劑、PCR反應(yīng)試劑和陽性對照模板。24.如權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述PCR反應(yīng)試劑含有四種脫氧單核苷酸、耐熱DNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液，所述陽性對照模板包括含有5-HTT基因的13C/T多態(tài)性位點的純合野生型、雜合型和/或純合突變型序列的PCR產(chǎn)物、克隆核酸、克隆質(zhì)粒、直接合成的核酸序列或基因組DNA。25.—種試劑盒，其是一種基因芯片，其中包含用于測定5-HTT的多態(tài)性位點基因型的多態(tài)性分型寡核苷酸探針；其中所述基因芯片優(yōu)選為DNA芯片。全文摘要本發(fā)明涉及5-羥色胺轉(zhuǎn)運蛋白(5-HTT)基因13C/T多態(tài)性位點基因型用于預(yù)測個體抑郁癥患病嚴(yán)重程度、抑郁癥核心癥狀患病嚴(yán)重程度、預(yù)測抗抑郁藥的藥效和抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效的用途、方法和試劑盒。其中，當(dāng)5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13TT純合型時，預(yù)測個體抑郁癥嚴(yán)重程度較重，抑郁癥核心癥狀嚴(yán)重程度較重，服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較好，抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較好；當(dāng)5-HTT13C/T多態(tài)性位點基因型為13CC純合型或13CT雜合型時，預(yù)測個體抑郁癥患病程度較輕，抑郁癥核心癥狀患病程度較輕，服用抗抑郁藥后抗抑郁藥的藥效較差，抗抑郁藥對抑郁癥核心癥狀的藥效較差。文檔編號G01N21/64GK101338337SQ20071011827公開日2009年1月7日申請日期2007年7月4日優(yōu)先權(quán)日2007年7月4日發(fā)明者多于,平劉,徐希平,燕王,玉王申請人:北京華安佛醫(yī)藥研究中心有限公司