一種檢測柑橘衰退病毒t3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，包括以下步驟：1）提取待測樣品總RNA；2）以所提取的RNA為模板，利用T3基因型的特異性引物T3-4R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA；3）利用特異性引物T3-4F和T3-4R，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測；特異性引物T3-4F和T3-4R序列如下：T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT;T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA。該檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速高效、操作簡便、重復(fù)性好的特點(diǎn)。
【專利說明】—種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種柑橘衰退病毒的檢測方法，尤其是一種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]目前生物學(xué)中定量檢測的方法有轉(zhuǎn)磷光免疫層析技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等，其中實(shí)時(shí)突光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQPCR)技術(shù)在目前定量檢測技術(shù)中使用最廣泛，精確度最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。
[0003]Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是1996年美國PE公司發(fā)明的一種高靈敏度PCR試驗(yàn)方法。其技術(shù)原理是在PCR的反應(yīng)體系中加入一條帶有雙熒光標(biāo)記的探針，該探針能與模板核酸發(fā)生特異性雜交。探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM(6-羧基熒光素，熒光發(fā)射值在518nm處)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA (6-羧基四甲基羅丹明，熒光發(fā)射值在582nm處)。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，5’端FAM所發(fā)出的熒光被3’端TAMRA所吸收，不出現(xiàn)熒光信號(hào)的變化。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)合成的新鏈移動(dòng)到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq聚合酶將探針切斷，探針的完整性遭到破壞，3’端的淬滅作用被解除，5’端的FAM熒光信號(hào)被釋放出來。PCR每復(fù)制一個(gè)核苷酸片段，就有一個(gè)探針被切斷，同時(shí)一個(gè)熒光信號(hào)被釋放出來，產(chǎn)物與熒光信號(hào)產(chǎn)生一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)亦隨之增強(qiáng)，當(dāng)信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值時(shí)(根據(jù)熒光信號(hào)基線的平均值和平均標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出99.7%的置信度大于平均值的熒光值，即為閾值)，此時(shí)的循環(huán)次數(shù)即循環(huán)閾值Ct (cycle threshold, Ct)被記錄下來。該循環(huán)參數(shù)Ct和PCR體系中起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系。利用不同梯度的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增的Ct值和該陽性定量標(biāo)準(zhǔn)的模板數(shù)經(jīng)過對(duì)數(shù)擬合制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確的確定起始模板的數(shù)量，因此根據(jù)PCR產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量。
[0004]SYBR Green I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBRGreen I的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR GreenI在核酸的實(shí)時(shí)檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以、區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測定。[0005]此外，由于一個(gè)PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SYBR Green I的靈敏度很聞。
[0006]由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)引起的柑橘衰退病是柑橘生產(chǎn)中的重要病害之一，對(duì)全世界的柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。CTV是目前已知植物病毒中基因組最大的病毒，其病毒顆粒呈纖維狀彎曲，大小為llnmX2000nm。其基因組為包含12個(gè)開放閱讀框(ORFs)和5’端及3’端非翻譯區(qū)(UTRs)的一條正義單鏈RNA。CTV主要通過帶毒繁殖材料嫁接和蚜蟲傳播，其中褐色橘蚜是最有效的傳播媒介。已有研究表明CTV存在不同的變異株系，導(dǎo)致柑橘不同程度的損失。目前已有報(bào)道的能引發(fā)柑橘表現(xiàn)癥狀的CTV有4種不同基因型(T36、T30、T3、VT):T36基因型CTV分離株主要引起速衰癥狀，T3、VT基因型CTV分離株主要引起莖陷點(diǎn)癥狀。目前已有許多技術(shù)檢測和區(qū)別不同基因型CTV分離株，應(yīng)用TaqMan探針法能夠?qū)Ζ?6、Τ30、VT三種基因型CTV分離株進(jìn)行定量分析，但利用熒光定量RT-PCR特異、高效檢測Τ3基因型CTV分離株的技術(shù)體系尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測柑橘衰退病毒Τ3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，用于柑橘衰退病毒Τ3基因型的特異、靈敏、快速、高效檢測。
