高粱抗白粉病基因快速鑒定的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是借助于高粱測(cè)序全基因組序列，利用植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信 息學(xué)和候選基因策略等方法快速鑒定高粱白粉病基因，該專利主要涉及到高粱全基因組序 列的下載，候選基因的鑒定，基因的比對(duì)，聚類等手段，進(jìn)而鑒定出白粉病基因，屬于植物生 物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 白粉病是由真菌引起的一種病害，在世界范圍分布很廣，對(duì)多種植物有極大的危 害，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重點(diǎn)控制的病種。植物感染白粉病后，首先在葉片上產(chǎn)生褪綠或黃色斑， 隨后葉面出現(xiàn)白色或灰白色粉狀物，然后在病變部位形成許多黑色小顆粒，最后引起葉面 破裂、壞死，導(dǎo)致減產(chǎn)。白粉病是高粱的一種新病害。近幾年，高粱的種植面積迅速擴(kuò)大，分 布也越來越廣。但由于連茬的增加，矮桿品種的推廣，種植密度的增加以及干旱天氣的影 響，白粉病在我國黑龍江、吉林、遼寧、安徽、天津、湖南、湖北、貴州、山西等高粱主產(chǎn)區(qū)由南 到北頻頻發(fā)病，造成減產(chǎn)。
[0003] 目前生產(chǎn)中對(duì)高粱白粉病的主要防治方法是合理輪作和噴灑殺菌劑，但由于酒文 化極強(qiáng)的地域性，高粱一般都在本地消化，輪作會(huì)影響產(chǎn)量；另外過多使用殺菌劑會(huì)影響高 粱品質(zhì)，還會(huì)危害環(huán)境安全，因此推廣選育抗病品種是防治高粱白粉病最安全、環(huán)保和高效 的控制策略。但由于高粱不是主要的糧食作物，再加上其基因組較大，使得研究進(jìn)展緩慢。 因此，挖掘抗病基因可加快抗病品種的選育進(jìn)程。
[0004] MLO型抗病基因是植物特異的一類抗病基因。研究者最早發(fā)現(xiàn)ML0(Mildew resistancelocus 2)基因?qū)Π追鄄】剐允鞘加?937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集 了很多品種的大麥，其中的兩個(gè)株系對(duì)白粉病菌（Blumeriagraminisf.sp.hordei)所有已 知的生理小種都具有高效抗性。進(jìn)一步研究表明，大麥中MLO基因的隱性突變mlo可以使大 麥對(duì)幾乎所有已知大麥白粉病菌的生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。最近，研究者發(fā)現(xiàn)很多 植物的抗白粉病基因都是MLO型基因控制，如番茄，豌豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等等。 因此挖掘植物中的MLO型抗病基因?qū)χ参锟拱追鄄∮N具有重要的作用。
[0005] 目前，常用挖掘抗病基因常用的方法有圖位克隆，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等方法。但是由于高 粱的基礎(chǔ)研究不夠深入，因此利用這些方法不僅時(shí)間長(zhǎng)而且很難準(zhǔn)確地克隆這些基因。因 此，如何快速鑒定高粱中的MLO型抗病基因?qū)⒊蔀楦吡豢拱追鄄∮N的重要前提。
[0006] 植物比較基因組學(xué)（Comparative Genomics)是基于基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，對(duì)已知的 基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式植 物基因組與其它植物基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆其他植物基因，揭示 基因功能和分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。本專利所采用的方法及思 路：模式植物擬南芥基因組研究已經(jīng)揭示了 MLO型基因的功能，利用基因其順序上的同源 性克隆高粱MLO型抗病基因，根據(jù)模式植物擬南芥實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上的優(yōu)越性和已知MLO型抗病 基因的特點(diǎn)，快速"捕捉"高粱抗白粉病基因。近年來，高粱基因組測(cè)序的完成為我們快速 挖掘高粱白粉病基因提供了條件。本專利介紹了以高粱全基因組序列為前提，結(jié)合比較基 因組學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和候選基因策略等知識(shí)，快速挖掘白粉病基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過結(jié)合植物比較基因組學(xué)、植物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和 生物信息學(xué)等知識(shí)，快速挖掘高粱抗白粉病基因。其結(jié)果一方面可用于高粱白粉病基因緊 密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據(jù)。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 主要原理：第一個(gè)植物抗白粉病基因（MLO)是從大麥中克隆的，研究發(fā)現(xiàn)此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數(shù)NBS(nucleotide-binding site)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的都是MLO型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗(yàn)證實(shí)MLO 型抗病基因已經(jīng)成為植物特有的一類抗白粉病基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物MLO類型基因是一 個(gè)基因家族；而且對(duì)來源于不同物種的MLO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類MLO基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。高粱基因組測(cè)序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經(jīng)測(cè)序的高粱全基因組中MLO基因家族和已經(jīng)克隆的MLO白粉病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系以及對(duì)于維持白粉病基因 MLO重要功能的氨基酸保守性來鑒定高粱白粉病基因。
[0011] 主要步驟如下：
[0012] 1)高粱全基因組序列的下載及其MLO型基因的采集
