專利名稱：一種abo血型基因分型的pcr-sbt方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因分型檢測方法，尤其涉及一種用于ABO血型基因分型的分子生物 學(xué)檢測方法，本發(fā)明還涉及該方法所應(yīng)用的試劑。
背景技術(shù)：
人類ABO基因位于9號染色體(9q34. 1 34. 2)，由A、B和0三個復(fù)等位基因控制， 包含長度大小從28 688bp不等的7個外顯子和長度約為19514bp的6個內(nèi)含子，總長大 約為18 20kb。其基因編碼產(chǎn)物是糖基轉(zhuǎn)移酶，多數(shù)編碼序列(1062bp中823bp)位于第6 和第7外顯子上，負(fù)責(zé)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的催化區(qū)域。這些轉(zhuǎn)移酶控制ABO血型抗原的生物合 成，從而決定其血型。ABO血型的其它等位基因DNA序列高度保守，與AlOl的DNA序列緊密 相關(guān)，僅有幾個堿基替換或單個堿基缺失。對漢族人群中ABO血型進行頻率調(diào)查發(fā)現(xiàn)，主要 為A102、B101、001、002這幾種等位基因。A102等位基因與AlOl等位基因相比只是在467位 的單個堿基替換(C/T，Pro/Leu)，兩者翻譯的糖基轉(zhuǎn)移酶活力沒有顯著性差異。BlOl基因僅 在297、526、657、703、796、803、930和1096位堿基8個位置與AlOl有改變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶 多肽鏈上有 4 個氨基酸替代C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A (Leu/Met)、G803C(Gly/ Ala)。001等位基因與AlOl的差異是第261位核苷酸G缺失，引起了閱讀框移動，在351至 354位置產(chǎn)生終止密碼子，肽鏈合成在117位氨基酸終止，產(chǎn)生一條無催化能力的短肽鏈。除 此之外，人群中還存在大量的亞型和罕見基因型，通常也是由于單個核苷酸變異形成的?，F(xiàn)有技術(shù)中，人類ABO血型檢測方法主要有兩種一是經(jīng)典的血清學(xué)方法，二是基因分 型方法。血清學(xué)方法具有簡單實用等特點，但也存在一定的局限性，首先需要新鮮紅細(xì)胞樣品，對 樣本要求較高；其次方法檢測的范圍較窄，只能對ABO血型中的常見血型進行定型，對于一些亞 型標(biāo)本以及罕見樣本，在血型檢測時易出現(xiàn)正反定型不符，難以定型或定型錯誤的現(xiàn)象，且不能 確定其具體基因型?；蚍中偷姆椒ㄔ谀撤N程度上彌補了經(jīng)典血清學(xué)方法在這方面的不足。目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR_序列特異性引物)，但該 方法需要進行多管擴增，需有進一步改進的基因掃描技術(shù)可進行單一管擴增。并且PCR-SSP 方法在設(shè)計引物時只能針對某些具有區(qū)別性的特異性位點進行設(shè)計，因此只能對常規(guī)的 ABO血型進行基因分型，對于一些特殊的亞型或存在的新突變位點則難以明確。而ABO血型 PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR測序的分型技術(shù))分型方法可以克服前兩 者的上述缺陷和局限性。但現(xiàn)階段的ABO血型PCR-SBT分型方法主要針對多態(tài)性位點比較 集中的6、7號外顯子的測定來確定其基因型，而對第1-5號外顯子不進行測序，尤其是含有 起始密碼子的1號外顯子，其GC含量比較高，PCR擴增較難獲得，這種操作方法存在兩個缺 陷第一，由于6、7號外顯子單核苷酸多態(tài)性非常集中，而各個ABO血型之間的差異可能僅 有單個或幾個核苷酸的變異所引起，容易造成SNP位點(單核苷酸多態(tài)性位點)的漏檢，引 起血型基因型的誤判。第二，第1-5號外顯子以及所包含的內(nèi)含子中同樣存在大量的基因 信息，對確定樣本基因型和解決ABO血型相關(guān)問題具有重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于AB。血型分型的PCR—SBT方法，以克服現(xiàn)有血型分型技術(shù)中的上述缺陷。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
它包括下述步驟
(1)制備人基因組])NA；
(2)設(shè)計擴增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增人基因組])NA中AB?；蛲怙@子l1外顯子2—41外顯子5—7的三個片段，其中l(wèi)號外顯子采用含GC緩沖液的PCR擴增；
(3)將步驟(2)得到的擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化；
(4)設(shè)計測序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)；
(5)將步驟(4)得到的測序產(chǎn)物進行醋酸鈉一乙醇沉淀法純化，進行毛細(xì)管電泳測序；
