本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及用于多基因捕獲測序的單鏈探針制備方法。
背景技術(shù)：
：基于雜交的靶向序列捕獲技術(shù)根據(jù)雜交時(shí)狀態(tài)不同，主要分為固相雜交和液相雜交。固相雜交序列捕獲技術(shù)是一種將寡核苷酸探針合成在芯片上，并在芯片上進(jìn)行雜交的高通量序列捕獲技術(shù)，可以在一個(gè)芯片上捕獲整個(gè)外顯子甚至更大的區(qū)域。但因?yàn)樾酒系墓押塑账崃枯^少，所以就需要較大的樣本起始量來推動雜交的發(fā)生。而液相雜交是通過在溶液中，目標(biāo)dna片段和已帶有生物素標(biāo)記探針直接雜交，然后通過生物素親和素的反應(yīng)使目標(biāo)dna片段錨定在帶有親和素的微珠上，洗去非目標(biāo)dna，洗脫后，富集的dna用于測序。與固相雜交相比，液相雜交在動力學(xué)上更具優(yōu)勢，雜交效率更高，能降低對于樣品起始量的要求。此外，液相雜交更易于操作，時(shí)間短，便于自動化操作。相對于液相雜交而言，固相雜交已逐漸被淘汰，而液相雜交中的探針又可分為rna探針和dna探針。目前，市場上有代表性的提供探針的三家公司分別為安捷倫，羅氏和idt，其中，安捷倫主要生產(chǎn)rna探針，而羅氏和idt主要生產(chǎn)dna探針。與dna探針相比，由于rna探針的不穩(wěn)定性，使其在運(yùn)輸、保存及應(yīng)用等方面均不方便，成本更高。而羅氏和idt的dna探針的合成是通過柱式合成而后混合到一起的，而非芯片式合成的，相對與全外顯子的量，合成的的代價(jià)也是極其昂貴的，是極不易于推廣的。雖然市場上也有基于芯片式合成后通過pcr獲得的dna探針，但它們都是雙鏈dna探針。與安捷倫、羅氏和idt的單鏈探針相比，雜交效率大大的降低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的：提供一種用于多基因捕獲測序的單鏈探針制備方法，包括捕獲目標(biāo)基因的探針制備技術(shù)及其在二代測序中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種多基因捕獲測序的單鏈探針制備方法，方法至少包括如下步驟：(1)芯片合成，合成不同寡核苷酸數(shù)量的芯片，所述的芯片包含能夠與靶序列結(jié)合的80bp-120bp目標(biāo)區(qū)域堿基，目標(biāo)區(qū)域堿基兩端分別連接15-20bp堿基末端；(2)芯片dna洗脫；(3)用含dutp的pcr反應(yīng)體系擴(kuò)增芯片dna，dutp摩爾濃度范圍為5μm-750μm；(4)pcr產(chǎn)物用磁珠純化；(5)將步驟(4)中純化的pcr產(chǎn)物稀釋，作為下一步pcr的模板，使用單引物偏向擴(kuò)增，該引物5’端經(jīng)生物素標(biāo)記，得到含有生物素單鏈與含有dutp的鏈的雜合雙鏈dna；(6)加入能夠識別并切除dutp的酶，將(5)步中的含有dutp的母鏈消化；(7)消化后產(chǎn)物經(jīng)純化，得到含有生物素標(biāo)記的單鏈探針；(8)對制備的單鏈探針進(jìn)行電泳檢測和濃度測定，得到每種單鏈探針物質(zhì)的量為nmol級別，將質(zhì)檢合格的探針稀釋保存。優(yōu)選的，所述的芯片序列如下：5′-...gacgcgtggatcatct(n)ntgcattgcgtgtagcga...-3′,注：虛線“...”代表可延伸的堿基末端,n選自a、c、t、g；n表示80～120的正整數(shù)。優(yōu)選的，所述的步驟(2)中芯片dna洗脫包括：將芯片上合成的寡核酸庫洗脫，并溶于10mmtris-hcl，0.1mmedta，ph＝8.0，每個(gè)寡核苷酸的濃度為fmol級別，擴(kuò)增得到nmol級別。優(yōu)選的，所述的步驟(3)中pcr擴(kuò)增所需引物序列如seqidno.1與seqidno.2、seqidno.3與seqidno.4或者seqidno.5與seqidno.6。優(yōu)選的，所述的步驟(3)中pcr反應(yīng)體系擴(kuò)增條件為：優(yōu)選的，所述的步驟(4)中磁珠為1.3×至1.8×ampure磁珠。優(yōu)選的，所述的步驟(5)中生物素標(biāo)記的單引物偏向擴(kuò)增具體序列如seqidno.1、seqidno.3或seqidno.5。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述的步驟(5)中單引物偏向擴(kuò)增，50μlpcr反應(yīng)體系下：pcr反應(yīng)條件，如下：根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)一步的特征，所述的步驟(6)中能夠識別并切除dutp的酶為udg酶，加入量為1u-5u，在37℃下，作用30-60min。