[0013] 首先從高粱測(cè)序基因組數(shù)據(jù)庫（http : // WWW. phytozome. net / search. php)下載高粱全基因組序列；使用"DNAT00LS"軟件對(duì)獲得的高粱全基因組氨基酸序列數(shù) 據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，然后用Pfam數(shù)據(jù)庫（蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http: //pfamjanelia.org/ search / sequence)中的隱馬爾可夫模型（HMM)對(duì)MLO結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的高 粱全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast p (E-Value=O. 001)序列比對(duì)，初步篩選出候選基 因序列。其次，利用已經(jīng)公布的MLO型基因序列，對(duì)高粱基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲 得候選基因序列。
[0014] 2)高粱MLO型基因家族的鑒定
[0015] 將上述結(jié)果中得到的同源核苷酸序列的候選基因，通過Pfam(E-Value=LO)進(jìn)行 分析，去除無 'ML0'結(jié)構(gòu)域的基因序列（圖1)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. 1軟件 提供的ClustalW工具（多序列比對(duì)程序）進(jìn)行多序列比對(duì)，去除重復(fù)序列。
[0016] 3)通過植物MLO型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定候選的高粱MLO型白粉病基因
[0017] 由于先前的研究已經(jīng)證明，雙子葉植物MLO型白粉病基因位于植物MLO基因系統(tǒng) 發(fā)育樹同一區(qū)組，因此在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中，我們把擬南芥的MLO型基因家族和一些其 他作物的MLO型抗白粉病基因和高粱MLO型基因一起聚類分析，以獲得高粱抗白粉病基因 (圖 2)。
[0018] 4)高粱白粉病基因與已知的植物MLO白粉病基因的比對(duì)
[0019] 利用Bi〇XM2. 6軟件將高粱MLO型白粉病基因和擬南芥、番茄、豌豆、大麥的MLO白 粉病基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成Fasta格式的文件，將這些文件導(dǎo)入Bi 〇Edit7. 0軟件，運(yùn)用 此軟件中Clustal軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區(qū)域的保 守性。從而進(jìn)一步鑒定高粱候選的白粉病基因（圖3)。
[0020] 本發(fā)明的積極效果：
[0021] 1)縮短了高粱白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規(guī)方 法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時(shí)耗力、效率低，且難以成功。本 發(fā)明基于植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)方法快速挖掘高粱白粉病基因，不僅可以 縮短時(shí)間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0022] 2)高粱（Sorghumbicolor)屬于禾本科高粱屬，是重要作物之一。由于高粱遺傳基 礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源多樣性低，因此通過常規(guī)的分子標(biāo)記（RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鑒定高 粱白粉病基因比較困難。通過鑒定的候選白粉病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記（SNP、 SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子標(biāo)記輔助選擇，進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可 以縮短育種年限，提高育種效率。
[0023] 3)為闡述高粱抗白粉病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。高粱抗白粉病基因的鑒定，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)等研究 抗白粉病的分子機(jī)制提供了基因資源，有利于快速闡述高粱抗白粉病的作用機(jī)理。
【附圖說明】
[0024] 圖1高粱MLO基因的鑒定；
[0025] 本圖顯示的是11個(gè)MLO型基因鑒定結(jié)果，每一個(gè)基因都含有一個(gè)'ML0'保守結(jié)構(gòu) 域。
[0026] 圖2植物MLO基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析及其高粱MLO型白粉病基因的鑒定；
[0027] 擬南芥是植物科學(xué)研究的模式植物，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥的15個(gè)MLO型 基因（其中3個(gè)基因是白粉病基因：AtML002, AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 (SlMLO)、大麥白粉病基因（HvMLO和HvML002)和豌豆的白粉病基因（PsMLO)被選擇用來和 高粱MLO型基因聚類分析。共鑒定出1個(gè)高粱候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標(biāo)記的 基因就是候選商梁白粉病基因。
[0028] 圖3高粱MLO型白粉病基因的比對(duì)分析；
[0029] 1個(gè)高粱白粉病基因與大麥（HvMLO)、番茄（SlMLO)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病 基因（AtML002, AtML006和AtML012)進(jìn)行比對(duì)，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基 和區(qū)域的保守型。圖中TM1-TM7表示高粱MLO型白粉病基因的7個(gè)轉(zhuǎn)模區(qū)域；黑色圓點(diǎn)表 示白粉菌侵染重要的氨基酸殘基；CaMBD表示鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)；I和II表示對(duì)白粉菌侵染 重要的氨基酸區(qū)域。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 抗病基因的鑒定在作物抗病遺傳理論研究和抗病品種選育中具有重要的作用。本 方法可以快速鑒定出高粱白粉病基因。具體實(shí)施過程如下：
[0031] 1)高粱MLO型基因的采集
[0032] 為了獲得高粱全部的MLO型基因家族成員，我們首先以擬南芥的MLO型基因，番 茄、豌豆、辣椒、薔薇、辣椒、百脈根的抗白粉病MLO基因序列構(gòu)建HMM模型，從高粱基因組序 列中檢索MLO型基因；其次以不同作物中已經(jīng)發(fā)表的MLO基因序列作為靶序列（來自DFCI 數(shù)據(jù)庫：TC171015, TC267529, DFCI :TC327983, TC289653, TC312087, TC132500, TC133436， TC317623, TC317025, TC315947, TC325903, TC315944, TC315912, TC322759, TC322059, TC330654, TC282713, TC293173, TC