(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
本發(fā)明另一個所要解決的技術(shù)問題是提供上述方法所用的試劑。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括3對寡核苷酸擴增引物和18條寡核苷酸測序引物，所述3對寡核苷酸擴增引物分別擴增AB。血型基因的l號外顯子12—4號外顯子以及5—7號外顯子，所述18條寡核苷酸測序引物用于測序分析。
所述3對寡核苷酸擴增引物序列如下
l號外顯子擴增引物
Ml 3一E lF5’一GTAAAA(GACGGCCAGGCCGTCCCTTCCTAGCAG一3’
M13一ElR5’一CAG(；AAA(AGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC一3’
2—4號外顯子擴增引物
E24F25’一GAGGGTGAGTGATGTGATT一3’
E24Rl5’一ACTGG(2AA(；AGGGACTAA(一3’
5—7號外顯子擴增引物
E57F5’一CTGCTAAAA(CAAGGGCG一3’
E7R5’一CTGCCCACAGT(3AATTGAGA一3’
所述18條寡核苷酸測序引物序列如下
外顯子l片段的測序引物
Ml 3F5’一GTAAAA(GACGGCCA一3’
Ml 3R5’一CAG(}AAA(AGCTATGAC一3’
外顯子2—4片段的測序引物
5 18F5’ 一aCCaCCCtCCtgCCCaCC一3’
252]F’5’一aCagaaggtCCCagaaCCaaga一3’
l 7 lF5’一gggtCaCCtggataCCtCtgg一3’
682]F’5’一CCtCtgttgggaCCaCtCttg一3’
306]F’5’一atCgCCaCagtgatggttgt七一3’
44lF5’一CCtggg(tCaagtgattCtCC一3’
955]F’5’一ttttatgtCgggctCaaatCaC一3’
外顯子5—7片段的測序引物
工6F5’一GTTCCCGCAGGTCC；AATGT一3’
I6R 5' -GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’E7F 5' -TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3，51R 5 ’ -AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’5IF 5' -CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’6IF1 :5’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3，6IR1 :5’ -CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’6IF2 :5， -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3，6IR2 :5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’本發(fā)明中引物設(shè)計是PCR擴增的關(guān)鍵，有關(guān)引物設(shè)計的方法和軟件均可從英特網(wǎng) 上免費獲得。本發(fā)明所設(shè)計的寡核苷酸引物是根據(jù)Genebank(序列號AC000397)中人類 ABO血型基因序列中包括多態(tài)性位點在內(nèi)的連續(xù)寡核苷酸序列而設(shè)計獲得的。所有引物的 設(shè)計均避開突變位點，以免因位點的漏檢而導(dǎo)致分型的錯誤。本發(fā)明以一對寡核苷酸引物 可以擴增包含幾個外顯子的長片段，使其簡化為3對擴增引物即可保證包含所有外顯子的 有效擴增。1號外顯子含有大量GC堿基，較難獲得有效擴增，同時與其他外顯子之間隔有一 段長片斷內(nèi)含子，因此將其單獨作為一個片段，利用GC緩沖液，保證其有效擴增。5-7號外 顯子含有較多突變位點，同時考慮擴增片段長度及擴增效果，將此3個外顯子合并成一個 片段擴增。余下的外顯子作為單獨的一個片段擴增。擴增引物的設(shè)計避開了 ABO血型抗原 編碼序列的多態(tài)性位點，避免了任何突變點的漏檢從而導(dǎo)致的基因型誤判。測序引物的設(shè) 計能保證清晰準(zhǔn)確測得所擴增片段的全長序列，對部分序列進行雙向測序，從而將樣本進 行精確的基因分型。其中所述1號外顯子擴增引物在其5'包含一段M13通用引物，以保證 GC含量較高的1號外顯子能有效地獲得清晰的測序電泳圖譜。本發(fā)明通過對ABO血型所有外顯子進行全長序列測序，獲得ABO血型相關(guān)外顯子 的全長和部分內(nèi)含子寡核苷酸序列，精確地對其基因進行分型。隨著DNA序列分析儀的普 及，PCR-SBT技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床檢測，如藥物相關(guān)的乙肝病毒變異測序、骨髓移植的HLA 高分辨測序分型等。高通量獲得的所有ABO血型編碼序列精確信息在基因定型，基因多態(tài) 性檢測，基因頻率調(diào)查分析等方面的應(yīng)用受到廣泛重視。本發(fā)明所提供的試劑和方法可作為一種獨立的、應(yīng)用廣泛的鑒定方法，解決了 ABO亞型 的鑒定、疑難血型的判定、新突變位點的發(fā)現(xiàn)、基因之間的重組現(xiàn)象、基因多態(tài)性檢測等問題，發(fā) 揮PCR-SBT對ABO基因定型操作高通量，結(jié)果精確的特點，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的 相關(guān)應(yīng)用受到高度重視，對于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實意義。


