一種鑒定水稻堊白主效基因的基因型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域,更具體地,涉及一種鑒定水稻堊白主效基因的基因型的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是我國重要的農(nóng)作物,稻米品質(zhì)直接關(guān)系到水稻生產(chǎn)的經(jīng)濟效益和人民的生活質(zhì)量。堊白是稻米胚乳中不透明的部分,是我國稻米外觀品質(zhì)中最重要的衡量指標(biāo)之一。堊白粒率低、無堊白的稻米具有優(yōu)良的外觀特性;此外,堊白率低的稻米整精米率一般也相應(yīng)較高,碾磨后碎米少,商品價值高。因此,低堊白水稻品種深受稻米加工企業(yè)和消費者的歡迎。水稻堊白性狀受遺傳因素和環(huán)境因素共同控制,其中遺傳因素是影響稻米堊白性狀的主要因素。
[0003]在優(yōu)質(zhì)稻米品種選育過程中,低堊白特性一直是育種家的重要目標(biāo)。傳統(tǒng)堊白性狀往往需要在水稻成熟獲得一定數(shù)量籽粒后,利用目測、圖像掃描等方法對堊白程度進行分級或者計算。目測方法由于主觀隨意性大,測定的靈敏度、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性均難以得到保證;而圖像掃描方法比較精確和客觀,但是操作相對繁瑣和費時,難以在育種早期世代進行選擇。因此,利用分子標(biāo)記實現(xiàn)對堊白調(diào)控基因直接選擇,是實現(xiàn)水稻低堊白特性高效選擇的有效手段。
[0004]前人研宄表明,第5號染色體上編碼液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運焦磷酸酶的L0C_0s05g06480,是影響水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因(Li Y, FanC, Xing Y, et al.Chalk5 encodes a vacuolar H+-translocating pyrophosphataseinfluencing grain chalkiness in rice.Nature genetics, 2014)。現(xiàn)有技術(shù)報道自然種質(zhì)群體中該位點大致涵蓋7種單體型,系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建將這7種單體型歸為兩類,并找到若干個保守的SNP位點。其中,位于該基因的啟動子區(qū)域-576位的SNP位點T/C變異具有重要應(yīng)用價值。因此,對該SNP位點進行基因分型可實現(xiàn)對不同堊白特性的分子鑒定,提高在育種早期世代的堊白特性選擇效率。
[0005]傳統(tǒng)SNP位點鑒定通常基于測序、酶切或基因芯片進行分析,在大量樣品鑒定時成本較高,難以滿足育種需求。四引物擴增受阻PCR (ARMS-PACR)能夠針對SNP位點進行特異等位擴增。針對已知的變異位點,于兩側(cè)分別設(shè)計I對外引物和I對特異性內(nèi)引物,特異性內(nèi)引物3’末端堿基必須落在突變點的位置上,從而選擇性地擴增突變型與野生型個體基因。在同一次擴增中野生型和突變型基因產(chǎn)生的擴增片段長度不同,通過產(chǎn)物片段中特定條帶的有無判別個體的基因型,是一種共顯性分型技術(shù),具有操作簡便、分型快速、費用低廉等優(yōu)勢。
[0006]ARMS-PCR引物的設(shè)計是決定該技術(shù)檢測靈敏度的關(guān)鍵,其次,ARMS-PCR對SNP檢出率還依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中水稻堊白鑒別存在的技術(shù)缺陷,提供一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標(biāo)記。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供上述分子標(biāo)記在鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型或/和堊白性狀中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的第三個目的是提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的第四個目的是利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白性狀或同時鑒定水稻堊白性狀和水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0011]本發(fā)明的第五個目的是利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法。
[0012]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的:
一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標(biāo)記Chalk5-T/C,所述分子標(biāo)記由一對外引物 Chalk5-0-F、Chalk5_0_R 和一對內(nèi)引物 Chalk5_C_F、Chalk5_T_R 組成,引物序列如SEQ ID NO:1?4所示。
[0013]本發(fā)明所述分子標(biāo)記是針對堊白基因的啟動子SNP位點“-576-T/C”設(shè)計,該分子標(biāo)記涵蓋差異位點。
[0014]為了增加引物的特異性,本發(fā)明上述引物是利用在線tetra-primer ARMS-PCR引物設(shè)計工具 Primerl (http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)設(shè)計得到,同時,本發(fā)明所述內(nèi)引物的3’端第3個堿基引入錯配堿基。
[0015]提供上述分子標(biāo)記在鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型或/和水稻堊白性狀中的應(yīng)用。
[0016]提供上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
[0017]提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的方法;具體地,該方法包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提?。?br> S2以SI得到的樣品DNA為模板,構(gòu)建PCR反應(yīng)體系,利用所述分子標(biāo)記進行PCR擴增;
