專利名稱：長春花脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的基因序列的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程領(lǐng)域，是編碼脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的基因在長春花中的首次發(fā)現(xiàn)，預(yù)知有很強(qiáng)的抗旱功能。
背景技術(shù)：
自1970年在檢測花椰菜小花和馬鈴薯塊莖中脂質(zhì)轉(zhuǎn)移活性時發(fā)現(xiàn)了植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(LTP)以來，Thoma等(1994)年通過原位雜交等方法發(fā)現(xiàn)它主要存在于植物氣生部分的表皮層中，進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)水平定位研究又發(fā)現(xiàn)它存在于植物角質(zhì)、表皮細(xì)胞壁和液泡結(jié)構(gòu)中。三十多年來，人們對來源不同的LTP進(jìn)行了全面的研究，發(fā)現(xiàn)植物L(fēng)TP一方面有比較專一的底物特異性，如與磷脂酞乙醇胺(PE)的結(jié)合；另一方面又與很多親脂性分子結(jié)合，對各種脂質(zhì)體具有廣泛的親合作用。因此常常又被稱作非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nsLTPs，non-specific lipid transferproteins)。
nsLTPs是一類小分子可溶性蛋白，在高等植物中占全部可溶性蛋白的4％。其氨基酸殘基和PI在不同的植物中數(shù)值是不相同的，其中在植物nsLTPs中分子量在9～10kDa能夠被凝膠層析或SDS-PAGE電泳檢測出。從植物中分離純化到的nsLTPs分子量比較小。根據(jù)分子量的大小，植物nsLTPs可分為兩大類，即nsLTPI1和nsLTP2，分子量分別為9kDa和7kDa。通常，nsLTPI主要存在于植物的地上部分器官，而nsLTP2主要存在于根部，但兩者都存在種子里。在各種不同的物種中nsLTPs的生化性質(zhì)不盡相同，如從Nicotiana glauca中分離得到的NgLTPI基因能夠編碼一個含有117個氨基酸殘基的疏水蛋白，該蛋白含有21個氨基酸殘基的信號肽系列，成熟的NgLTPI分子量為9.2kDa，pI8.3。它具有較高的熱穩(wěn)定性，能耐100℃高溫而結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。nsLTPs具有良好的穩(wěn)定性，在4℃可貯存數(shù)月之久。它在高溫下也有較好的穩(wěn)定性，即使在有變性劑存在情況下也十分穩(wěn)定。
第一個編碼植物L(fēng)TP的cDNA是從玉米幼苗構(gòu)建的基因文庫中分離得到的。目前已從好幾種植物中分離鑒定到了nsLTPs基因，這其中有擬南芥、西紅柿、玉米、辣椒、大戟、甘藍(lán)、大麥、胡蘿卜、水稻、草莓、綠豆等。它們通常是以基因家族的形式出現(xiàn)，由幾個關(guān)系緊密的組分構(gòu)成。
目前，在多種植物中都有關(guān)于LTP蛋白或基因的研究報道。這些基因的表達(dá)或蛋白累積與植物的脅迫抗性正相關(guān)。由于植物本身不能移動，對于不良或惡劣的自然條件，只有改變自身的代謝途徑的生長去適應(yīng)環(huán)境的改變。LTP表達(dá)的提高有助于增加植物對各種不良環(huán)境的抗性。LTP在保衛(wèi)細(xì)胞中的表達(dá)量最高，而在葉肉細(xì)胞和根中表達(dá)量很低甚至無法檢測到，經(jīng)干早誘導(dǎo)處理后保衛(wèi)細(xì)胞中LTPRNA含量增加了四倍多。
經(jīng)檢索未發(fā)現(xiàn)任何公開或報道過長春花脂質(zhì)轉(zhuǎn)移基因及蛋白序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的是提供一種來自于長春花的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的核苷酸序列，其特征在于，它包括編碼干旱脅迫條件下長春花葉片中誘導(dǎo)的新的抗逆境蛋白LTP(脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白)的蛋白功能區(qū)序列。所述的氨基酸序列與基因庫中馬鈴薯的序列有45％的同源性，為植物品質(zhì)改良基因工程提供了更加豐富的優(yōu)良候選基因。