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案更進(jìn)一步的特征，所述的步驟(8)中制備的單鏈探針用4％的瓊脂糖電泳驗(yàn)證產(chǎn)物，目的條帶在120-160bp左右；得到每種單鏈探針物質(zhì)的量為nmol級別，探針總質(zhì)量為3-4微克，用nanodrop測定探針產(chǎn)物濃度為150-200ng/μl，將質(zhì)檢合格的探針，稀釋至濃度為20ng/μl，進(jìn)行分裝保存，保存條件為-20℃。本發(fā)明的有益效果：(1)制備的探針為dna探針，相比較rna探針，解決了保存不穩(wěn)定性，在運(yùn)輸、保存及應(yīng)用等方面不方便等問題。(2)制備的探針為dna單鏈探針，相比較羅氏nimblegen探針市場上的單鏈探針，具有一致的雜交驅(qū)動力，但是在制備的成本與價(jià)格上具有較大的優(yōu)勢，我們的探針單次捕獲的成本低于100元。(3)獨(dú)創(chuàng)的單鏈dna獲得方式：在探針的擴(kuò)增過程，底物包含dutp，獲得含有dutp的雙鏈產(chǎn)物；再利用含有生物素標(biāo)記的引物，進(jìn)行偏向擴(kuò)增，底物為普通的dntps，獲得中間產(chǎn)物：含有生物素單鏈與含有dutp的鏈的雜合雙鏈dna，制備方法簡單且成本較低。(4)在制備dna單鏈探針時(shí)，由于與生物素的單鏈探針互補(bǔ)的dna單鏈中含有dutp，利用udg酶將與生物素的單鏈探針互補(bǔ)的dna單鏈消化，通過生物酶切的方法制備單鏈探針，代替了使用強(qiáng)堿解開dna雙鏈、通過蛋白變性使探針與鏈霉親分離，對dna的損害小，且單鏈探針的得率高。一般對于核酸而言，文中所提及的“富集”是指增加樣本中特定核酸種類的相對濃度。偏向擴(kuò)增文中指pcr使用單引物擴(kuò)增。術(shù)語“靶序列”通常是指具有特定科學(xué)、醫(yī)學(xué)或農(nóng)學(xué)相關(guān)性的核酸中感興趣的區(qū)域。靶序列可以是全部核酸分子或部分核酸分子。靶序列可包括但不限于人、動物、植物、微生物的基因組或外顯子序列中的一個(gè)或多個(gè)、突變周圍的一小段核酸序列、一個(gè)或多個(gè)重復(fù)序列、cdna序列、內(nèi)含子序列和調(diào)控序列。一個(gè)酶活單位(u)的定義：1分鐘內(nèi)，從雙鏈dna中降解60pmol的尿嘧啶所需的酶量。酶活測定條件：50μl反應(yīng)體系，37℃30min內(nèi)，測定0.2μgdna(104-105cpm/μg)釋放的含有[3h]標(biāo)記的尿嘧啶。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：圖1為捕獲前actb與egfr的擴(kuò)增情況；其中1為：actb擴(kuò)增曲線；2為egfr擴(kuò)增曲線圖圖2為捕獲后actb與egfr的擴(kuò)增情況；其中1為：actb擴(kuò)增曲線；2為egfr擴(kuò)增曲線圖圖3為捕獲靶區(qū)域的測序深度圖圖4為捕獲前gapdh與kras的擴(kuò)增情況；其中1為：gapdh擴(kuò)增曲線；2為kras擴(kuò)增曲線圖圖5為捕獲后gapdh與kras的擴(kuò)增情況；其中1為：gapdh擴(kuò)增曲線；2為kras擴(kuò)增曲線圖圖6為捕獲靶區(qū)域的測序深度圖圖7為捕獲前rna28sn5與braf的擴(kuò)增情況；其中1為：rna28sn5擴(kuò)增曲線；2為braf擴(kuò)增曲線圖圖8為捕獲后rna28sn5與braf的擴(kuò)增情況；其中1為：rna28sn5擴(kuò)增曲線；2為braf擴(kuò)增曲線圖圖9為捕獲靶區(qū)域的測序深度圖具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例1下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。材料：合成芯片(customarray公司)、待測的dna(打斷的組織樣本dna)儀器：普通pcr儀(mg96g)、磁力架(biomag)、電泳儀、nanodrop分光光度計(jì)、二代測序儀(illumina)試劑：dna聚合酶(羅氏公司)、10×pcrbuffer(羅氏公司)、mgcl2(羅氏公司)、dntp(takara)、dutp(takara)、udg酶(neb)、純化水。