S3利用凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析PCR擴增后的產(chǎn)物,進行結(jié)果判定,所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)196bp和298bp條帶,則表明待測樣品的堊白主效基因為低堊白基因型;若出現(xiàn)150bp和298bp條帶,則表明待測樣品的堊白主效基因為高堊白基因型;若出現(xiàn)150bp、196bp和298bp條帶,則表明待測樣品的堊白主效基因為雜合型。
[0018]提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻堊白性狀或同時鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型和水稻堊白性狀的方法,具體地,包括以下步驟:
SI待測樣品DNA提??;
S2以SI得到的樣品DNA為模板,構(gòu)建PCR反應(yīng)體系,利用所述分子標(biāo)記進行PCR擴增;
S3利用凝膠電泳或毛細(xì)管電泳分析PCR擴增后的產(chǎn)物,進行結(jié)果判定,所述結(jié)果判定為:若出現(xiàn)196bp和298bp條帶,則表明待測樣品的堊白主效基因為低堊白基因型,待測樣品為低堊白品種;若出現(xiàn)150bp和298bp條帶,則表明待測樣品的堊白主效基因為高堊白基因型,待測樣品為高堊白品種;若出現(xiàn)150bp、196bp和298bp條帶,則表明待測樣品的堊白主效基因為雜合型,待測樣品為中間型品種。
[0019]ARMS-PCR檢測的靈敏度除了決定于引物的特異性之外,還受到PCR反應(yīng)各種條件的影響,如引物濃度、退火溫度、TaqDNA聚合酶的濃度等,因此,優(yōu)選地,上述方法中,所述 PCR 反應(yīng)體系為:DNA 模板 1.0 uL、Chalk5_C_F 0.5uL、Chalk5_T_R 0.5uL、Chalk5_0_F
0.3uL、Chalk5_0-R 0.3uL、2XPower Taq PCR Master Mix 7.5uL,用雙蒸滅菌水補足至15uL0
[0020]優(yōu)選地,上述方法中,所述PCR擴增的條件為:94 °C預(yù)變性5min,94 °C 30s,55°C 30s,72°C 35s共運行35個循環(huán),最后72°C延伸1min。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了一種鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型的分子標(biāo)記,該標(biāo)記擴增片段適中、特異性強;利用該標(biāo)記鑒定水稻堊白主效基因Chalk5基因型,不需要經(jīng)過測序,僅僅通過簡單的PCR即可對水稻堊白主效基因進行基因分型,區(qū)分高、低堊白的水稻品種,實現(xiàn)了對水稻堊白性狀的分子標(biāo)記輔助選擇,本發(fā)明所述分子標(biāo)記可以用于水稻改良分離群體的分子標(biāo)記輔助選擇,提高育種效率,滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說明】
[0022]圖1為Chalk5_T/C引物序列及位置示意圖;其中等位變異位點分別以紅色背景標(biāo)識,弓I物錯配堿基以下劃線標(biāo)識。
[0023]圖2為Chalk5_T/C擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分型;其中:1_明恢63 ;2_巴斯馬蒂370 ;
3-珍汕 97B ;4-1R64 ;5_ 珍汕 97B/ 明恢 63。
[0024]圖3為Chalk5_T/C聯(lián)合全自動毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果;其中M為DNA ladder ;1?10為檢測水稻材料,1、3、6為C/C型;2,8、10為T/T型;4、5、7、9為C/T型。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容,但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下,對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換,均屬于本發(fā)明的范圍;若未特別指明,實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實施例1水稻堊白基因功能性標(biāo)記Chalk5_T/C的引物設(shè)計及擴增片段分析
1、引物設(shè)計
針對堊白基因Chalk5的啟動子SNP位點“-576-T/C”( T-高堊白品種,C-低堊白品種),利用在線 tetra-primer ARMS-PCR 引物設(shè)計工具 Primerl(http://primerl.soton.ac.uk/primerl.html)設(shè)計涵蓋差異位點的功能標(biāo)記Chalk5_T/C,同時在等位特異引物的3’端第3個堿基處引入錯配堿基,增加特異性(圖1)。所述的Chalk5-T/C由4個引物Chalk5_0_F、Chalk5-0-R、Chalk5-C-F 和 Chalk5_T_R 構(gòu)成,引物序列(5’ _3’)如下:
ChaIk5-0-F:TCAAAAACCACCATTCGAAATGAChalk5-0-R:TGTGTATAAACATTTTTGTTGTTTTTGCAChalk5-C-F:CATTTTCAGTGCGTCCAAAACCChalk5-T-R:AAGTTATATACGGTGCGTCTCATGGA (引物序列中帶下劃線的堿基為引入的錯配堿基,加框的堿基為要檢測的變異堿基)
2、擴增片段分析
低堊白基因型(C/C純合型)、高堊白基因型(T/T純合型)和雜合型(C/T雜合型),都能利用Chalk5-0-F和Chalk5-0-R擴增出大小約為298 bp的條帶,此帶可以用于PCR擴增與否的監(jiān)測。此外,低堊白基因型(C/C純合型)還能利用Chalk5-C-F和Chalk5-0-R擴增出一條196 bp的條帶;高堊白基因型(T/T純合型)能利用Chalk5-0-F和Chalk5-T-R擴增出一條150 bp的條帶;雜合型(C/T雜合型)既能擴增出196 bp的條帶又能擴增出150 bp的條帶。
[0027]實施例2利用功能性標(biāo)記Chalk5_T/C分析5個水稻品種的堊白基因型 1、水稻基因組DNA的提取
以5個水稻品種為材料:明恢63、巴斯馬蒂370、珍汕97B、IR64、