Hcv基因型4復制子的制作方法
【專利摘要】提供了基因型4丙型肝炎病毒（HCV）的復制子。這些復制子包括產(chǎn)生HCV的體外復制能力的適應性變異。還提供了基因型4復制子的制備方法和利用這些復制子篩選抗病毒藥劑的方法。
【專利說明】HCV基因型4復制子
[0001]相關申請的相互引用
[0002]根據(jù)美國法典第35篇第119 Ce)節(jié)，本申請要求享有2011年7月6日提交的美國臨時申請序列號61/504，853、2011年7月20日提交的序列號61/509，984、以及2012年I月23日提交的序列號61/589，789的權益，其中的每一個的內(nèi)容均通過引用以其整體并入本公開。
【技術領域】
[0003]本公開涉及基因型4的丙型肝炎復制子(replicon)，以及制備和使用該復制子的方法。
【背景技術】
[0004]慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然是全世界約1.6億感染者的巨大全球健康負擔。目前的護理標準是聚乙二醇干擾素加利巴韋林(ribavirin)的24-48周療程。由于此治療方案的局部療效及較差的耐藥性，新的抗病毒藥劑的開發(fā)和研制一直在緊張的進行中。最近，這些努力以FDA審核批準兩種NS3蛋白酶抑制劑(波普瑞偉和特拉匹韋)與聚乙二醇干擾素和利巴韋林聯(lián)合使用以用于治療慢性基因型IHCV感染而告終。許多其它抑制劑正處于進一步臨床開發(fā)中，然而，大多數(shù)還是被研制用于治療基因型I感染。
[0005]HCV是一種正鏈RNA病毒，顯示極大的遺傳多樣性。已報道有6種主要基因型(SP基因型1-6)以及多種亞型(如基因型la、lb、lc等)?；蛐?、2和3具有世界范圍的分布。基因型Ia或Ib通常主要在北美、南美、歐洲和亞洲。然而，基因型2和3在這些地區(qū)也是常見的，并且可構成20-50%的感染。基因型4a主要在中東和許多非洲國家；高達15%的埃及人口感染有HCV，并且93%的感染是基因型4。基因型5在南非很普遍，而基因型6在亞洲更常見。盡管多數(shù)大陸 和國家具有一種“主要”基因型，但感染的人群幾乎普遍是多種基因型的混合感染。此外，由于大規(guī)模移民和普遍的靜脈用藥，HCV感染的地理分布和多樣性(流行病學)在不斷演變。例如，基因型4a已明顯傳播到歐洲中部和北部。這就帶來了臨床挑戰(zhàn)，因為對于直接抗病毒藥物和包括當前護理標準的免疫調(diào)節(jié)療法兩者，各種基因型的響應不同，這是有據(jù)可查的。
[0006]HCV復制子是來源于HCV基因組的自復制RNA序列，并且一直是作為分子病毒學研究和藥物研發(fā)的主要工具(workhorse)。迄今為止，已由兩種基因型和三種亞型(基因型la、lb和2a)建立了復制子。這些復制子在藥物研發(fā)和改進的多個方面都是極其重要的，包括新型抑制劑類型的識別、臨床候選藥物的優(yōu)化和臨床耐藥性的表征。最近，研發(fā)對所有主要HCV基因型有效的新一代藥物的興趣正在持續(xù)增長。理想的是，對“泛基因型(pan-genotypic)”藥物和治療方案的審批將極大地簡化HCV的治療。
[0007]尋求泛基因型治療方案的一個關鍵步驟將是研制使得能夠研究所有主要基因型和亞型的體外工具。然而，來源于其它主要基因型(即除基因型la、Ib或2a以外的那些基因型)序列的復制子至今還未產(chǎn)生。尤其是，盡管基因型4HCV在中東、北非和歐洲的世界范圍內(nèi)流行，然而基因型4復制子至今未被描述。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過將亞基因組基因型4cDNA轉(zhuǎn)錄和電穿孔至HCV允許細胞系(受納細胞系，permissive cell line)可得到穩(wěn)定復制基因型4復制子的克隆細胞系。與野生型病毒對比，已從這些克隆物中識別了適應性變異(adaptive mutation)。當通過定點誘變改造(engineer)這些變異并引入到細胞系中，隨之而來的是HCV基因型4的復制。
[0009]對于基因型4，這些適應性變異位于NS3 (T343K/R、A200E、或T511K)、NS4A (Q34K/R或E52V)、或NS5A (L179P)中。強健(穩(wěn)健，robust)基因型4復制子體系的建立為促進藥物開發(fā)和研制工作提供了有力工具。
