一種鑒定水稻堊白主效基因的基因型的分子標記及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術領域，更具體地，涉及一種鑒定水稻堊白主效基因的基因型的分子標記及其應用。
【背景技術】
[0002]水稻是我國重要的農作物，稻米品質直接關系到水稻生產的經濟效益和人民的生活質量。堊白是稻米胚乳中不透明的部分，是我國稻米外觀品質中最重要的衡量指標之一。堊白粒率低、無堊白的稻米具有優(yōu)良的外觀特性；此外，堊白率低的稻米整精米率一般也相應較高，碾磨后碎米少，商品價值高。因此，低堊白水稻品種深受稻米加工企業(yè)和消費者的歡迎。水稻堊白性狀受遺傳因素和環(huán)境因素共同控制，其中遺傳因素是影響稻米堊白性狀的主要因素。
[0003]在優(yōu)質稻米品種選育過程中，低堊白特性一直是育種家的重要目標。傳統(tǒng)堊白性狀往往需要在水稻成熟獲得一定數(shù)量籽粒后，利用目測、圖像掃描等方法對堊白程度進行分級或者計算。目測方法由于主觀隨意性大，測定的靈敏度、準確性和可重復性均難以得到保證；而圖像掃描方法比較精確和客觀，但是操作相對繁瑣和費時，難以在育種早期世代進行選擇。因此，利用分子標記實現(xiàn)對堊白調控基因直接選擇，是實現(xiàn)水稻低堊白特性高效選擇的有效手段。
[0004]前人研宄表明，第5號染色體上編碼液泡膜質子轉運焦磷酸酶的L0C_0s05g06480，是影響水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質性狀的關鍵基因(Li Y, FanC， Xing Y， et al.Chalk5 encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphataseinfluencing grain chalkiness in rice.Nature genetics, 2014)。現(xiàn)有技術報道自然種質群體中該位點大致涵蓋7種單體型，系統(tǒng)發(fā)生樹的構建將這7種單體型歸為兩類，并找到若干個保守的SNP位點。其中，位于該基因的啟動子區(qū)域-576位的SNP位點T/C變異具有重要應用價值。因此，對該SNP位點進行基因分型可實現(xiàn)對不同堊白特性的分子鑒定，提高在育種早期世代的堊白特性選擇效率。
[0005]傳統(tǒng)SNP位點鑒定通常基于測序、酶切或基因芯片進行分析，在大量樣品鑒定時成本較高，難以滿足育種需求。四引物擴增受阻PCR (ARMS-PACR)能夠針對SNP位點進行特異等位擴增。針對已知的變異位點，于兩側分別設計I對外引物和I對特異性內引物，特異性內引物3’末端堿基必須落在突變點的位置上，從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。在同一次擴增中野生型和突變型基因產生的擴增片段長度不同，通過產物片段中特定條帶的有無判別個體的基因型，是一種共顯性分型技術，具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優(yōu)勢。
[0006]ARMS-PCR引物的設計是決定該技術檢測靈敏度的關鍵，其次，ARMS-PCR對SNP檢出率還依賴于反應條件的優(yōu)化。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術中水稻堊白鑒別存在的技術缺陷，提供一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標記。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子標記在鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型或/和堊白性狀中的應用。
[0009]本發(fā)明的第三個目的是提供上述分子標記在水稻育種中的應用。
[0010]本發(fā)明的第四個目的是利用上述分子標記鑒定水稻堊白性狀或同時鑒定水稻堊白性狀和水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0011]本發(fā)明的第五個目的是利用上述分子標記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0012]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的:
一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標記Chalk5-T/C，所述分子標記由一對外引物 Chalk5-0-F、Chalk5_0_R 和一對內引物 Chalk5_C_F、Chalk5_T_R 組成，引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0013]本發(fā)明所述分子標記是針對堊白基因的啟動子SNP位點“-576-T/C”設計，該分子標記涵蓋差異位點。
[0014]為了增加引物的特異性，本發(fā)明上述引物是利用在線tetra-primer ARMS-PCR引物設計工具 Primerl (http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)設計得到，同時，本發(fā)明所述內引物的3’端第3個堿基引入錯配堿基。
[0015]提供上述分子標記在鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型或/和水稻堊白性狀中的應用。
[0016]提供上述分子標記在水稻育種中的應用。
[0017]提供利用上述分子標記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法；具體地，該方法包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提??；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構建PCR反應體系，利用所述分子標記進行PCR擴增；