本發(fā)明的第二目的在于提供一種快速獲得脅迫相關(guān)基因全長序列的方法。
本發(fā)明的cDNA分子是通過如下的方法獲得的首先通過測定植物葉片水勢來尋找植物中度脅迫的處理條件。使植物干旱脅迫下表達(dá)蛋白的豐度富集。
其次，采用最適處理材料進(jìn)行總RNA的提取及mRNA的純化，用mRNA進(jìn)行全長cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建。構(gòu)建后cDNA處于真核表達(dá)載體質(zhì)粒pCMV上，可直接進(jìn)行克隆cDNA的表達(dá)文庫的篩選。
最后，采用3730測序儀，對隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行測序。EST標(biāo)簽在與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，對相關(guān)克隆測通全長，得到完整的LEA基因的完全編碼序列。
本發(fā)明的重要應(yīng)用價值在于該基因在抗旱過程中具有以下優(yōu)點(diǎn)LTP表達(dá)的提高有助于增加植物對各種不良環(huán)境的抗性。實驗表明，LTP在保衛(wèi)細(xì)胞中的表達(dá)量最高，而在葉肉細(xì)胞和根中表達(dá)量很低甚至無法檢測到，經(jīng)干早誘導(dǎo)處理后保衛(wèi)細(xì)胞中LTP RNA含量增加了四倍多。植物中由于LTP的存在使植物對不良環(huán)境具有很強(qiáng)的抗性和適應(yīng)性，以及對病原微生物有抗性，因此，LTP蛋白在提高植物對干旱的抗性中起重要作用，具體抗旱機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。


圖1是不同植物來源LTP蛋白的同源性比對2是長春花與馬鈴薯LTP蛋白的同源性比對圖
具體實施例方式實施例1 長春花抗旱基因晚期胚胎豐富蛋白全長基因的克隆步驟1，植物材料處理長春花幼苗播種在珍珠巖中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天澆水，取1個月苗齡的長春花植株在光培箱中自然脫水，沒隔一小時測葉片水勢及滲透勢，以達(dá)-1.0MPa為標(biāo)準(zhǔn)取材。取葉片液氮速凍，立即放入-70度的超低溫冰箱中。
步驟2，總RNA的提取及mRNA的純化1.利用Trizol(Gibco)一步法提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書步驟進(jìn)行。對總RNA定量并進(jìn)行變性電泳質(zhì)量分析。
2.mRNA的純化利用Oligotex mRNA Purification Kit(Qiagen)從總RNA中純化mRNA并進(jìn)行定量。
步驟3，λZAPExpresscDNA文庫的構(gòu)建(Stratagene)1.cDNA第一鏈的合成(1)冰上建立如下體系5.0μL 10×buffer 3.0μLdNTP Mix，2.0μL Link-Primer 12.5μL DEPC-H2O，1.0μLRNAsin，混勻，加入mRNA 5μg，加入1.5μL反轉(zhuǎn)錄酶。
(2)輕輕混勻，42℃溫育1hr。
2.cDNA第二鏈的合成(1)在第一鏈反應(yīng)體系中順序加入20μL 10×buffer，6.0μL dNTP Mix，116μLDEPC-H2O，2.0μL RNAseH(1.5U/μL)，11.0μL DNA polymerase I(9.0U/μL)(2)置16℃水浴保溫2.5hr。
3.cDNA末端補(bǔ)平(1)冰上加如下試劑23μL dNTP Mix，2.0μL pfu DNA pol(2.5U/μL)。
(2)72℃溫育30min。
(3)用200μL酚/氯仿抽提一次，室溫高速離心2min，轉(zhuǎn)上清于另一新管中。
(4)用等體積氯仿抽提一次，轉(zhuǎn)上清于另一新管中。
(5)加20μL 3mol/L NaAc，400μL 100％乙醇，混勻，-20℃過夜。