[0010]因此，本發(fā)明的一個實施方式提供了能夠在真核細胞中復制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA構建體，其中RNA序列包括5’ NTR,內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，編碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一種或多種的序列，以及3’ NTR0
[0011]一方面，構建體包括NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一個或多個適應性變異。非限制性實例包括(1)在2204位上的異亮氨酸，(2)在NS3中的殘基200上的谷氨酸、殘基343上的賴氨酸或精氨酸、殘基511上的精氨酸、或它們的組合，(3)在NS4A中的殘基34上的賴氨酸或精氨酸、殘基52上的纈氨酸、或它們的組合，或者(4)在NS5A中的殘基179上的脯氨酸。還設想了構建體包括至少2個、或者可替換的3個或4個適應性變異。一方面，適應性變異來自不同的基因。在一些方面，構建體是亞基因組或全長HCV復制子。
[0012]此外，還提供了轉(zhuǎn)錄為RNA構建體的DNA、包括RNA構建體的病毒顆粒、以及含有這種DNA或RNA的細胞。
[0013]在一個實施方式中，還提供了包括一個或多個相應適應性變異的單獨的NS3、NS4A、或NS5A蛋白。還提供了編碼這些蛋白的多核苷酸和特異性識別這些蛋白的抗體。
[0014]在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了一種包括基因型4丙型肝炎病毒(HCV)RNA的分離細胞，其中基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA是在細胞中復制的。一方面，在細胞中不存在編碼RNA的DNA構建體。另一方面，細胞包括至少10個拷貝的RNA，或者可替換地至少約 100、500、1000、2000、5000、10，OOOUxlO5, IxlO6、IxlO7, IxlO8 或 IxlO9個拷貝的 RNA。在這些方面中的任一個中，RNA可以是亞基因組HCV序列或全長HCV序列，并且可以包括如上所述的一個或多個適應性變異。
[0015]一方面，細胞是哺乳動物細胞，其可以是，例如，肝瘤細胞，特別是Huh71C細胞。
[0016]還提供了提高基因型4HCV病毒RNA在真核細胞中的復制能力的方法，包括以下各項中的一個或多個:(a)用谷氨酸取代NS3的殘基200，(b)用賴氨酸或精氨酸取代NS3的殘基343，(c)用精氨酸取代NS3的殘基511，(d)用賴氨酸或精氨酸取代NS4A的殘基34，Ce)用纈氨酸取代NS4A的殘基52，或者(f)用脯氨酸取代NS5A的殘基179。
[0017]在一個實施方式中，還提供了一種識別抑制基因型4HCV的復制或活性的藥劑的方法，包括將任何以上實施方式中的細胞與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質(zhì)的復制減少或活性降低表明該藥劑抑制HCV的復制或活性?？商鎿Q地，該方法包括將以上實施方式的任一個中的細胞裂解液與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質(zhì)的活性降低表明該藥劑抑制HCV的活性?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0018]與附圖一起閱讀以下詳細描述，可以對本發(fā)明有最好的理解。附圖包括以下各圖:
[0019]圖1是基因型4a復制子構建體的示意圖。HCV復制子用于生成新型基因型4a穩(wěn)定復制子細胞系。ED434a菌株復制子編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (A)或海腎熒光素酶(Rluc)-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II融合報告子(B)。合成的復制子并入以下要素，從5’至3’:ED435’UTR;新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(neo)或Rluc-Neo基因；腦心肌炎病毒(EMCV)IRES ；包括NS5A適應性變異(S2204I)的ED43的NS3-NS5B多聚蛋白區(qū)；以及ED43的3’UTR。實心黑方框表示HCV核心序列。圓點陰影方框表示HCV多聚蛋白序列?！?+ ”表示S2204I適應性變異。5’和3’非翻譯區(qū)(NTR)和EMCVIRES也有表示。
