一種用于檢測牛gart突變基因型的引物對(duì)和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說，涉及一種用于檢測牛GART突變基因型的引物 對(duì)和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾十年來，奶牛群體改良成效顯著，通過對(duì)產(chǎn)奶性能的高強(qiáng)度選擇，奶牛的產(chǎn)奶 量、乳脂率、乳蛋白率等經(jīng)濟(jì)性狀都得到了大幅提高。然而，人們?cè)谟N過程中對(duì)種公牛的 選擇總是局限在一部分優(yōu)秀家系，導(dǎo)致奶牛的基因庫在逐漸縮小。同時(shí)，人工授精技術(shù)的廣 泛使用，不僅使奶牛群體的近交程度不斷增加，而且使群體內(nèi)遺傳缺陷基因快速擴(kuò)散的風(fēng) 險(xiǎn)也隨之增大。自上世紀(jì)90年代以來，先后有多種遺傳缺陷被報(bào)道，包括脊椎畸形綜合征 (CVM)、白細(xì)胞黏附缺陷（BLAD)、短脊柱綜合征（BY)、遺傳缺陷單倍型（HH1、HH2、HH3)等。 這些缺陷基因呈隱性遺傳模式，攜帶者表現(xiàn)正常，但如果缺陷等位基因純合，將造成胚胎早 期死亡、發(fā)育畸形、母牛流產(chǎn)或者死胎等，給奶牛養(yǎng)殖帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，必須建立 準(zhǔn)確的檢測手段，在群體中篩查遺傳缺陷基因的攜帶者，通過逐步淘汰攜帶者，降低群體頻 率；同時(shí)，實(shí)施科學(xué)選配方案，避免攜帶者之間交配，從而防止出現(xiàn)遺傳缺陷的純合子。
[0003] 2013年，法國科學(xué)家Fritz等報(bào)道荷斯坦品種奶牛中存在一種隱性致死遺傳缺 陷單倍型，命名為HH4,該單倍型純合后，導(dǎo)致母牛因胚胎早期死亡而流產(chǎn)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā) 現(xiàn)，該遺傳缺陷在法國荷斯坦牛群中的頻率為3.6%。HH4的分子機(jī)理為，1號(hào)染色體的 GART(GlycinAmideRibonucleotideTransformylaseprotein，甘氨酰胺轉(zhuǎn)甲?；福┗?因編碼區(qū)內(nèi)的A/C突變，導(dǎo)致編碼氨基酸從天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸。由于GART在嘌呤的生 物合成中起關(guān)鍵作用，發(fā)生突變后GART功能喪失，最終導(dǎo)致胚胎在妊娠早期死亡。
[0004]Fritz等（2013)報(bào)道了基于SNP單倍型的HH4檢測方法。該方法需要首先對(duì)待檢 樣本進(jìn)行SNP芯片檢測，然后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法推斷單倍型，進(jìn)而判定個(gè)體攜帶HH4的概率。 此方法不僅因依賴芯片檢測而成本很高，同時(shí)還需事先建立參考群體的基因型數(shù)據(jù)庫。
[0005] 因此，亟需一種操作簡單、準(zhǔn)確高效篩查牛GART突變型等位基因攜帶者的分子檢 測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測牛GART突 變基因型的引物對(duì)和檢測方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測牛GART突變基因型的引物 對(duì)，所述引物對(duì)具體為：
[0008]上游引物GART-F:5 ' -GAAGGTGTCCTCTATGCTGG-3 ' ；
[0009]下游引物GART-R:5 ' -TITTAAGAAGTGGGAGGATC-3 '。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種檢測牛GART突變基因型的方法，所述方法包括以下步驟：
[0011] 1)PCR擴(kuò)增：以待測樣本基因組DNA為模板，利用前述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] 2)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切：用限制性內(nèi)切酶MseI對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化，得到酶 切產(chǎn)物；
[0013] 3)電泳檢測：將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過觀察酶切產(chǎn)物的電泳條帶， 判斷待測樣本的基因型。
[0014] 進(jìn)一步地，通過觀察酶切產(chǎn)物的電泳條帶是否存在長度為117bp的條帶，判斷待 測樣本是否為突變基因型。