圖1為本發(fā)明中檢測樣本的外顯子1 (El)、外顯子2-4(E2_4)、外顯子5_7 (E5_7) 三個片段的PCR擴增電泳圖譜，M為DNA Marker (DL2000, TaKaRa)。圖2為本發(fā)明中對3例檢測樣本中的樣本1 (A102/B101)的1_7號外顯子的全部 測序電泳圖譜。圖3為本發(fā)明中對3例檢測樣本中的樣本2(B(A)02/B101)的1_7號外顯子的全 部測序電泳圖譜。圖4為本發(fā)明中對3例檢測樣本中的樣本3 (B (A) 02/001)的1_7號外顯子的全部測序電泳圖譜。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進一步詳細(xì)說明。實施例一般用抗A和抗B試劑來測定紅細(xì)胞上是否有A抗原和B抗原，確定ABO血型稱為正 定型；用已知有A和B抗原的紅細(xì)胞對血清定型，稱為反定型。正反定型相符，才能避免ABO血 型的誤定。即試驗中紅細(xì)胞有A、B抗原，血清中無A、B抗體，可完全確信這次定型AB型是正確 的。正反定型不符即正定型和反定型的結(jié)果不一致，不能確定其正確的血型。本實施例中樣本 正反定型不符即提示紅細(xì)胞表達A、B抗原，其血清中有抗Al抗體，因此不能定義其血型。本實施例具體以對一例正反定型符合和兩例正反定型不符個體進行ABO血型定 型為例對本發(fā)明內(nèi)容做詳細(xì)說明，本發(fā)明所采用的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法 具體包括以下步驟1、制備人基因組DNA，作為后續(xù)步驟的PCR擴增模板。取待檢全血200μ 1，按照invitrogen DNA isolation試劑盒說明書提取基因組 DNA，利用分光光度計測定基因組濃度和純度。2、合成3對擴增引物和18條測序引物，具體序列見前述發(fā)明內(nèi)容中的序列，不再贅述。將擴增弓丨物用純水稀釋至25 μ M ；準(zhǔn)備La-Taq酶(Lot :CK4501，TaKaRa)、10 X緩沖液 (Lot :CK4501, TaKaRa)、2XGC buffer I (Lot :A2801A，TaKaRa)、dNTP(Lot :CBG4301A，TaKaRa)、純 水，與步驟1所制備的PCR擴增模板按表1、表2和表3所述體系配制PCR擴增體系表1 步驟2中1號外顯子PCR擴增體系 表2 步驟2中2-4號外顯子PCR擴增體系 表3 步驟2中5-7號外顯子PCR擴增體系 用PCR儀(ABI9700)分別按以下程序擴增1號外顯子擴增94°C預(yù)變性lmin，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，67. 5°C退火 30s，引物結(jié)合到模板上，72°C延伸35s，延長所需擴增片段，反應(yīng)35個循環(huán)；72°C，IOmin,擴 增片段充分延伸；2-4號外顯子擴增94°C預(yù)變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，61°C退火 30s,引物結(jié)合到模板上，72°C延伸5min，延長所需擴增片段，反應(yīng)35個循環(huán)；72°C，lOmin， 擴增片段充分延伸；5-7號外顯子擴增94°C預(yù)變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，63. 8°C退 火30s，引物結(jié)合到模板上，72°C延伸3min30s，延長所需擴增片段，反應(yīng)35個循環(huán)；72°C， lOmin，擴增片段充分延伸。3、擴增產(chǎn)物的雙酶切純化。檢測樣本所擴增的3個片段各取2 μ 1 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示， 確定擴增片段的特異性。在剩余的PCR產(chǎn)物中分別加入蝦堿性磷酸酶(SAP，IU/μ 1，Lot M820A, Promega)和核酸外切酶 I (Exo-I，5U/μ l，Lot :CK11011Β，TaKaRa)，利用蝦堿性磷酸 酶(SAP)的DNA 5'端去磷酸化功能以及核酸外切酶I (Exo-I)的單鏈特異性3' -5'核 酸外切酶功能，進行擴增產(chǎn)物純化。在25 μ 1擴增產(chǎn)物體系中加入SAP 2μ 1和Exo-I 1μ 1, 37°C 30min酶切反應(yīng)，80°C 15min酶失活。4、對PCR產(chǎn)物進行測序PCR。將步驟3中純化之后的PCR產(chǎn)物中加入25 μ 1純水稀釋，混勻。測序引物用純水 稀釋至 1. 6 μ Μ，以 BigDye terminator v3. 1 sequencing kit (美國 ABI 公司)試劑按照表 3配制反應(yīng)體系表3 步驟4中PCR產(chǎn)物的PCR測序體系