[0020]圖2是基因型4a復制子的建立方案示意圖。
[0021]圖3示出了在三種不同細胞系中存活的菌落數(shù)。如在材料和方法中所述的，分別用GT4a復制子RNA轉(zhuǎn)染Huh-7Lunet、51C和IC細胞。對于每次選擇，對存活的菌落數(shù)計數(shù)。數(shù)據(jù)代表至少6次獨立轉(zhuǎn)染的平均值。Huh7_lunet獲自ReBLikon GmbH(Mainz, Germany)。之前已描述了 51C 細胞的來源(Robinson 等，Antimicrob Agents Chemother54:3099-106(2010))。IC細胞是通過治愈獲自51C細胞的GS-5885耐受性基因型Ia復制子克隆而得到的。GS-5885 是一種 NS5A 抑制劑，可獲自 Gilead Sciences, Inc.Foster City, CA。該圖顯示，Huh71C細胞相比于Huh7-Lunet或51C細胞對GT4a復制子復制具有更高的允許度。
[0022]圖4示出了選定的GT4a復制子克隆獲得了適應性變異。從原始基因型4a復制子細胞克隆中提取總細胞RNA，然后按指定量將其電穿孔到Huh7-Lunet細胞中。使轉(zhuǎn)染細胞再懸浮于完全DMEM培養(yǎng)基中，并以多種密度(范圍為2 X IO5到2 X IO6個細胞)鋪板于直徑為IOOmm的盤(皿,dish)中。鋪板48小時之后,培養(yǎng)基用以0.5mg/ml的G418增補的完全DMEM替換，每周更新兩次。3周之后，用4%的甲醛固定菌落盤，并用0.05%在水中的結晶紫染色。平行轉(zhuǎn)染體外轉(zhuǎn)錄的GT4a復制子RNA，用作對照組。從原始基因型4a復制子中提取的RNA的菌落形成效率極大提高，這表明在該克隆中的復制子已獲得了使得能夠在體外強健復制的適應性變異。
[0023]圖5示出了在GT4a復制子細胞系中的強健NS5A和NS3表達(A)。用抗-NS5A抗體(Apath, Brooklyn, New York ;上圖，淺灰色)和 Hoechst33342 (Invitrogen ；1 μ g/ml)(下圖，深灰色表示細胞核)對GT4a復制子細胞池(cell pool)染色。對IC細胞進行染色作為陰性對照(下圖)。GT4a復制子細胞對NS5A呈明顯陽性，這表明是活性復制。(B)如在材料和方法中所述的，測定選定的GT4a復制子細胞系的細胞內(nèi)NS3蛋白酶活性。，包括GTla和GTlb穩(wěn)定復制子細胞，用于比較NS3蛋白酶活性。包括IC細胞，作為陰性對照。在GT4a復制子細胞系中觀察到了強健的NS3活性，這表明其強健的復制子活性，一些GT4a復制子細胞系超過了由標準GTla和Ib復制子細胞產(chǎn)生的NS3信號。
[0024]圖6證實了在GT4a復制子細胞系中強健的NS5A表達。將各自0.5xl06個穩(wěn)定的GT4a和GTlb復制子細胞分離，并在100 μ I的SDS加載緩沖液(loading buffer)中完全裂解。取12 μ I的裂解液，進行SDS-PAGE和蛋白印跡(Western blot)分析。印跡用一級抗-NS5A抗體(Apath ； 1:10000稀釋液)和二級抗-小鼠抗體染色(來自L1-COR的IRDye800CW山羊抗-小鼠IgG (H+L)，1:10，OOO稀釋液)。然后，用Odyssey成像系統(tǒng)(L1-COR.Lincoln, Nebraska)分析染色。印跡還需用抗-BiP抗體(Abeam ；1:1000稀釋液)和二級抗-兔抗體(來自L1-COR的IRDye800CW Goat抗-兔子IgG (H+L)，1:10，000稀釋液)共同染色，作為加載對照組。在GT4a復制子細胞克隆中檢測到NS5A的強表達，證實這些細胞穩(wěn)定且強健地復制該復制子，超過由標準GTlb復制子細胞產(chǎn)生的NS5A表達水平或者可與上述NS5A表達水平相比較。
[0025]圖7示出了 NS4A Q34R是GT4a復制的細胞培養(yǎng)適應性變異。將GT4aED43_neo構建體的Neo基因替換為Rluc-neo融合報告子，以有助于在細胞培養(yǎng)物中測定復制子的復制(利用熒光素酶)。然后，通過定點誘變將NS4A基因中的Q34R變異引入到GT4aED43-RlucNeo構建體中。分別將全部的三種復制子RNA轉(zhuǎn)染到Huh7_Lunet (左圖)和IC(右圖)細胞中。對于每次選擇，對存活的菌落數(shù)計數(shù)。數(shù)據(jù)代表至少2次獨立轉(zhuǎn)染的平均值。Q34R變異使得GT4a ED43-RlucNe0能夠建立菌落，而沒有這種變異的相同復制子沒有建立菌落。選擇GT4a RlucNeoQ34R的克隆，由于其較高的Rluc信號，并擴增以用于抗病毒檢測。