S3利用凝膠電泳或毛細管電泳分析PCR擴增后的產物，進行結果判定，所述結果判定為:若出現(xiàn)196bp和298bp條帶，則表明待測樣品的堊白主效基因為低堊白基因型；若出現(xiàn)150bp和298bp條帶，則表明待測樣品的堊白主效基因為高堊白基因型；若出現(xiàn)150bp、196bp和298bp條帶，則表明待測樣品的堊白主效基因為雜合型。
[0018]提供利用上述分子標記鑒定水稻堊白性狀或同時鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型和水稻堊白性狀的方法，具體地，包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提取；
S2以SI得到的樣品DNA為模板，構建PCR反應體系，利用所述分子標記進行PCR擴增；
S3利用凝膠電泳或毛細管電泳分析PCR擴增后的產物，進行結果判定，所述結果判定為:若出現(xiàn)196bp和298bp條帶，則表明待測樣品的堊白主效基因為低堊白基因型，待測樣品為低堊白品種；若出現(xiàn)150bp和298bp條帶，則表明待測樣品的堊白主效基因為高堊白基因型，待測樣品為高堊白品種；若出現(xiàn)150bp、196bp和298bp條帶，則表明待測樣品的堊白主效基因為雜合型，待測樣品為中間型品種。
[0019]ARMS-PCR檢測的靈敏度除了決定于引物的特異性之外，還受到PCR反應各種條件的影響，如引物濃度、退火溫度、TaqDNA聚合酶的濃度等，因此，優(yōu)選地，上述方法中，所述 PCR 反應體系為:DNA 模板 1.0 uL、Chalk5_C_F 0.5uL、Chalk5_T_R 0.5uL、Chalk5_0_F
0.3uL、Chalk5_0-R 0.3uL、2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL，用雙蒸滅菌水補足至15uL0
[0020]優(yōu)選地，上述方法中，所述PCR擴增的條件為:94 °C預變性5min，94 °C 30s，55°C 30s，72°C 35s共運行35個循環(huán)，最后72°C延伸1min。
[0021]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標記，該標記擴增片段適中、特異性強；利用該標記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型，不需要經過測序，僅僅通過簡單的PCR即可對水稻堊白主效基因進行基因分型，區(qū)分高、低堊白的水稻品種，實現(xiàn)了對水稻堊白性狀的分子標記輔助選擇，本發(fā)明所述分子標記可以用于水稻改良分離群體的分子標記輔助選擇，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說明】
[0022]圖1為Chalk5_T/C引物序列及位置示意圖；其中等位變異位點分別以紅色背景標識，弓I物錯配堿基以下劃線標識。
[0023]圖2為Chalk5_T/C擴增產物的凝膠電泳分型；其中:1_明恢63 ;2_巴斯馬蒂370 ；
3-珍汕 97B ；4-1R64 ;5_ 珍汕 97B/ 明恢 63。
[0024]圖3為Chalk5_T/C聯(lián)合全自動毛細管電泳檢測結果；其中M為DNA ladder ；1?10為檢測水稻材料，1、3、6為C/C型；2，8、10為T/T型；4、5、7、9為C/T型。
【具體實施方式】
[0025]下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實施例1水稻堊白基因功能性標記Chalk5_T/C的引物設計及擴增片段分析
1、引物設計
針對堊白基因Chalk5的啟動子SNP位點“-576-T/C”( T-高堊白品種，C-低堊白品種)，利用在線 tetra-primer ARMS-PCR 引物設計工具 Primerl(http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)設計涵蓋差異位點的功能標記Chalk5_T/C，同時在等位特異引物的3’端第3個堿基處引入錯配堿基，增加特異性(圖1)。所述的Chalk5-T/C由4個引物Chalk5_0_F、Chalk5-0-R、Chalk5-C-F 和 Chalk5_T_R 構成，引物序列(5’ _3’)如下:
ChaIk5-0-F:TCAAAAACCACCATTCGAAATGAChalk5-0-R:TGTGTATAAACATTTTTGTTGTTTTTGCAChalk5-C-F:CATTTTCAGTGCGTCCAAAACCChalk5-T-R:AAGTTATATACGGTGCGTCTCATGGA (引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯配堿基，加框的堿基為要檢測的變異堿基)
2、擴增片段分析
低堊白基因型(C/C純合型)、高堊白基因型(T/T純合型)和雜合型(C/T雜合型)，都能利用Chalk5-0-F和Chalk5-0-R擴增出大小約為298 bp的條帶，此帶可以用于PCR擴增與否的監(jiān)測。此外，低堊白基因型(C/C純合型)還能利用Chalk5-C-F和Chalk5-0-R擴增出一條196 bp的條帶；高堊白基因型(T/T純合型)能利用Chalk5-0-F和Chalk5-T-R擴增出一條150 bp的條帶；雜合型(C/T雜合型)既能擴增出196 bp的條帶又能擴增出150 bp的條帶。
[0027]實施例2利用功能性標記Chalk5_T/C分析5個水稻品種的堊白基因型 1、水稻基因組DNA的提取
以5個水稻品種為材料:明恢63、巴斯馬蒂370、珍汕97B、IR64、