專利名稱：一種三角帆蚌基因型快速精確鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及三角帆蛘優(yōu)良品種的選育，具體說是一種三角帆蛘基因型快速精確鑒 定方法，屬分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國是世界第一產(chǎn)珠大國，目前珍珠總產(chǎn)量高達1800多噸，占世界珍珠總產(chǎn)量的 90%以上。而在這1800多噸的總產(chǎn)量中，淡水珍珠占98%以上，其中90%以上是由三角帆 蛘G^rioASi1S育出的。當前，已形成了以浙江諸暨山下湖珍珠市場和江蘇渭塘 珍珠市場為輻射中心的淡水珍珠產(chǎn)業(yè)群，2009年全世界珍珠及相關(guān)產(chǎn)品銷售額約100億美 元，中國只有15億美元左右。我國珍珠產(chǎn)業(yè)正在墮入有“名”無“利”的“高產(chǎn)陷阱”。與驕 人的產(chǎn)量相比，質(zhì)量低劣與“下游”產(chǎn)品開發(fā)乏力，使中國珍珠產(chǎn)業(yè)鏈呈現(xiàn)出畸形的“頭重腳 輕”，中國珍珠的“珍寶”形象難以實至名歸。培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆能力強的優(yōu)良品種已是 我國淡水珍珠產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。三角帆蛘是我國特有的優(yōu)質(zhì)淡水育珠蛘，主要分布于河北、山東、安徽、江蘇、浙 江、江西、湖北和湖南等省大、中、小型湖泊及其周圍河流內(nèi)。目前，上海海洋大學通過我國 三角帆蛘優(yōu)異種質(zhì)篩選工作，發(fā)現(xiàn)鄱陽湖、洞庭湖、太湖三角帆蛘種質(zhì)優(yōu)異，但這些三角帆 蛘是野生蛘，仍需進一步改良和培育。利用不同的育種和生物技術(shù)手段，將不同的品系或品 種的優(yōu)良性狀進行轉(zhuǎn)移、整合或固定，是培育良種的有效的途徑。由于三角帆蛘具有如下兩 大特點一是出生時個體非常小，無法進行物理標記，這是難于利用陸生動物已行之有效的 家系選育技術(shù)的原因之一；二是三角帆蛘的生存介質(zhì)是水體，各養(yǎng)殖池之間生態(tài)差異較大， 分池飼養(yǎng)獲得的差異有時被環(huán)境差異所淹沒，得到的差異很難代表遺傳差異使育種效率大 大降低；三角帆蛘的這兩個特點使傳統(tǒng)選育方法見效很慢，尤其是對低遺傳力的性狀選育 效率低下。近十年來，國際上貝類遺傳育種的研究趨勢是在鑒定經(jīng)濟性狀相關(guān)的分子標記 的基礎(chǔ)上，將選擇育種與現(xiàn)代育種生物技術(shù)特別是分子遺傳標記技術(shù)結(jié)合，形成分子標記 輔助育種技術(shù)。分子標記輔助育種技術(shù)已在羅非魚、虹鱒等水產(chǎn)動物育種工作中發(fā)揮了重 要作用。分子標記輔助育種技術(shù)的核心內(nèi)容之一就是鑒定選育后代基因型，目前三角帆蛘 基因型的鑒定仍采用酚氯仿法提取DNA，然后用微衛(wèi)星標記引物進行PCR鑒定，該方法費時 費力，且DNA提取過程對人體有害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有三角帆蛘基因型鑒定方法所存在的不足 而提供一種三角帆蛘基因型快速精確鑒定方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn) 三角帆蛘基因型快速精確鑒定方法，具體包括如下
1、三角帆蛘基因組DNA的抽提步驟取三角帆蛘組織用Chelex-IOO溶液，從三角帆蛘組織中抽提出含基因組DNA的上清 液，用0. 8-1%的瓊脂糖膠電泳檢測；
2、三角帆蛘SSR序列擴增步驟
采用上述上清液作為DNA模板，進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測， EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄；
3、三角帆蛘基因型鑒定
凝膠電泳預檢測合格的PCR擴增反應產(chǎn)物，采用ABI3730核酸分析儀檢測，用 GeneMapper軟件(Applied Biosystems)進行基因型分析，并由Excel格式輸出結(jié)果。(請 補充如何分析)
所述三角帆蛘基因組DNA的抽提步驟，具體如下
A.將Chelex-IOO溶于無菌水中，配制成Chelex-IOO溶液；
B.取500uL該Chelex-IOO樹脂溶液于1.5mL的Eppendorf離心管中；