(6)4℃ 16000g離心60min，收集cDNA沉淀。
(7)加500μL 70％乙醇輕輕洗。
(8)全速離心2min，室溫下抽真空使沉淀干燥。
(9)沉淀重懸于9.0μL EcoR I adapters中。4℃保溫至完全溶解。
4.EcoR I銜接子的連接(1)順序加入1.0μL 10×buffer(Ligase Buffer)。
1.0μL 10mmol/L rATP1.0μL T4DNA ligase(4U/μL)4℃連接2天。
(2)70℃水浴30min，以滅活Ligase。
5.EcoR I連接子末端的磷酸化。
(1)室溫離心2s并放置5min，加入1.0μL 10×Ligase Buffer2.0μL 10mmol/L rATP5.0μL sterile H2O2.0μL T4 Kinase(5U/μL)37℃保溫30min。
(2)70℃加熱30min滅活Kinase6.Xho I消化加入下列成分28.0μL Xho I buffer3.0μL Xho I(40U/μL)37℃保溫1.5hr。
7.載體連接7.1使用Wizard SV Gel and PCR CLEAN System kit(Promega)回收cDNA片段，對回收的cDNA進(jìn)行EB定量。
7.2 cDNA與ZAP Express Vector連接在1.5ml離心管中加入2.0μL重懸cDNA0.5μL 10×ligase buffer0.5μL 10mM rATP1.0μL ZAP Express Vector0.5μL ddH2OT4 DNA ligase(4U/uL)0.5μL，4℃連接2天。
8.λ重組DNA的體外包裝(1)加入目的DNA 100ng至包裝蛋白中，混勻，離心匯于管底。
(2)22℃溫育2hr后，加入500μL SM Buffer，在加20μL氯仿，輕輕混勻。
9.λ噬菌體的轉(zhuǎn)染9.1噬菌體文庫滴度的測定(1)劃線培養(yǎng)XL1-blue MRF’，37℃過夜，培養(yǎng)基為LB(含12.5μg/ml Tet)。
(2)接種至LB broth，30℃，200rpm過夜搖(OD＜1)，1000×g離心收集菌體，加10mmol/L MgSO4重懸菌體至OD600＝0.5。
(3)在上述包裝體系中各取1.0μL做一系列稀釋，即1→10-2→10-4，各取1.0μL稀釋液于宿主菌中，吸附15min后，加3mL頂層瓊脂，迅速鋪在提前育溫至37℃的底層瓊脂，待凝固后37℃過夜倒置培養(yǎng)。
(3)待噬菌斑長出后，計算滴度。經(jīng)檢測，初級文庫的庫容達(dá)到1×106pfu/ml。
9.3噬菌體文庫的擴(kuò)增(1)宿主菌制備同前。
(2)鋪好板后37℃過夜倒置培養(yǎng)。噬菌斑不超過1～2mm。
(3)用4mL SM Buffer涂蓋菌板，4℃貯存過夜。
(4)吸出SM Buffer于無菌管中，在加1mL SM Buffer洗菌板一次，吸到管中加氯仿至終濃度5％，混勻置室溫培養(yǎng)15min，500g離心10min，移走細(xì)胞碎片。
(5)轉(zhuǎn)上清于另一管中，加氯仿至終濃度0.3％，4℃存放。
(6)測滴度。經(jīng)擴(kuò)增，文庫的滴度達(dá)1×108pfu/ml10噬菌體文庫的體內(nèi)剪切(1)劃線培養(yǎng)XL1-blue MRF’和XLOLR菌于LB培養(yǎng)基(含12.5μg/ml Tet).挑單菌落接種至50mL LB broth，30℃，200rpm過夜培養(yǎng)。
(2)1000×g離心收集XL1-blue MRF’和XLOLR cells，用10mM MgSO4重懸至OD600＝1。
(3)在離心管中加入100倍于初級庫的噬菌體量。按10∶1(cells-to-lambdaphage)加入宿主菌XL1-blue在按(10∶1 helper phage-to-cells ratio)加入輔助噬菌體。
(4)37℃吸附15min，加20ml NZY broth with supplements，37℃搖培3hr，65℃熱激20min，1000×g離心10min，轉(zhuǎn)上清于另一管中。
(5)測滴度取上清1.0μL分別加到200μL XLOLR菌中，37℃吸附15min，再加200μL NZY broth 37℃搖培45min。
(6)從中取出100μL鋪LB(50μg/ml，kana)37℃過夜培養(yǎng)，得到菌落。