[0026]圖8呈現(xiàn)出以下數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)顯示對于GT4a復制，NS3A200E、T343R、和T343K以及NS4A Q34R、Q34K和E52V變異是細胞培養(yǎng)適應性變異。將GT4a ED43_neo構建體的Neo基因替換為Rluc-neo融合報告子，以有助于在細胞培養(yǎng)中測定復制子的復制(利用熒光素酶)。然后，通過定點誘變，分別將NS3基因中的變異A200E、T343R、和T343K以及NS4A基因中的Q34K、Q34R、和E52V引入到GT4a ED43-RlucNeo構建體中。單獨將全部的復制子RNA轉(zhuǎn)染到IC細胞中，并將IX IO4個轉(zhuǎn)染細胞鋪板到96-孔板的孔中。在轉(zhuǎn)染后的4小時和第I天到第8天中的每天，分析細胞的海腎熒光素酶活性。在第4天，進行細胞傳代和再鋪板。在每個時間點，對每次轉(zhuǎn)染測定四倍孔，數(shù)據(jù)代表2次獨立實驗的平均值，帶有誤差條。所有測試的變異:NS3基因中的A200E、T343R、和T343K以及NS4A基因中的Q34K、Q34R、和E52V，顯著提高了 GT4aED43-RlucNeu的復制，正如從在信號初始下降(由輸入RNA的直接翻譯引起，與RNA復制無關)之后的第2天開始Rlu信號的增加所證明的。相比之下，不含變異的相同復制子沒有顯示出任何有意義的復制。
【具體實施方式】
[0027]在更詳細地描述本發(fā)明之前，將首先定義以下術語。
[0028]應當理解，本發(fā)明并不限于所描述的特定實施方式，當然，可以有所變化。還應理解，在本文中使用的術語僅用于描述特定實施方式的目的，而非意圖限制，因為本公開內(nèi)容的范圍將僅由所附的權利要求來限定。
[0029]需注意，除非在上下文中另有明確規(guī)定，在本文中及在所附權利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“一種”和“該”包括復數(shù)對象。因此，舉例來說，提及“該絲線”包括多個絲線。
[0030]1、定義
[0031]除非另有規(guī)定，在本文中使用的所有技術或科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。在本文中使用的以下術語具有以下含義。
[0032]在本文使用的術語“包括”或“包含”意在表示組分和方法包括所列舉的要素，但不排除其它。當“ 基本由…組成”用于限定組分和方法時，應表示排除對于為了所述目的而引用的組合具有任何實質(zhì)意義的其它要素。因此，基本由在本文中限定的要素組成的組合物不排除其它對所要求保護的公開的基本或新特征不具有實質(zhì)影響的材料或步驟?！坝伞M成”表示排出超過微量要素的其它成分和基本方法步驟。由所有這些過渡術語中的每一個限定的實施方式在本公開的范圍之內(nèi)。
[0033]當術語“約”用在數(shù)值標號，例如，溫度、時間、數(shù)量和濃度(包括范圍)之前時，是指可以相差(+ )或(_) 10%、5%或1%的近似值。
[0034]術語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可交換使用，且其最廣泛的含義是指兩個或更多個亞單元氨基酸、氨基酸類似物或擬肽的化合物。亞單元可由肽鍵連接。在另一個實施方式中，亞基可以由其它鍵連接，例如酯、醚等。蛋白質(zhì)或肽必須包括至少兩個氨基酸，且不限制氨基酸的最大數(shù)量，可以包括蛋白質(zhì)或肽的序列。在本文使用的術語“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和其D及L光學異構體，氨基酸類似物或擬肽。下面列出了天然產(chǎn)生的氨基酸的一個字母及三個字母的縮寫。如果肽鏈較短，則三個或更多個氨基酸的肽通常被稱作寡肽。如果肽鏈較長，肽通常被稱作多肽或蛋白質(zhì)。
[0035]
【權利要求】
