用于鑒定安吉小鯢的多重pcr引物和方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物物種的檢測領(lǐng)域，具體地，涉及一種用于鑒定安吉小鯢的多重PCR 引物和方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]安吉小銳(Hynobius amjiensis)隸屬兩棲綱(Amphibia)、有尾目（Caudata)、小銳 科(Hynobiidae)、小鯢屬(Hynobius)，是中國特產(chǎn)的珍稀兩棲動(dòng)物。安吉小鯢直到1991年才 被發(fā)現(xiàn)定名(顧輝清，1991 )，其模式標(biāo)本產(chǎn)地位于浙江省安吉縣龍王山省級(jí)自然保護(hù)區(qū)(Gu and Lau，2004)。安吉小鯢一般均棲息在海拔1300米以上的高山濕地、草甸中，繁殖季節(jié)時(shí) 進(jìn)入附近的溪流源口處、小溪溝或水坑內(nèi)配對(duì)產(chǎn)卵，繁殖期后營陸棲生活。由于安吉小鯢的 分布區(qū)極度狹窄，其野外種群數(shù)量估計(jì)不足300只，處于極度瀕危的境地(顧輝清等，1999)。 自2000年被國家林業(yè)局列入《國家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究價(jià)值的陸生野 生動(dòng)物名錄》后，安吉小鯢在2004年被IUCN紅色物種名錄列為極危(CR)級(jí)物種。2010年，在 國家林業(yè)局發(fā)布的《極度瀕危陸生野生動(dòng)物名錄》中，安吉小鯢又被列在首位。國內(nèi)外很多 學(xué)者均呼吁應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該物種的保護(hù)和研究（傅萃長，2003 ;Gu and Lau，2004;楊莉等， 2008) 〇
[0003] 基于分類學(xué)的準(zhǔn)確物種鑒定是人類認(rèn)知自然和可持續(xù)發(fā)展的必要前提。它為生物 多樣性的保護(hù)、物種資源的可持續(xù)性利用，以及生物來源的新產(chǎn)品開發(fā)等提供了知識(shí)和理 論基礎(chǔ)（肖金花等，2004)。對(duì)于物種的鑒定，傳統(tǒng)的方法主要是采用形態(tài)學(xué)證據(jù)來進(jìn)行。但 該方法的一些缺陷也造成了瀕危動(dòng)物保護(hù)工作的局限，例如表型可塑性和遺傳可變性、無 法區(qū)分隱存分類單元、受生物性別和發(fā)育階段限制等(李明等，2001)。在野生動(dòng)物保護(hù)的實(shí) 踐工作中，一些來源不明的動(dòng)物樣品（如毛發(fā)、殘肢、腐敗組織、骨骼、皮張及糞便等)往往不 完整且樣品量較小，已很難從形態(tài)學(xué)上加以識(shí)別。然而，物種鑒定的結(jié)果往往又是林業(yè)、工 商、邊檢等執(zhí)法部門開展野生動(dòng)物資源保護(hù)與管理工作的基礎(chǔ)。另一方面，由于這些動(dòng)物大 都生活在高山密林、人跡罕至處，或由于氣候等客觀原因，保護(hù)工作者極少有機(jī)會(huì)能親眼觀 察到它們，以致進(jìn)一步開展基于物種DNA數(shù)據(jù)的種群數(shù)量、種群遺傳等工作困難重重。
[0004] 具體到安吉小鯢物種，由于其平時(shí)均生活于濕地草甸泥炭蘚下腐植質(zhì)層中，只有 在冬季產(chǎn)卵季節(jié)才進(jìn)入水坑。因此，在實(shí)際野外保護(hù)工作中很難看到安吉小鯢，絕大多數(shù)情 況下遇到、采集到的都是其繁殖期內(nèi)的蝌蚪、卵袋等未變態(tài)的幼體。同時(shí)，安吉小鯢的棲息 地內(nèi)同時(shí)還生活著其它兩棲動(dòng)物，如東方蠑螈、無斑肥螈、各種蛙類等。這些動(dòng)物的幼體(蝌 蚪期或卵袋期)還存在著生態(tài)位的重疊現(xiàn)象。安吉小鯢剛從卵袋里孵化出來的時(shí)候通體黑 色個(gè)體又非常幼小，與同一水域內(nèi)其它兩棲類動(dòng)物的蝌蚪非常相似，極難辨認(rèn)。繁殖期幼體 安吉小鯢難以辨識(shí)的情況給安吉小鯢的種群遺傳學(xué)、迀地保護(hù)等工作帶來了極大困難。