單鏈探針制備過程：(1)芯片合成:合成12k的寡核苷酸數(shù)量的芯片，所述的芯片包含80bp-120bp目標(biāo)區(qū)域和兩端通用的堿基末端：其中5′端連接16個(gè)堿基，3′端連接17個(gè)堿基，該芯片為目標(biāo)區(qū)域含egfr基因的芯片，具體序列如seqidno.7：5′-gacgcgtggatcatctgaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccattgcattgcgtgtagcga-3′；(2)芯片dna洗脫：將芯片上合成的寡核酸庫洗脫，并溶于80μl的緩沖液中，緩沖液為te緩沖液，其組成為10mmtris-hcl，0.1mmedta，調(diào)節(jié)ph＝8.0，每個(gè)寡核苷酸的濃度為fmol級別，擴(kuò)增得到所需濃度。(3)芯片dna擴(kuò)增：pcr反應(yīng)中所需引物的具體序列為：引物fseqidno.1：5′-gacgcgtggatcatct-3′，引物rseqidno.2：5′-tcgctacacgcaatgca-3′；pcr反應(yīng)體系中加入dutp，pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別見表1和表2。表1：pcr反應(yīng)體系表2：pcr反應(yīng)件(4)pcr產(chǎn)物的純化：用1.8×ampure磁珠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化1)將pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，取90μl磁珠加入pcr產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。室溫靜置5min；2)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清約5分鐘，小心移除上清；3)保持離心管始終處于磁力架中，用新配置的80％的乙醇清洗2次。4)保持離心管置于磁力架上并開蓋，室溫2min，保證乙醇揮發(fā)完全。5)將離心管從磁力架上移走，加入22.5μl的ddh20加入進(jìn)行洗脫，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。室溫靜置2min。6)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清約5分鐘，小心將上清移至一個(gè)新的離心管。注意：保證磁珠置于室溫半個(gè)小時(shí)，平衡至室溫后才可使用。在使用前確保將磁珠混勻。(5)將第(4)步純化的pcr產(chǎn)物稀釋100倍后，作為下一步pcr的模板。該pcr反應(yīng)為偏向擴(kuò)增，使用的引物為單引物，該引物為5′端生物素標(biāo)記，具體序列如下：seqidno.1：5′biotin-gacgcgtggatcatct-3′；pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見表3和表4。表3：pcr反應(yīng)體系10×pcrbuffer稀釋至1×mgcl23.5mm生物素標(biāo)記的引物0.2μmdntps0.5mmtaq酶5u模板1μl補(bǔ)ddh20至50μl表4：pcr反應(yīng)條件(6)加入udg酶，將第(5)步中的含有dutp的母鏈消化。具體操作如下：將第(5)步的pcr產(chǎn)物中，加入1u的udg酶，在37℃下，作用45min。(7)酶消化后的產(chǎn)物的純化：用1.8×ampure磁珠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后洗脫于22.5μl水中，洗脫取上清可得20μl。具體步驟詳見(4)。純化的產(chǎn)物即為帶有生物素的單鏈探針。(8)對制備的單鏈探針進(jìn)行電泳檢測和濃度測定，并進(jìn)行稀釋進(jìn)行分裝保存，用4％膠跑pcr產(chǎn)物，目的條帶在120-160bp左右，用nanodrop測定產(chǎn)物濃度，濃度為：176ng/μl，將質(zhì)檢合格的探針稀釋至濃度為20ng/μl，進(jìn)行分裝保存，保存條件為-20℃。單鏈探針的應(yīng)用1、基因組dna片段化采用超聲儀和設(shè)定的程序，將組織樣本dna打斷成約200bp。2、添加測序接頭打斷后的dna用kapa試劑盒進(jìn)行測序接頭的添加；3、雜交與富集將添加接頭后的dna片段與合成的探針進(jìn)行液相雜交24h，用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行回收，隨后進(jìn)行pcr擴(kuò)增建立文庫。4、測序及數(shù)據(jù)分析將靶向富集前的文庫和靶向富集后的文庫分別利用illumana高通量測序儀進(jìn)行測序，將測序數(shù)據(jù)利用bowtie軟件與ncbi的人類基因組數(shù)據(jù)庫(hg19)進(jìn)行比對得到初步的測序結(jié)果。