1.一種能夠在真核細胞中復制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV)RNA構建體，其中，所述RNA的序列包括5’NTR，內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，編碼NS3、NS4A、NS4B、NS5A、或NS5B中的一種或多種的序列，以及3’ NTR0
2.根據(jù)權利要求1所述的RNA構建體，其中，與野生型相比，所述構建體包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A、*NS5B中的適應性變異。
3.根據(jù)權利要求2所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在2204位上的異亮氨酸。
4.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在NS3中的殘基200上的谷氨酸、殘基343上的賴氨酸或精氨酸、殘基511上的精氨酸、或它們的組合。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在NS4A中的殘基34上的賴氨酸或精氨酸、殘基52上的纈氨酸、或它們的組合。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述變異包括在NS5A中的殘基179上的脯氨酸。
7.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述構建體包括至少一個在NS3中的適應性變異和至少一個在NS4A中的適應性變異。
8.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述構建體包括至少一個在NS3中的適應性變異和至少一個在NS5A中的適應性變異。
9.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述構建體包括至少一個在NS4A中的適應性變異和至少一個在NS5A中的適應性變異。
10.根據(jù)前述權利要求`中任一項所述的RNA構建體，其中，所述構建體包括至少一個在NS3中的適應性變異、至少一個在NS4A中的適應性變異、和至少一個在NS5A中的適應性變巳
11.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述基因型4HCV是基因型4a HCV。
12.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，還包括用于選擇的標記基因。
13.根據(jù)權利要求12所述的RNA構建體，其中，所述標記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
14.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，還包括報告基因。
15.根據(jù)權利要求14所述的RNA構建體，其中，所述報告基因是熒光素酶。
16.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述構建體包括，從5’到3’:所述 5’ NTR,所述 IRES,編碼 NS3、NS4A、NS4B、NS5A、和 NS5B 的序列，以及所述 3’ NTR。
17.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，還包括編碼C、E1、或E2中的一種或多種的序列。
18.一種單鏈或雙鏈DNA，可以轉(zhuǎn)錄為前述權利要求中任一項所述的RNA構建體。
19.一種病毒顆粒，包含權利要求1至17中任一項所述的RNA構建體。
20.一種分離細胞，包含權利要求1至17中任一項所述的RNA構建體或權利要求18所述的DNA。
21.—種HCV基因型4的NS3蛋白，包括殘基200上的谷氨酸、殘基343上的賴氨酸或精氨酸、殘基511上的精氨酸、或它們的組合。
22.—種HCV基因型4的NS4A蛋白，包括殘基34上的賴氨酸或精氨酸、殘基52上的纈氨酸、或它們的組合。
23.—種HCV基因型4的NS5A蛋白，包括殘基179上的脯氨酸。
24.—種HCV基因型4的NS5A蛋白，包括殘基179上的脯氨酸和在2204位上的異亮氨酸。
25.—種多核苷酸,編碼權利要求21至24中任一項所述的蛋白質(zhì)。
26.根據(jù)權利要求25所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是RNA或DNA。