反應(yīng)體系體積(μ )5 X緩沖液1. 6BigDye mix0. 8測序引物1DNA2H204. 6總體積10 三個樣本以所擴增純化的片段為模板，分別進行18個反應(yīng)，用PCR儀(ABI9700) 按以下程序擴增96°C預(yù)變性lmin，DNA雙鏈充分解開；96°C變性10s，50°C退火5s，測序引物結(jié)合到DNA模板上，60°C延伸4min，延長擴增片段，25個循環(huán)。測序引物濃度為1.6μΜ， 稀釋的上述純化后DNA模板2 μ 1。5、測序擴增PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。將步驟4中測序擴增PCR產(chǎn)物直接用醋酸鈉/乙醇純化法進行純化。直接在PCR 產(chǎn)物中加入Ιμ EDTA (1.25 μ Μ)和25 μ 1醋酸鈉(3Μ)/無水乙醇(1 40)混合液，混勻， 3000g離心30min ；去除上清，加入75%乙醇，3000g離心lOmin，去除上清，酒精揮發(fā)后加入 10 μ 1甲酰胺溶解，95°C變性3min，迅速在冰上冷卻。6、將制備好的產(chǎn)物在ABI 3730測序儀上進行48孔毛細(xì)管高通量電泳測序，所測 序結(jié)果利用SeqScape V2. 5軟件進行序列比對，按照Blood Group Antigen Gene Mutation Database(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/gv/mhc/xslcgi. cgi ？ cmd = bgmut/ systems)數(shù)據(jù)庫序列確定ABO血型的基因型。如圖2、3、4所示，圖2的樣本1為正反定型符合的正常AB血型基因型結(jié)果，圖3的 樣本2和圖4的樣本3為兩例正反定型不符個體AB血型基因型結(jié)果，即用血清學(xué)方法難以 判斷其血型的疑難血型。3730測序儀毛細(xì)管電泳圖譜分析結(jié)果顯示，樣本1基因為261G/G、 297A/G(R)、467C/T(Y)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/C、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、 930A/G(R)，基因型定為 A102/B101。樣本 2 基因為 261G/G、297G/G、526G/G、657T/T、700C/ G(S)、703A/A、796A/A、803C/C、930A/A，基因型定為 B(A)02/B101。樣本 3 基因為 261G/del、 297A/G(R)、526C/G(S)、657C/T(Y)、700C/G(S)、703A/G(R)、796A/C(M)、803G/C(S)、930A/ G (R)，基因型定為B (A) 02/001。其中前面的數(shù)字代表堿基序列位置，括號中字母代表所對應(yīng) 雜合堿基的縮寫。樣本1表現(xiàn)為正反定型符合的正常AB型。樣本2和樣本3的表現(xiàn)為正 反定型不符的A2B。AB型可分為AlB和A2B兩種亞型，本實施例中此兩例正反定型不符樣 本所表現(xiàn)的A2B型屬于一種罕見亞型，可引起正反定型不符，難以判斷其正確的血型，而大 部分人群表現(xiàn)為普通AlB型。對三例樣本的測序圖譜比較分析，B (A) 02等位基因700位堿 基為G，703位堿基為A ；A102.001基因700位堿基為C，703位堿基為G ；BlOl基因700位堿 基為C，703位堿基為A，可見其700位G是其特征堿基，作為罕見基因B (A) 02的一個標(biāo)志。 本實施例將疑難血型準(zhǔn)確的加以定型。所以，采用本發(fā)明提供的ABO血型基因分型的PCR-SBT方法可以通過對ABO血型 所有外顯子進行全長序列測序，獲得ABO血型相關(guān)外顯子的全長和部分內(nèi)含子寡核苷酸序 列，可以精確地對其基因型進行分型，從而解決了 ABO亞型的鑒定、疑難血型的判定、新突 變位點的發(fā)現(xiàn)、基因之間的重組現(xiàn)象、基因多態(tài)性檢測等問題，可發(fā)揮PCR-SBT對ABO基因 定型操作高通量，結(jié)果精確的特點，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用受到 高度重視，對于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實意義。
權(quán)利要求
一種ABO血型基因分型的PCR SBT方法，其特征在于它包括以下步驟(1)制備基因組DNA；(2)設(shè)計擴增引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別擴增人基因組DNA中ABO基因外顯子1、外顯子2 4、外顯子5 7的三個片段，其中1號外顯子采用含GC緩沖液的PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化；(4)設(shè)計測序引物，將步驟(3)得到的純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)；(5)將步驟(4)得到的測序產(chǎn)物進行醋酸鈉 乙醇沉淀法純化，進行毛細(xì)管電泳測序；(6)將步驟(5)獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。