結(jié)果分析靶序列片段的富集效率比較靶序列片段的富集效率通過定量pcr的比較進(jìn)行驗(yàn)證，如表所示，對于樣本在雜交捕獲富集前，取1ng片段化的dna，選擇探針覆蓋的egfr基因和探針未覆蓋的actb基因進(jìn)行ct值比較，ct值分別為31和29。經(jīng)過雜交捕獲富集后，同樣取1ng模板，egfr基因的ct值下降到16，而actb基因的ct值則增加至40左右。候選區(qū)域的目的基因egfr的ct值減少了15，表明其富集效率高達(dá)215(約32768)倍，非候選區(qū)域的基因actb的ct值增加了11，表明被稀釋了211(約2048)倍。捕獲富集前后的cp值對比詳見表5。捕獲富集前的擴(kuò)增見圖1，捕獲富集后的擴(kuò)增見圖2。表5：捕獲富集前后的cp值對比測序數(shù)據(jù)分析靶序列片段的富集效率通過測序結(jié)果的比較進(jìn)行驗(yàn)證，如表所示，對于樣本在雜交捕獲富集前后，同樣獲得約30g的數(shù)據(jù)量，捕獲富集前測序50個(gè)基因panel(共658個(gè)區(qū)域，558,934bp)的平均深度僅為約9.9x，50個(gè)基因panel內(nèi)的數(shù)據(jù)占比僅為1.86x10-4，而通過捕獲后測序50個(gè)基因panel的平均深度為約45,729x，50個(gè)基因panel內(nèi)的數(shù)據(jù)占比約79.1％，富集效率約4246倍。捕獲富集前后的數(shù)據(jù)對比見表6。捕獲富集的上機(jī)深度見圖3。表6：捕獲富集前后的數(shù)據(jù)對比腫瘤突變熱點(diǎn)基因panel，見表7。表7：panel中的基因列表abl1egfrgnaqkrasptpn11akt1erbb3her2metrb1alkerbb4hnf1amlh1retapcfbxw7hrasmplsmad4atmfgfr1idh1notch1smarcb1braffgfr2jak2npm1smocdh1fgfr3jak3nrassrccdkn2aflt3idh2pdgfrastk11csf1rgna11kdrpik3catp53ctnnb1gnaskitptenvhl實(shí)施例2材料、儀器、試劑同實(shí)施例1單鏈探針制備過程：(1)芯片合成:合成60k的寡核苷酸數(shù)量的芯片，所述的芯片包含80bp-120bp目標(biāo)區(qū)域和兩端通用的堿基末端：其中5′端連接16個(gè)堿基，3′端連接17個(gè)堿基，該芯片為目標(biāo)區(qū)域含kras基因的芯片，具體序列如seqidno.8：5′-gacgccgtgtagcgatctgaattagctgtatcgtcaaggcactcttgcctacgccaccagctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcaggccttattgcatcgagtgcacgg-3′；(2)芯片dna洗脫：將芯片上合成的寡核酸庫洗脫，并溶于80μl的te中，每個(gè)寡核苷酸的濃度為fmol級別，擴(kuò)增得到所需濃度。(3)芯片dna擴(kuò)增：pcr反應(yīng)中所需引物的具體序列為：引物fseqidno.3：5′-gacgccgtgtagcgat-3′，引物rseqidno.4：5′-ccgtgcactcgatgca-3′；pcr反應(yīng)中加入dutp，pcr反應(yīng)體系和條件分別見表8和表9。表8：pcr反應(yīng)體系10×pcrbuffer稀釋至1×mgcl23.5mm引物f0.2μm引物r0.2μmdntps0.5mmdutp0.1mmtaq酶5u模板1μl補(bǔ)ddh20至50μl表9：pcr反應(yīng)條件(4)pcr產(chǎn)物的純化：用1.8×ampure磁珠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化1)將pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，取90μl磁珠加入pcr產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。室溫靜置5min；2)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清約5分鐘，小心移除上清；3)保持離心管始終處于磁力架中，用新配置的80％的乙醇清洗2次。4)保持離心管置于磁力架上并開蓋，室溫2min，保證乙醇揮發(fā)完全。5)將離心管從磁力架上移走，加入22.5μl的ddh20加入進(jìn)行洗脫，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。室溫靜置2min。