27.—種RNA或DNA構建體，包括權利要求25或26所述的多核苷酸。
28.—種細胞，包含權利要求25或26所述的多核苷酸或者權利要求27所述的RNA或DNA構建體。
29.一種抗體，特異性地識別權利要求21至24中任一項所述的蛋白。
30.一種分離細胞，包含在所述細胞中復制的基因型4丙型肝炎病毒(HCV) RNA。
31.根據(jù)權利要求30所述的細胞，其中，在所述細胞中不存在編碼所述RNA的DNA構建體。
32.根據(jù)權利要求30或31所述的細胞，其中，所述細胞包括至少10個拷貝的所述RNA。
33.根據(jù)權利要求30至32中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括亞基因組HCV序列。`
34.根據(jù)權利要求33所述的細胞，其中，所述RNA包括5’NTR，內(nèi)部核糖體進入位點(11?3)，編碼吧3、吧4六、吧48、吧5六、和NS5B的序列，以及3’NTR。
35.根據(jù)權利要求30至34中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括全基因組HCV序列。
36.根據(jù)權利要求30至35中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括在2204位上的異亮氨酸。
37.根據(jù)權利要求30至36中任一項所述的細胞，其中，所述RNA是基因型4a。
38.根據(jù)權利要求30至37中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括編碼NS3的序列，所述NS3包括殘基200上的谷氨酸、殘基343上的賴氨酸或精氨酸、殘基511上的精氨酸、或它們的組合。
39.根據(jù)權利要求30至38中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括編碼NS4A的序列，所述NS4A包括殘基34上的賴氨酸或精氨酸、殘基52上的纈氨酸、或它們的組合。
40.根據(jù)權利要求30至39中任一項所述的細胞，其中，所述RNA包括編碼NS5A的序列，所述NS5A包括殘基179上的脯氨酸。
41.根據(jù)權利要求30至40中任一項所述的細胞，其中，所述細胞是哺乳動物細胞。
42.根據(jù)權利要求41所述的細胞，其中，所述細胞是肝瘤細胞。
43.根據(jù)權利要求42所述的細胞，其中，所述細胞是Huh71C細胞。
44.一種提高基因型4HCV病毒RNA在真核細胞中的復制能力的方法，包括以下各項中的一個或多個: Ca)用谷氨酸取代NS3的殘基200， (b)用賴氨酸或精氨酸取代NS3的殘基343， (c)用精氨酸取代NS3的殘基511， Cd)用賴氨酸或精氨酸取代NS4A的殘基34，(e)用纈氨酸取代NS4A的殘基52，或 Cf)用脯氨酸取代NS5A的殘基179。
45.一種識別抑制基因型4HCV的復制或活性的藥劑的方法，包括使權利要求1至17中任一項所述的細胞與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質(zhì)的復制減少或活性降低表明所述藥劑抑制所述HCV的復制或活性。
46.根據(jù)權利要求45所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是蛋白酶。
47.根據(jù)權利要求45或46所述的方法，還包括測定所述RNA的復制或由所述RNA編碼的所述蛋白質(zhì)的活性。
48.一種識別抑制基因型4HCV的活性的藥劑的方法，包括使權利要求1至17中任一項所述的細胞的裂解液與候選藥劑接觸，其中，由RNA編碼的蛋白質(zhì)的活性降低表明所述藥劑抑制所述HCV的活性。
49.根據(jù)權利要求48所述的方法，其中，所述蛋白質(zhì)是蛋白酶。
50.根據(jù)權利 要求 48或49所述的方法，還包括測定所述RNA的復制或由所述RNA編碼的所述蛋白質(zhì)的活性。
【文檔編號】C07K14/005GK103687868SQ201280033317
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年7月5日 優(yōu)先權日:2011年7月6日
【發(fā)明者】威廉四世·E·德拉尼, 程國鋒, 莫紅梅, 徐思民, 彭倍兒 申請人:吉利德科學股份有限公司