C.取IXIX Imm的三角帆蛘組織放入盛有Chelex-100的離心管中，加入10mg/mL的 蛋白酶K15uL ；
D.離心管放在搖床上(溫度50-60°C，轉(zhuǎn)速50rpm)震蕩lh，接著將該混合液在100°C 下溫浴15-30min，然后將蛋白質(zhì)徹底變性的混合液放在4°C -20°C條件下保存；
E.混合液在振蕩器上振蕩IOsec,然后10，000-15，OOOrpm離心2_5min，上清中含有
DNA ；
F.取5uL上清液，用1%的瓊脂糖膠電泳檢測；
上述步驟A中，在60°C條件下將Chelex-100溶于無菌水中，配置成10%濃度的 Chelex-100 溶液。所述步驟D步中，將蛋白質(zhì)徹底變性后的混合液放在-20°C條件下保存。所述三角帆蛘SSR序列擴增步驟具體如下
所述三角帆蛘SSR序列擴增步驟中微衛(wèi)星的正向引物采用FAM熒光染料進行標記； PCR 反應體系為 25μ ，含 IOXBuffer 2. 5PL，Mg2+ 2mmol/dm3, dNTP 0. 2mmol/dm3, Taq DNA 聚合酶IU，上、下游引物各0. 2Mmol/dm3,模板DNA5uL ；PCR反應條件94°C預變性3min， (94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)進行38個循環(huán)，最后72°C延伸5min ； PCR擴 增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。本發(fā)明中基因組DNA抽提方法區(qū)別于已有的酚氯仿DNA提取法，在DNA提取過程 中實現(xiàn)了細胞裂解和DNA萃取的同步化，節(jié)約了 DNA萃取和純化步驟，省時省力，且對人體 無害；其次，本發(fā)明中的三角帆蛘微衛(wèi)星序列擴增的PCR體系是更優(yōu)化的；另外，本發(fā)明 采用ABI3730核酸分析儀檢測，用GeneMapper軟件(Applied Biosystems)進行基因型分 析，精確度可達lbp，建立了三角帆蛘微衛(wèi)星精確分型方法，克服了傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳和 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測靈敏度低，準確性差的問題。
具體實施例方式
應理解本發(fā)明所述的實施例僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行的描述，并非對本發(fā)明 構(gòu)思和范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計思想的前提下，本領(lǐng)域中工程技術(shù)人員對本發(fā) 明的技術(shù)方案做出的各種變型和改進，均應落入本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明請求保護的技 術(shù)內(nèi)容，已經(jīng)全部記載在權(quán)利要求書中。
本具體實施方式
的三角帆蛘基因型鑒定 1.三角帆蛘基因組DNA的提取
首先將Chelex-IOO在60°C條件下溶于無菌水中，配制濃度為10%的Chelex-IOO溶液， 然后取500uL10%的Chelex-IOO樹脂溶液于1. 5mL的Eppendorf離心管中，再取少量三角 帆蛘組織(約IX IX Imm)放入盛有Chelex-100的離心管中，加入10mg/mL的蛋白酶K15uL， 將離心管放在搖床上(溫度55 °C，轉(zhuǎn)速50rpm)震蕩lh，接著將該混合液在IOiTC條件下 溫浴15min，將蛋白質(zhì)徹底變性，該混合液可以放在-20°C保存。使用前，混合液在振蕩器上 振蕩lOsec，然后13，000印111離心31^11，上清中含有0嫩，取51^上清液，用1%的瓊脂糖膠電 泳檢測。2.三角帆蛘SSR序列擴增
采用上述上清液作為DNA模板，進行PCR擴增，其中，微衛(wèi)星的正向引物須采用FAM等 熒光染料進行標記，gCAM2-ATGT-Fl :FAM_ACAAAATGTTCGCAAATAACTGTA，gCAM2_ATGT_Rl CACTCGGAATGCCTCCCTGATT。PCR 反應體系為 25μ ，含 IOXBuffer 2. 5PL，Mg2+ 2mmol/dm3, dNTP 0. 2mmol/dm3,Taq DNA 聚合酶 1U，上、下游引物各 0. 2Mmol/dm3，模板 DNA5uL。PCR 反 應條件先94°C預變性3min，而后94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，共進行38 個循環(huán)，最后72°C延伸5min。 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成 像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。3.三角帆蛘基因型鑒定