6)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清約5分鐘，小心將上清移至一個(gè)新的離心管。注意：保證磁珠置于室溫半個(gè)小時(shí)，平衡至室溫后才可使用。在使用前確保將磁珠混勻。(5)將第(4)步純化的pcr產(chǎn)物稀釋100倍后，作為下一步pcr的模板。該pcr反應(yīng)為偏向擴(kuò)增，使用的引物為單引物，該引物為5端生物素標(biāo)記，具體序列如下：seqidno.3：5′biotin-gacgccgtgtagcgat-3′；pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別見表10和表11。表10：pcr反應(yīng)條件10×pcrbuffer稀釋至1×mgcl23.5mm生物素標(biāo)記的引物0.2μmdntps0.5mmtaq酶5u模板1μl補(bǔ)ddh20至50μl表11：pcr反應(yīng)條件:(6)加入udg酶，將第(5)步中的含有dutp的母鏈消化。具體操作如下：將第(5)步的pcr產(chǎn)物中，加入3u的udg酶，在37℃下，作用45min。(7)酶消化后的產(chǎn)物的純化：用1.8×ampure磁珠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后洗脫于22.5μl水中，洗脫取上清可得20μl。具體步驟詳見(4)。純化的產(chǎn)物即為帶有生物素的單鏈探針。(8)對制備的單鏈探針進(jìn)行電泳檢測和濃度測定，并進(jìn)行稀釋進(jìn)行分裝保存。用4％膠跑pcr產(chǎn)物，目的條帶在120-160bp左右用nanodrop測定產(chǎn)物濃度，濃度為172ng/μl。將質(zhì)檢合格的探針，稀釋至濃度為20ng/μl，進(jìn)行分裝保存，保存條件為-20℃。單鏈探針的應(yīng)用1、基因組dna片段化采用超聲儀和設(shè)定的程序，將組織樣本dna打斷成約200bp。2、添加測序接頭打斷后的dna用kapa試劑盒進(jìn)行測序接頭的添加。3、雜交與富集將添加接頭后的dna片段與合成的探針進(jìn)行液相雜交24h，用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行回收，隨后進(jìn)行pcr擴(kuò)增建立文庫。4、測序及數(shù)據(jù)分析將靶向富集前的文庫和靶向富集后的文庫分別利用illumana高通量測序儀進(jìn)行測序，將測序數(shù)據(jù)利用bowtie軟件與ncbi的人類基因組數(shù)據(jù)庫(hg19)進(jìn)行比對得到初步的測序結(jié)果。結(jié)果分析：靶序列片段的富集效率比較靶序列片段的富集效率通過定量pcr的比較進(jìn)行驗(yàn)證，如表所示，對于樣本在雜交捕獲富集前，取1ng片段化的dna，選擇探針覆蓋的kras基因和探針未覆蓋的gapdh基因進(jìn)行ct值比較，ct值分別為29和27。經(jīng)過雜交捕獲富集后，同樣取1ng模板，kras基因的ct值下降到16，而gapdh基因值則增加至41左右。候選區(qū)域的目的基因kras的ct值減少了13，表明其富集效率高達(dá)213(約8192)倍，非候選區(qū)域的基因gapdh的ct值增加了14，表明被稀釋了214(約16384)倍。捕獲富集前后的cp值比較見表12。捕獲富集前的擴(kuò)增見圖4；捕獲富集后的擴(kuò)增見圖5。表12：捕獲富集前后的cp值對比測序數(shù)據(jù)分析靶序列片段的富集效率通過測序結(jié)果的比較進(jìn)行驗(yàn)證，如表所示，對于樣本在雜交捕獲富集前后，同樣獲得約30g的數(shù)據(jù)量，捕獲富集前測序50個(gè)基因panel(共658個(gè)區(qū)域，558,934bp)的平均深度僅為約9.8x，50個(gè)基因panel內(nèi)的數(shù)據(jù)占比僅為1.86x10-4，而通過捕獲后測序50個(gè)基因panel的平均深度為約45,729x，50個(gè)基因panel內(nèi)的數(shù)據(jù)占比約88.3％，富集效率約4739倍。捕獲富集前后的數(shù)據(jù)對比見表13。捕獲富集的上機(jī)深度見圖6。表13：捕獲富集前后的數(shù)據(jù)對比腫瘤突變熱點(diǎn)基因panel，見表14。