11應(yīng)用PCR反應(yīng)體系檢測平均插入片段的長度取載體引物，挑單克隆進(jìn)行PCR驗證插入片斷，PCR反應(yīng)條件為95.0℃預(yù)變性5min，然后94.0℃變性30s，50.0℃模板退火30s，72.0℃延伸2min，共30個循環(huán)，最后，72.0℃最終延伸7min，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。經(jīng)檢驗，平均插入片斷長為1.2kb。
步驟4，采用3730測序儀進(jìn)行測序(ABI)
采用T7引物進(jìn)行單向測序，每個反應(yīng)可達(dá)800-1200bp。得到的EST序列進(jìn)入NCBI進(jìn)行比對后，對干旱脅迫相關(guān)基因質(zhì)粒測通，得到全長基因序列。
實施例2 長春花LTP的序列信息與同源性分析以下部分為克隆的長春花LTP蛋白的核苷酸序列g(shù)gcacgagga tttgtgagca tacaatcaaa taatggcaag atcaaagttg tttatgcaga 60agcagctact aggactagta attttgatat ggatgttggc atataatcct cggccaagtg120aagccttaac gtgtgacgat gtgaacaaca acctcatctc atgtctgagt tacgtcgcag180gcggtggaaa ggtgccgaca agctgttgca gtggggtgaa aaatctgctt agtttagcca240agactagaaa cgaccggcaa acagcatgct catgcttgaa atctcttgct gttgaagcca300ataatgatca acttaagagg gctcaaactg ttccaaagtc ttgttctttg accattcctt360ttcctatttc cagagatgtt gattgctcca aggtgaaata ataccttgac gaactctgat420gactgcatat atatatatat aaatagtgtc tcattggtaa tatatatgca gtaattttga480ttattattat atagagaaag aataaagaat aattatgtgg tcttcctcta agcaagagat540ttcaacacaa ttacaagtga aattaaatta tgttgtataa ttaacattac ttaaacttga600tgatcatata taatgttatt tcgcattgat gctttattca atggggaaaa taattaattt660cgaaataaaa atttaagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa698全編碼序列為從33位的atg到401位的taa。第680位具有polyA附加信號。其編碼的122個氨基酸序列為MARSKLFMQKQLLGLVILIWMLAYNPRPSEALTCDDVNNNLISCLSYVAGGGKVPTSCCSGVKNLLSLAKTRNDRQTACSCLKSLAVEANNDQLKRAQTVPKSCSLTIPFPISRDVDCSKVK本發(fā)明從長春花中分離該基因，即從新的物種中分離該基因，因而具有創(chuàng)新性；長春花屬耐干旱、耐鹽堿植物，因而預(yù)知該基因有更強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿功能，有更新的實用價值。
權(quán)利要求
1.一種編碼長春花脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的核苷酸序列，其特征在于其具有如下的DNA核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列g(shù)gcacgagga tttgtgagca tacaatcaaa taatggcaag atcaaagttg tttatgcaga 60agcagctact aggactagta attttgatat ggatgttggc atataatcct cggccaagtg120aagccttaac gtgtgacgat gtgaacaaca acctcatctc atgtctgagt tacgtcgcag180gcggtggaaa ggtgccgaca agctgttgca gtggggtgaa aaatctgctt