[0005] 近年來DNA分類鑒定技術(shù)的飛速發(fā)展為物種的保護(hù)、野生動(dòng)物的有效管理提供了 強(qiáng)大的工具，更成為形態(tài)學(xué)物種鑒定手段的有益補(bǔ)充（李明等，2001)。動(dòng)物線粒體DNA (mtDNA)的Cyt b基因和12S rRNA基因均具有母系遺傳、進(jìn)化速率快、基因結(jié)構(gòu)簡單、無組織 特異性等特點(diǎn)，被認(rèn)為是開展種及種下水平鑒定研究的理想DNA標(biāo)記（牛屹東等，2001; Pfunder et al.，2004;Balitzki_Korte et al.，2005)。較之于通用引物測序法、RFLP等 〇嫩鑒定方法，位點(diǎn)特異性?0?以11616_8?6(^行〇?0〇技術(shù)因其具有的物種特異性、條件嚴(yán) 謹(jǐn)、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)在物種鑒定領(lǐng)域得到了廣泛使用（劉忠權(quán)等，2001;Yan et al.， 2005;Wang and Guo，2008;顧海豐等，2012)。
[0006] 因此，提供一種無需通過DNA的測序及序列比對(duì)等繁瑣步驟，僅需通過一次PCR擴(kuò) 增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測時(shí)間短，操作簡便且實(shí)際使用時(shí)更為經(jīng)濟(jì)而高效的用于鑒 定安吉小鯢的多重PCR引物和方法是本發(fā)明亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中通過形態(tài)學(xué)辨別安吉小鯢 具有局限性，且常規(guī)DNA測序的鑒定方式不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且大大提高了鑒定成本的問題，從 而提供一種無需通過DNA的測序及序列比對(duì)等繁瑣步驟，僅需通過一次PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝 膠電泳檢測，檢測時(shí)間短，操作簡便且實(shí)際使用時(shí)更為經(jīng)濟(jì)而高效的用于鑒定安吉小鯢的 多重PCR引物和方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于鑒定安吉小鯢(Hynobius amjiensis) 的多重PCR引物，其中，所述多重PCR引物包括如SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2所示的引物對(duì) 1，以及如SEQ ID No :3和SEQ ID No :4所示的引物對(duì)2。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種利用多重PCR鑒定安吉小鯢(Hynobius amjiensis)的方法， 其中，所述方法包括：
[0010] 1)提取待測樣品的總DNA;
[0011] 2)采用根據(jù)上述所述的多重PCR引物對(duì)步驟1)中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012] 3)將步驟2)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測;其中，
[0013] 在步驟3)中所得到的瓊脂糖凝膠電泳圖中，若含有步驟2)中得到的產(chǎn)物的泳道中 出現(xiàn)2條條帶，則判斷所述待測樣品為來自安吉小鯢的樣品，若含有步驟2)中得到的產(chǎn)物的 泳道中不出現(xiàn)2條條帶，則判斷所述待測樣品不是來自安吉小鯢的樣品。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述所述的多重PCR引物或上述所述的方法在鑒定安吉 小銳(Hynobius amjiensis)中的應(yīng)用。
[0015] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明通過從安吉小鯢成體、蝌蚪或是卵帶等組織中提取其 DNA，并對(duì)提取后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用本發(fā)明提供的兩對(duì) PCR引物對(duì)，從而根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測中是否出現(xiàn)兩條條帶來對(duì)安吉小鯢進(jìn)行特異性 鑒定，從而大大避免了常規(guī)DNA測序及序列比對(duì)等繁瑣步驟，實(shí)現(xiàn)了僅需通過一次PCR擴(kuò)增 及瓊脂糖凝膠電泳檢測即可鑒定安吉小鯢，檢測時(shí)間短，操作簡便且實(shí)際使用時(shí)更為經(jīng)濟(jì) 而高效的效果。