表14：panel中的基因列表apcbrca1egfrfrfr2kitntrk2ros1arid1abrca2erbb2fgfr3krasntrk3smoakt1ccnd1erbb3flt3map2k1pdgfrastk11alkcdk4erbb4hrasmycpik3catp53arafcdk6fgf19jak1metptch1tsc1atmcdkn2afgf3jak2mtorptentsc2bimctnnb1fgf4jak3nrasraf1retbrafddr2fgfr1kdrntrk1實(shí)施例3材料、儀器、試劑同實(shí)施例1單鏈探針制備過程：(1)芯片合成:合成90k的寡核苷酸數(shù)量的芯片，所述的芯片包含80bp-120bp目標(biāo)區(qū)域和兩端通用的堿基末端，其中5′端連接18個(gè)堿基，3′端連接16個(gè)堿基，該芯片為目標(biāo)區(qū)域含braf基因的芯片，具體序列如seqidno.9：5′-gctcgcgagcacgatctatggatccagacaactgttcaaactgatgggacccactccatcgagatttcactgtagctagaccaaaatcacctatttttactgtgaggtcttcatgaagaacgtacgtgtgtacga-3′；(2)芯片dna洗脫：將芯片上合成的寡核酸庫洗脫，并溶于80μl的te中，每個(gè)寡核苷酸的濃度為fmol級別，擴(kuò)增得到所需濃度。(3)芯片dna擴(kuò)增：pcr反應(yīng)中所需引物的具體序列為：引物fseqidno.5：5′-gctcgcgagcacgatct-3′，引物rseqidno.6：5′-tcgtacacacgtacgt-3′；pcr反應(yīng)中加入dutp，pcr反應(yīng)體系和條件見表15和表16。表15：pcr反應(yīng)體系10×pcrbuffer稀釋至1×mgcl23.5mm引物f0.2μm引物r0.2μmdntps1.5mmdutp0.75mmtaq酶5u模板1μl補(bǔ)ddh20至50μl表16：pcr反應(yīng)條件(4)pcr產(chǎn)物的純化：用1.8×ampure磁珠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化1)將pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，取90μl磁珠加入pcr產(chǎn)物中，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。室溫靜置5min；2)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清約5分鐘，小心移除上清；3)保持離心管始終處于磁力架中，用新配置的80％的乙醇清洗2次；4)保持離心管置于磁力架上并開蓋，室溫2min，保證乙醇揮發(fā)完全。5)將離心管從磁力架上移走，加入22.5μl的ddh20加入進(jìn)行洗脫，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻。室溫靜置2min；6)將反應(yīng)管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清約5分鐘，小心將上清移至一個(gè)新的離心管。注意：保證磁珠置于室溫半個(gè)小時(shí)，平衡至室溫后才可使用。在使用前確保將磁珠混勻。(5)將第(4)步純化的pcr產(chǎn)物稀釋100倍后，作為下一步pcr的模板。該pcr反應(yīng)為偏向擴(kuò)增，使用的引物為單引物，該引物為5端生物素標(biāo)記，具體序列如下：seqidno.5：5′biotin-gctcgcgagcacgatct-3′；pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見表17和表18。表17：pcr反應(yīng)體系10×pcrbuffer稀釋至1×mgcl23.5mm生物素標(biāo)記的引物0.2μmdntps0.5mmtaq酶5u模板1μl補(bǔ)ddh20至50μl表18：pcr反應(yīng)條件(6)加入udg酶，將第(5)步中的含有dutp的母鏈消化。具體操作如下：將第(5)步的pcr產(chǎn)物中，加入5u的udg酶，在37℃下，作用45min。(7)酶消化后的產(chǎn)物的純化：用1.8×ampure磁珠對pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，最后洗脫于22.5μl水中，洗脫取上清可得20μl。具體步驟詳見(4)。純化的產(chǎn)物即為帶有生物素的單鏈探針。(8)對制備的單鏈探針進(jìn)行電泳檢測和濃度測定，并進(jìn)行稀釋進(jìn)行分裝保存。用4％膠跑pcr產(chǎn)物，目的條帶在120-160bp左右用nanodrop測定產(chǎn)物濃度，濃度為：182ng/μl。將質(zhì)檢合格的探針，稀釋至濃度為20ng/μl，進(jìn)行分裝保存，保存條件為-20℃。單鏈探針的應(yīng)用1、基因組dna片段化采用超聲儀和設(shè)定的程序，將組織樣本dna打斷成約200bp。