[0015] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)體系以25yL計(jì)為：
[0018] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性8min;95°C變性30sec，60°C退火30sec， 72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0019] 進(jìn)一步地，酶切反應(yīng)體系以20yL計(jì)為：
[0021] 進(jìn)一步地，酶切反應(yīng)條件為：在水浴鍋中37°C消化2小時(shí)。
[0022] 進(jìn)一步地，所述擴(kuò)增產(chǎn)物在進(jìn)行酶切之前，利用凝膠電泳檢測長度為276bp的條 帶存在。該條帶即為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段。
[0023] 牛GART基因隱性有害突變攜帶者部分測序結(jié)果見圖1，上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的 野生型等位基因有3個(gè)MseI酶切位點(diǎn)（見圖2)，可進(jìn)行酶切反應(yīng)將276bp的片段切為4 個(gè)片段，即154bp、59bp、58bp和5bp;突變型等位基因，由于A-C突變，導(dǎo)致1個(gè)酶切位點(diǎn) 消失，從而只產(chǎn)生3個(gè)片段（154bp、117bp和5bp)。因此通過觀察酶切產(chǎn)物是否存在117bp 條帶，即可篩查突變型等位基因的攜帶者。
[0024] 理論上，野生型純合子酶切后產(chǎn)生4個(gè)片段，S卩154bp、59bp、58bp和5bp;突變型 攜帶者酶切后有5個(gè)片段，即154bp、117bp、59bp、58bp和5bp。但由于瓊脂糖凝膠電泳分辨 率較低，在膠圖上無法清晰地觀察到5bp片段；同時(shí)，相差只有l(wèi)bp的58bp片段與59bp片 段，在瓊脂糖凝膠上也無法分開。因此，通過膠圖，野生型純合子能呈現(xiàn)較清晰的2條帶，即 154bp，58bp/59bp;而突變型攜帶者除了這2條之外，還有117bp條帶。突變型純合子的胚 胎不可存活，在妊娠期流產(chǎn)，因此試驗(yàn)中不會(huì)觀察到突變型純合子的基因型。
[0025] 所述基因組DNA米用尚鹽法從牛凍精中提取。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種含有前述引物對(duì)的試劑盒。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0028] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性酶切多態(tài)性技術(shù)（PCR-RFLP)的GART 基因隱性致死突變的分子檢測方法。該方法使用PCR儀、電泳儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)等常規(guī) 儀器設(shè)備，操作簡單，成本低廉；同時(shí)，所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增效率好，擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切片段的瓊脂 糖電泳分離后，條帶判定清晰，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于大規(guī)模的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物除了能夠擴(kuò)增牛GART基因的目的突變位點(diǎn)外，所擴(kuò)增片段 內(nèi)還包含另外2個(gè)相同的酶切位點(diǎn)，能夠避免因酶切不完全或酶切反應(yīng)失敗而導(dǎo)致的假陽 性，從而確保檢測的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0030] 圖1為牛GART基因隱性有害突變攜帶者部分測序結(jié)果。箭頭處為突變位點(diǎn)（A/C 突變）。該突變的基因組物理位置為牛1號(hào)染色體的第1277227位（牛UMD3. 1基因組圖 譜http://www.ensembl.org)〇
[0031] 圖2為本發(fā)明所用引物及酶切位點(diǎn)在牛GART基因序列上的位置（DNA序列來源于 牛UMD3.1基因組圖譜http://www.ensembl.org)。下劃線顯示引物所在位置，陰影處為 MseI內(nèi)切酶識(shí)別序列；第一個(gè)酶切位點(diǎn)是GART基因隱性有害突變位點(diǎn)的野生型序列，如 果是突變型等位基因（即TTAA-TTAC)，則該酶切位點(diǎn)消失。
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