[0016] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0017] 附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0018] 圖1是實(shí)施例1-3和對(duì)比例1-9的擴(kuò)增產(chǎn)物的糖凝膠電泳圖；其中，用到C來自雙蒸 水樣品，泳道Μ為分子量標(biāo)記，泳道1來自安吉小鯢的卵帶樣品，泳道2來自安吉小鯢的成體 肌肉樣品，泳道3來自安吉小鯢的蝌蚪肌肉樣品，泳道4來自東方蠑螈的肌肉樣品，泳道5來 自天臺(tái)蛙的肌肉樣品，泳道6來自花臭蛙的肌肉樣品，泳道7來自凹耳蛙的肌肉樣品，泳道8 來自棘胸蛙的肌肉樣品，泳道9來自黑斑蛙的肌肉樣品，泳道10來自澤蛙的肌肉樣品，泳道 11來自中華蟾蜍的肌肉樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定安吉小鯢(Hynobius amjiensis)的多重PCR引物，其 中，所述多重PCR引物包括如SEQIDNo:l和SEQIDNo:2所示的引物對(duì)l，以及如SEQID No:3和SEQ ID No:4所示的引物對(duì)2。
[0021 ] 本發(fā)明還提供了一種利用多重PCR鑒定安吉小鯢(Hynobius amjiensis)的方法， 其中，所述方法包括：
[0022] 1)提取待測樣品的總DNA;
[0023] 2)采用根據(jù)上述所述的多重PCR引物對(duì)步驟1)中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0024] 3)將步驟2)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測;其中，
[0025]在步驟3)中所得到的瓊脂糖凝膠電泳圖中，若含有步驟2)中得到的產(chǎn)物的泳道中 出現(xiàn)2條條帶，則判斷所述待測樣品為來自安吉小鯢的樣品，若含有步驟2)中得到的產(chǎn)物的 泳道中不出現(xiàn)2條條帶，則判斷所述待測樣品不是來自安吉小鯢的樣品。
[0026]上述設(shè)計(jì)通過從安吉小鯢成體、蝌蚪或是卵帶等組織中提取其DNA，并對(duì)提取后的 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用本發(fā)明提供的兩對(duì)PCR引物對(duì)，從而根據(jù) 瓊脂糖凝膠電泳檢測中是否出現(xiàn)兩條條帶來對(duì)安吉小鯢進(jìn)行特異性鑒定，從而大大避免了 常規(guī)DNA測序及序列比對(duì)等繁瑣步驟，實(shí)現(xiàn)了僅需通過一次PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測 即可鑒定安吉小鯢，檢測時(shí)間短，操作簡便且實(shí)際使用時(shí)更為經(jīng)濟(jì)而高效的效果。
[0027] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，出現(xiàn)的2條條帶中所含有的DNA片段的長度分 別為150bp 和425bp。
[0028] 在本發(fā)明的一種更為優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了使最終泳道中出現(xiàn)的條帶更為清晰 可辨，相對(duì)于30yL的PCR擴(kuò)增體系的總體積，每條引物的濃度為0.2-0.5pmol/L，DNA模板的 用量為40-60ng。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行用量的選擇，本發(fā)明并不局 限于此。當(dāng)然，在PCR擴(kuò)增過程中使用的聚合酶和緩沖液等可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的類型， 用量本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇，在此不多作贅述。
[0029] 所述PCR擴(kuò)增過程可以按照本領(lǐng)域常規(guī)采用的方式進(jìn)行操作，例如，在本發(fā)明的一 種優(yōu)選的實(shí)施方式中，為了使擴(kuò)增效果更好，所述PCR擴(kuò)增過程的變