2、添加測序接頭打斷后的dna用kapa試劑盒進(jìn)行測序接頭的添加；3、雜交與富集將添加接頭后的dna片段與合成的探針進(jìn)行液相雜交24h，用鏈霉親和素包被的磁珠進(jìn)行回收，隨后進(jìn)行pcr擴(kuò)增建立文庫。4、測序及數(shù)據(jù)分析將靶向富集前的文庫和靶向富集后的文庫分別利用illumana高通量測序儀進(jìn)行測序，將測序數(shù)據(jù)利用bowtie軟件與ncbi的人類基因組數(shù)據(jù)庫(hg19)進(jìn)行比對得到初步的測序結(jié)果。結(jié)果分析：靶序列片段的富集效率比較靶序列片段的富集效率通過定量pcr的比較進(jìn)行驗(yàn)證，如表所示，對于樣本在雜交捕獲富集前，取1ng片段化的dna，選擇探針覆蓋的braf基因和探針未覆蓋的rna28sn5基因進(jìn)行ct值比較，ct值均為31。經(jīng)過雜交捕獲富集后，同樣取1ng模板，braf基因的ct值下降到17，而rna28sn5基因值則增加至42左右。候選區(qū)域的目的基因braf的ct值減少了14，表明其富集效率高達(dá)214(約16384)倍，非候選區(qū)域的基因rna28sn5的ct值增加了11，表明被稀釋了211(2048)倍。捕獲富集前后的cp值比較見表19。捕獲富集前的擴(kuò)增見圖7；捕獲富集后的擴(kuò)增見圖8。表19：捕獲富集前后的cp值對比測序數(shù)據(jù)分析靶序列片段的富集效率通過測序結(jié)果的比較進(jìn)行驗(yàn)證，如表所示，對于樣本在雜交捕獲富集前后，同樣獲得約30g的數(shù)據(jù)量，捕獲富集前測序50個(gè)基因panel(共658個(gè)區(qū)域，558,934bp)的平均深度僅為約10.2x，50個(gè)基因panel內(nèi)的數(shù)據(jù)占比僅為1.99x10-4，而通過捕獲后測序50個(gè)基因panel的平均深度為約47,521x，50個(gè)基因panel內(nèi)的數(shù)據(jù)占比約87.9％，富集效率約4410倍。捕獲富集前后的數(shù)據(jù)對比見表20。捕獲富集的上機(jī)深度見圖9。表20：捕獲富集前后的數(shù)據(jù)對比腫瘤突變熱點(diǎn)基因panel，見表21。表21：panel中的基因列表<110>江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司<120>多基因捕獲測序的單鏈探針制備方法<160>9<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<220><400>1gacgcgtggatcatct16<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<220><400>2tcgctacacgcaatgca17<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列<220><400>3gacgccgtgtagcgat16<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列<220><400>4ccgtgcactcgatgca16<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列<220><400>5gctcgcgagcacgatct17<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列<220><400>6tcgtacacacgtacgt16<210>7<211>121<212>dna<213>人工序列<220><400>7gacgcgtggatcatctgaacgtactggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagatt60ttgggctggccaaactgctgggtgcggaagagaaagaataccattgcattgcgtgtagcg120a121<210>8<211>123<212>dna<213>人工序列<220><400>8gacgccgtgtagcgatctgaattagctgtatcgtcaaggcactcttgcctacgccaccag60ctccaactaccacaagtttatattcagtcattttcagcaggccttattgcatcgagtgca120cgg123<210>9<211>135<212>dna<213>人工序列<220><400>9gctcgcgagcacgatctatggatccagacaactgttcaaactgatgggacccactccatc60gagatttcactgtagctagaccaaaatcacctatttttactgtgaggtcttcatgaagaa120cgtacgtgtgtacga135當(dāng)前第1頁12