agtttagcca240agactagaaa cgaccggcaa acagcatgct catgcttgaa atctcttgct gttgaagcca300ataatgatca acttaagagg gctcaaactg ttccaaagtc ttgttctttg accattcctt360ttcctatttc cagagatgtt gattgctcca aggtgaaata ataccttgac gaactctgat420gactgcatat atatatatat aaatagtgtc tcattggtaa tatatatgca gtaattttga480ttattattat atagagaaag aataaagaat aattatgtgg tcttcctcta agcaagagat540ttcaacacaa ttacaagtga aattaaatta tgttgtataa ttaacattac ttaaacttga600tgatcatata taatgttatt tcgcattgat gctttattca atggggaaaa taattaattt660cgaaataaaa atttaagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa698MARSKLFMQKQLLGLVILIWMLAYNPRPSEALTCDDVNNNLISCLSYVAGGGKVPTSCCSGVKNLLSLAKTRNDRQTACSCLKSLAVEANNDQLKRAQTVPKSCSLTIPFPISRDVDCSKVK
2.一種如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于33bp處具有起始密碼子ATG，401bp處具有終止密碼子TAA，在680bp處具有polyA附加信號。該序列無內(nèi)含子，具有369bp完整的開放讀碼框，編碼122個氨基酸。
3.一種如權(quán)利要求1所述的長春花脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于首先使用適度的干旱處理條件，使植物抗旱基因表達(dá)富集；然后通過構(gòu)建全長的cDNA文庫，及測序，在最短的時間內(nèi)得到抗旱相關(guān)的全長脅迫基因。獲得的抗旱基因直接構(gòu)建在真核表達(dá)載體pCMV質(zhì)粒上，可通過真核生物表達(dá)來直接進(jìn)行篩選?；蚩梢允褂胻3、t7通用引物進(jìn)行測序。
全文摘要
一種長春花干旱脅迫條件下長春花葉片中誘導(dǎo)的新的抗旱基因及其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列。它涉及一種新的基因序列。其特征在于該基因全長698bp，在33bp處具有起始密碼子ATG，401bp處具有終止密碼子TAA，在680bp處具有polyA附加信號。該序列無內(nèi)含子，具有369bp完整的開放讀碼框，編碼122個氨基酸。所述的氨基酸序列與馬鈴薯LTP序列的同源性達(dá)45％。本發(fā)明還提供了一種快速得到全長脅迫基因的方法。首先使用適度的干旱處理條件，使植物抗旱基因表達(dá)富集；然后通過構(gòu)建全長的cDNA文庫及測序，在最短的時間內(nèi)得到抗干旱脅迫相關(guān)的全長基因。獲得的抗旱基因直接構(gòu)建在真核表達(dá)載體pCMV質(zhì)粒上，可使用t3、t7通用引物進(jìn)行測序。同時，可通過真核生物表達(dá)來直接進(jìn)行篩選。本發(fā)明從植物cDNA中分離出了脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白的全長基因，該基因具有較強(qiáng)的抗旱功能，同時，對增強(qiáng)植物其它逆境抗性也起到重要的作用。該基因的克隆擴(kuò)大了植物抗旱研究的基因資源，為運(yùn)用基因工程技術(shù)提高植物抗干旱脅迫及品質(zhì)改良提供了更加豐富的優(yōu)良候選基因。
文檔編號C12N15/29GK1687416SQ20051000993
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月27日
發(fā)明者祖元剛, 聶明珠, 于景華, 唐中華, 王慧梅, 郭曉瑞, 房思梁, 王延兵 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 祖元剛