2.如權(quán)利要求1所述的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟 (2)中，三個片段擴增的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下其特征在于步驟(2)中，外顯子 1 擴增體系，以 25μ 1 計，包括2XGC buffer I 12. 5 μ 1,2. 5mM dNTP 2μ1、每 條引物終濃度均為0. 5ymol/L、La-Taq DNA聚合酶1. OUUOOng/μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余 量以純水補足；外顯子2-4擴增體系，以25 μ 1計，包括10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 2μ1，每 條引物終濃度均為 0. 5 μ mol/L, Mg2+ 終濃度 2. Ommo 1/L, La-Taq DNA 聚合酶 1. 0U, IOOng/ μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余量以純水補足；外顯子5-7擴增體系，以25 μ 1計，包括10XPCR緩沖液2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 2μ1，每 條引物終濃度均為 0. 5 μ mol/L, Mg2+ 終濃度 2. Ommo 1/L, La-Taq DNA 聚合酶 1. 0U, IOOng/ μ 1 DNA模板2. 5 μ 1，余量以純水補足；擴增程序為1號外顯子擴增94°C預(yù)變性lmin，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，67. 5°C退火30s， 引物結(jié)合到模板上，72°C延伸35s，延長所需擴增片段，反應(yīng)35個循環(huán)；72°C，IOmin,擴增片 段充分延伸；2-4號外顯子擴增94°C預(yù)變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，61°C退火30s， 引物結(jié)合到模板上，72°C延伸5min，延長所需擴增片段，反應(yīng)35個循環(huán)；72°C，lOmin，擴增 片段充分延伸；5-7號外顯子擴增94°C預(yù)變性5min，DNA雙鏈充分解開；94°C變性30s，63. 8 °C退 火30s，引物結(jié)合到模板上，72°C延伸3min30s，延長所需擴增片段，反應(yīng)35個循環(huán)；72°C， lOmin，擴增片段充分延伸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述 步驟(2)和步驟(4)中的引物分別為3對寡核苷酸擴增引物和18條寡核苷酸測序引物，所 述3對寡核苷酸擴增引物分別擴增ABO血型基因的1號外顯子、2-4號外顯子以及5-7號外 顯子，所述18條寡核苷酸測序引物用于測序分析；所述3對寡核苷酸擴增引物序列如下1號外顯子擴增引物M13-E1F :5’ -GTAAAACGACGGCCA GGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’M13-E1R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’2-4號外顯子擴增引物E24F2 :5’ -GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’ E24R1 :5’ -ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’ 5-7號外顯子擴增引物 E57F :5’ -CTGCTAAAACCAAGGGCG-3， E7R 5' -CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3‘ 所述18條寡核苷酸測序引物序列如下 外顯子1片段的測序引物 Ml3F 5 ’ -GTAAAACGACGGCCA-3’ Ml3R 5 ’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’ 外顯子2-4片段的測序引物 518F -Bccaccctcctgcccacc-S' 252F -acagaaggtcccagaaccaaga-3‘ 171F -gggtcacctggatacctctgg-S' 682F -cctctgttgggaccactcttg-S' 306F -atcgccacagtgatggttgtt-3‘ 441F -cctgggctcaagtgattctcd' 955F -ttttatgtcgggctcaaatcac-S' 外顯子5-7片段的測序引物 I6F :5’ -GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3， I6R :5’ -GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’ E7F :5，-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3‘ 51R 5 ’ -AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’ 5IF :5，-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3， 6IF1 :5’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3， 6IR1 :5’ -CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3’ 6IF2 :5’ -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3， 6IR2 :5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3，。
4.如權(quán)利要求1所述的一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于所述步驟 (4)中純化所需的兩種酶為蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I。
5.一種ABO血型基因分型的PCR-SBT方法所用的試劑，其特征在于它包括3對寡核苷 酸擴增引物和18條寡核苷酸測序引物，所述3對寡核苷酸擴增引物分別擴增ABO血型基因 的1號外顯子、2-4號外顯子以及5-7號外顯子，所述18條寡核苷酸測序引物用于測序分 析；所述3對寡核苷酸擴增引物序列如下 1號外顯子擴增引物M13-E1F :5’ -GTAAAACGACGGCCA GGCCGTCCCTTCCTAGCAG-3’ M13-E1R :5’ -CAGGAAACAGCTATGACCGAGGAGAGGCTGGAGAC-3’ 2-4號外顯子擴增引物 E24F2 :5’ -GAGGGTGAGTGATGTGATT-3’E24R1 :5’ -ACTGGCAAGAGGGACTAAG-3’ 5-7號外顯子擴增引物 E57F :5’ -CTGCTAAAACCAAGGGCG-3， E7R 5' -CTGCCCACAGTGAATTGAGA-3‘所述18條寡核苷酸測序引物序列如下外顯子1片段的測序引物M13F5’ -GTAAAACGACGGCCA-3’M13R5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，外顯子2-4片段的測序引物518F5，_accaccctcctgcccacc_3’252F5，-acagaaggtcccagaaccaaga-3171F5，-gggtcacctggatacctctgg-3'682F5，一cctctgttgggaccactcttg一3’306F5，-atcgccacagtgatggttgtt-3‘441F5，一cctgggctcaagtgattctcc一3’955F5，-ttttatgtcgggctcaaatcac-3外顯子5-7片段的測序引物I6F 5，-GTTCCCGCAGGTCCAATGT-3’I6R 5，-GCTGCATGAATGACCTTTCC-3’E7F 5，-TCTGCTGCTCTRAGCCTTCC-3，5IR 5，-AAACCAACCAGAGGCAAATG-3’5IF 5，-CCTGTCCCTTTGTTCTCCAA-3’6IF15’ -GGGTAGAGACCCAGGCAGTG-3’6IR15，-CTCTGCACCCTAGAGCTTCC-3 ‘6IF25’ -CCCAGACACCAAAGGAAGTG-3’6IR2；5’ -CCACCATGAAGTGCTTCTCC-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于ABO血型分型的PCR-SBT方法，它包括下述步驟制備人基因組DNA；擴增ABO基因外顯子1、外顯子2-4、外顯子5-7的片段；得到擴增產(chǎn)物進行雙酶切純化；將純化產(chǎn)物進行測序PCR反應(yīng)；將測序產(chǎn)物進行醋酸鈉-乙醇沉淀法純化，進行毛細(xì)管電泳測序；將獲得的序列通過軟件分析，確定其基因型。本發(fā)明解決了ABO亞型的鑒定、疑難血型的判定、新突變位點的發(fā)現(xiàn)、基因之間的重組現(xiàn)象、基因多態(tài)性檢測等問題，發(fā)揮PCR-SBT對ABO基因定型操作高通量，結(jié)果精確的特點，在臨床輸血醫(yī)學(xué)研究和遺傳學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用受到高度重視，對于醫(yī)學(xué)研究單位、藥學(xué)研究和試劑開發(fā)單位具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12Q1/68GK101921834SQ201010174588
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者嚴(yán)力行, 朱發(fā)明, 許先國 申請人:浙江省血液中心