凝膠電泳預檢測合格的PCR擴增反應產(chǎn)物，采用ABI3730核酸分析儀檢測，用 GeneMapper軟件(Applied Biosystems)進行基因型分析，并由Excel格式輸出結(jié)果。
權(quán)利要求
三角帆蚌基因型快速精確鑒定方法，其特征在于，具體包括如下1)、三角帆蚌基因組DNA的抽提步驟取三角帆蚌組織用Chelex 100溶液，從三角帆蚌組織中抽提出含基因組DNA的上清液，用0.8 1%的瓊脂糖膠電泳檢測；2)、三角帆蚌SSR序列擴增步驟采用上述上清液作為DNA模板，進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄；3)、三角帆蚌基因型鑒定凝膠電泳預檢測合格的PCR擴增反應產(chǎn)物，采用ABI3730核酸分析儀檢測，用GeneMapper軟件(Applied Biosystems)進行基因型分析，并由Excel格式輸出結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的三角帆蛘基因型快速精確鑒定方法，其特征在于，所述三角帆 蛘基因組DNA的抽提步驟，具體如下A.將Chelex-IOO溶于無菌水中，配制成Chelex-IOO溶液；B.取500uL該Chelex-IOO樹脂溶液于1.5mL的Eppendorf離心管中；C.取1X 1 X Imm的三角帆蛘組織放入盛有Chelex-100的離心管中，加入10mg/mL的 蛋白酶K15uL;D.離心管放在搖床上(溫度50-60°C，轉(zhuǎn)速50rpm)震蕩lh，接著將該混合液在100°C 下溫浴15-30min，然后將蛋白質(zhì)徹底變性的混合液放在4°C -20°C條件下保存；E.混合液在振蕩器上振蕩IOsec,然后10，000-15，OOOrpm離心2_5min，上清中含有DNA ；F.取5uL上清液，用1%的瓊脂糖膠電泳檢測；如權(quán)利要求2所述的三角帆蛘基因型快速精確鑒定方法，其特征在于，所述步驟A中， 在60°C條件下將Chelex-100溶于無菌水中，配置成10%濃度的Chelex-100溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的三角帆蛘基因型快速精確鑒定方法，其特征在于，所述步驟D 步中，將蛋白質(zhì)徹底變性后的混合液放在-20 V條件下保存。
4.如權(quán)利要求1所述的三角帆蛘基因型快速精確鑒定方法，其特征在于，所述三角帆 蛘SSR序列擴增步驟具體如下所述三角帆蛘SSR序列擴增步驟中微衛(wèi)星的正向引物采用FAM熒光染料進行標記； PCR 反應體系為 25μ ，含 IOXBuffer 2. 5PL，Mg2+ 2mmol/dm3, dNTP 0. 2mmol/dm3, Taq DNA 聚合酶IU，上、下游引物各0. 2Mmol/dm3,模板DNA5uL ；PCR反應條件94°C預變性3min， (94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s)進行38個循環(huán)，最后72°C延伸5min ； PCR擴 增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。
全文摘要
本發(fā)明的一種三角帆蚌基因型快速精確鑒定方法，包括三角帆蚌基因組DNA的快速提取，三角帆蚌微衛(wèi)星序列擴增和三角帆蚌基因型鑒定的方法。首先，利用Chelex100能有效除去非核酸有機物的特點，建立了Chelex-100DNA快速提取方法，實現(xiàn)了DNA提取過程中細胞裂解和DNA萃取的同步化；然后根據(jù)Chelex100法提取的DNA溶液特點，優(yōu)化PCR反應體系，建立了三角帆蚌微衛(wèi)星序列擴增的方法；最后，采用ABI3730核酸分析儀檢測，用GeneMapper軟件(AppliedBiosystems)進行基因型分析，建立了三角帆蚌基因型快速精確鑒定方法。此方法具有高效、快速、準確、對人體無害等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101993955SQ201010580578
公開日2011年3月30日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者李家樂, 林靜云, 白志毅, 羅明 申請人:上海海洋大學