[0008]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:一種檢測柑橘衰退病毒Τ3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，包括如下步驟:
[0009]I)提取待測樣品總RNA作為反應(yīng)模板；
[0010]2)以步驟I所提取的RNA為模板，利用Τ3基因型的特異性引物T3-4R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA ；
[0011]3)利用特異性引物T3-4F和T3-4R，以及步驟2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測；
[0012]所述的特異性引物T3-4F和T3-4R序列如下:
[0013]T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT
[0014]T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA
[0015]所述步驟2的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系10 μ L,其中RNA反應(yīng)模板4μ L,5XRT-buffer 2 μ L，濃度為 10mM/L 的 dNTPs 0.5 μ L，濃度為 10 μ mol/L 的引物T3-4R 0.5 μ L，濃度為30U/L的RNA酶抑制劑RNasin 0.5 μ L,濃度為100U/ μ L的反轉(zhuǎn)錄酶RTase 0.5 μ L，無RNase超純水2 μ L，；反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘，94°C加熱I分鐘。
[0016]所述步驟3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系20 μ L，其中2 X SYBR Green Supermix 10 μ L，濃度為 10 μ mol/L 的引物 T3-4F 和 T3-4R 各 0.2 μ L，無RNase超純水8.6 μ L，步驟2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板I μ L ;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性30秒，95 °C變性5秒，63 °C退火15秒，72°C延伸20秒，40個(gè)循環(huán)；
[0017]所述步驟3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測，以柑橘Fbox基因?yàn)閮?nèi)參照基因，采用2_Δ "ct方法對(duì)CTV T3基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。
[0018]有益效果:本發(fā)明建立了檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增效率高、操作簡便、重復(fù)性好等特點(diǎn)。根據(jù)柑橘衰退病毒T3基因型分離株的ORFla基因所設(shè)計(jì)的特異引物在退火溫度為63°C時(shí)，融解曲線僅見單一峰，同時(shí)用于T36、T30、VT型CTV檢測時(shí)無擴(kuò)增峰，說明該引物特異性好。不同濃度cRNA的擴(kuò)增曲線顯示該實(shí)時(shí)熒光定量方法能檢測到最少2 X IO1拷貝/ μ L，而常規(guī)的RT-PCR只能檢測到2 X IO3拷貝/ μ L，表明實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測靈敏度比常規(guī)RT-PCR檢測提高了100倍。該檢測方法體系對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示其擴(kuò)增效率為97.1%，相關(guān)性系數(shù)為
0.992，該反應(yīng)體系擴(kuò)增效率高。該方法組內(nèi)重復(fù)檢測的變異系數(shù)最大為0.57%，組間重復(fù)檢測各梯度的變異系數(shù)最大為2.94%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明特異性引物對(duì)T3-4F/T3-4R在退火溫度63°C的融解曲線圖。
[0020]圖2是柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021]圖3是不同濃度cRNA的擴(kuò)增曲線圖，從左到右的曲線的稀釋倍數(shù)依次是:109、108、17Uo6UO5UO4UO3UO2UO10
[0022]圖4是不同濃度cRNA的普通RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖，M:1OObp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I~9的稀釋倍數(shù)依次是=19Uo8Uo7Uo6Uo5Uo4Uo3Uo2Uo^圖5是柑橘衰退病毒T36、T30、VT、T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測圖。 【具體實(shí)施方式】
[0023]本發(fā)明中的柑橘衰退病T3基因型分離株由美國佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘研究與教育中心William Dawson教授贈(zèng)送。柑橘衰退病T3基因型的全序列公布在NCBI網(wǎng)站上，ID號(hào)為DQ355053.1，ORFla基因序列在此全基因序列中有標(biāo)注。
[0024]dNTP (deoxy-ribonucleoside triphosphate)為脫氧核糖核苷三憐酸(天根公司，中國)，5\町-131^€61 (Τ0Υ0Β0，日本)，RNasin(RNase Inhibitor)為 RNA 酶抑制劑(天根公司，中國)，RTase (Reverse Transcriptase)為反轉(zhuǎn)錄酶(Τ0Υ0Β0,日本)，SYBR GreenSupermix為熒光染料(TAKARA，日本)。
[0025]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0026]實(shí)施例一、提取待測柑橘植株的總RNA，按照如下步驟操作:
[0027]I)取0.08g柑橘葉片，液氮充分研磨后加入預(yù)先放置Iml Trizol溶液(Invitrogen,美國)的1.5ml的離心管中，潤旋混勻Imin,然后室溫放置IOmin,將離心管在12900rpm，4°C下離心 Imin ；
[0028]2)取上清液Iml置于新的1.5ml離心管中，并加入200 μ L氯仿，渦旋混勻，4°C靜置 IOmin ；
[0029]3)將步驟2中的離心管在12900rpm，4°C離心5min，取上清液置于新的1.5ml離心管中，加入等體積的水飽和酚:氯仿:異戊醇(體積比25:24:1)溶液，渦旋混勻，4°C放置IOmin ；
[0030]4)將步驟3中的離心管在12900rpm，4°C離心5min，取上清液置于新的1.5ml離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(體積比24:1)溶液，渦旋混勻，4°C放置IOmin ；
[0031]5)將步驟4中的離心管在12900rpm，4°C離心5min，取上清液置于新的1.5ml離心管加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，_20°C放置lh-2h，然后12000rpm，4°C離心10min，棄上清液，再離心15s用槍頭吸棄上清液；
[0032]6)在步驟5中的離心管中加入用DEPC水(用二乙基焦碳酸酯和ddH20配制的體積百分比為0.1%的溶液)配制的75%的乙醇溶液Iml,顛倒混勻，在8000rpm,4°C下離心3min,棄上清液；再離心15s用槍頭吸棄上清液，重復(fù)2次；
[0033]7)將含有RNA沉淀的步驟6中的離心管置于通風(fēng)櫥中室溫干燥2_3min，加入50 μ L DEPC 水溶解 RNA。
[0034]實(shí)施例二、建立實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測體系，按照如下步驟操作:
[0035]I)以實(shí)施例一所提取的RNA為模板，使用柑橘衰退病毒Τ3基因型的特異性引物T3-4R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系為:總體積10 μ L，其中RNA模板4 μ L，5XRT-buffer2 μ L，無 RNase 超純水 2 μ L，濃度為 lOmM/L 的 dNTPs 0.5 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 T3-4R引物0.5 μ L，濃度為30U/L的RNA酶抑制劑RNasin 0.5 μ L，濃度為100U/μ L的反轉(zhuǎn)錄酶RTase 0.5 μ L0反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C加熱lmin。得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。
[0036]2)以步驟I得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:總體積 20 μ L，其中 2 X SYBR Green Supermix 10 μ L，濃度為 10 μ mol/L 的引物T3-4F和T3-4R各0.2 μ L，無RNase超純水8.6 μ L，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板I μ L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性30s，95°C變性5s，63°C退火15s，72。。延伸20s，40個(gè)循環(huán)。得到PCR擴(kuò)增目的片段產(chǎn)物，儀器自動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析。其中，熔解曲線分析:65°C~95°C，每升高0.5°C檢測I次熒光信號(hào)。得到退火溫度為63°C的融解曲線，如圖1所示，在退火溫度為63 °C時(shí)僅見單一峰。
[0037]采用上述步驟1和2同時(shí)對(duì)柑橘衰退病毒了36、了30、￥1\了3基因型用引物了3_4?和T3-4R進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測。如圖5所示，只有T3基因型出現(xiàn)擴(kuò)增，T36、T30、VT均未出現(xiàn)擴(kuò)增。說明該引物對(duì)的特異性好。
[0038]所述引物T3-4F和T3-4R的堿基序列如下:
[0039]T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT
[0040]T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA
[0041]實(shí)施例三、標(biāo)準(zhǔn)品cRNA的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0042]一、制備標(biāo)準(zhǔn)品cRNA，按照如下步驟操作:
[0043]I)采用實(shí)施例一的方法提取柑橘衰退病T3基因型分離株(由美國佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘研究與教育中心William Dawson教授贈(zèng)送)的總RNA。
[0044]2)以步驟I所提取的RNA為模板，使用柑橘衰退病毒T3基因型的特異性引物T3-4R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系為:總體積10 μ L，其中RNA模板4 μ L，5 X RT-buf fer2 μ L，無 RNase 超純水 2 μ L，濃度為 lOmM/L 的 dNTPs 0.5 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 T3-4R弓丨物0.5 μ L，濃度為30U/ μ L的RNA酶抑制劑RNasin0.5 μ L，濃度為100U/ μ L的反轉(zhuǎn)錄酶RTase 0.5μ L0反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C加熱lmin。得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。
[0045] 3)以步驟2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進(jìn)行普通RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:總體積25 μ L，其中10 X buffer (Mg2+) 2.5 μ L，濃度均為10 μ mol/L的引物T3-4R和插入了啟動(dòng)子T7的修飾引物T3-T7-4F各0.5 μ L，濃度為10mM/L的dNTPs 0.5 μ L，無RNase超純水19.8 μ L，濃度為5U/ μ L的Ex-Taq酶(TAKARA,日本)0.2 μ L，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板I μ L。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性30s，95°C變性5s，63°C退火20s，72°C延伸20s，35個(gè)循環(huán)。得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0046]T3-T7-4F:
[0047]GATCACTAATACGACTCACTATAGGGTCTAAATTCTACCCGAGGCAT(下劃線為 T7 啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子前面6個(gè)堿基為保護(hù)堿基)
[0048]T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA
[0049]4)將步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳切膠回收純化后作為模板，用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Τ0Υ0Β0,日本)根據(jù)說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到cRNA,并用RNase-Free Dnase
1(Promega，美國)對(duì)cRNA進(jìn)行純化，純化后用分光光度計(jì)測定cRNA濃度，_20°C保存?zhèn)溆?。用下列公式?jì)算cRNA的拷貝數(shù):
[0050]拷貝數(shù)(copies/μ L) =6.02 X IO23 (copies/ μ L) X cRNA 濃度(g/ μ L) / 質(zhì)量 MW(g/mol)[0051]其中:質(zhì)量MW=cRNA 喊基數(shù)(bp) X 330dalton/bp
[0052]經(jīng)計(jì)算得到cRNA拷貝數(shù)為2 X IO13拷貝/ μ L。
[0053]二、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下步驟操作:
[0054]I)將標(biāo)準(zhǔn)品cRNA用EASY Dilution (TAKARA,日本)按10倍梯度稀釋為2X IO1~
2X IO9拷貝/ μ L，共9個(gè)梯度作為cRNA模板，每一濃度設(shè)定3個(gè)技術(shù)重復(fù)，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系:總體積20 μ L，其中2X SYBR GreenqPCR Mix (TAKARA,日本)10 μ L、10 μ mol/L 正反向引物 T3-4F 和 T3-4R 各 0.2 μ L，cRNA 模板 IyL和ddH208.6 yL ;熒光定量PCR 擴(kuò)增條件:95°C 預(yù)變性 30s，95°C 5s, 63 °C 15s，72。。20s, 40個(gè)循環(huán)。
[0055]2)步驟I的PCR程序結(jié)束后儀器自動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測。熔解曲線分析:65°C~95°C，每升高0.5°C檢測I次熒光信號(hào)。儀器自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示，柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為模板數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為臨界循環(huán)值Ct，可見擴(kuò)增效率為97.1%，相關(guān)性系數(shù)為0.992，擴(kuò)增效率高。
[0056]濃度為2X IO1~2X IO9拷貝/ μ L的9個(gè)梯度cRNA模板的PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測，得到的擴(kuò)增曲線如圖3所示，cRNA模板濃度從左到右依次是2 X 109-2 X IO1拷貝/ μ L，可見采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，其檢測下限為2 X IO1拷貝/ μ L。
[0057]以“制備標(biāo)準(zhǔn)品cRNA”方法的步驟2中得到的cDNA為模板，設(shè)定2 X IO1~2 X IO9拷貝/ μ L的9個(gè)濃度梯度，進(jìn)行普通的RT-PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系25 μ L，其中cDNA模板
1μ L, ddH20 水 19.8 μ L，10 X buffer (含 Mg2+) 2.5 μ L,濃度為 10mM/L 的 dNTPs 0.5 μ L,濃度為 1(^11101/1的引物了3-4?、了3-41?各0.5 4 1^，濃度為 5U/μ L 的 Ex-Taq 酶(TAKARA，日本)
0.2μ L0 PCR 擴(kuò)增程序:95°C 4min, (95°C 30s, 63°C 20s, 72°C 20s) X 35 循環(huán)，72°C延伸5min。將該9個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖片如圖4所示，可見普通的RT-PCR凝膠電泳檢測只能檢測到2X IO3拷貝/ μ L0而實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR能檢測到
2X IO1拷貝/ μ L，普通的RT-PCR只能檢測到2 X IO3拷貝/ μ L，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測靈敏度比普通的RT-PCR提高了 100倍。
[0058]實(shí)施例四、本發(fā)明的重復(fù)性檢測:對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品cRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR重復(fù)檢測[0059]以實(shí)施例三中的濃度為2 X IO4~2 X IO8拷貝/ μ L的5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品cRNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，反應(yīng)體系以及PCR擴(kuò)增和檢測程序同實(shí)施例三，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)作為組間重復(fù)，且每個(gè)重復(fù)進(jìn)行3次檢測作為組內(nèi)重復(fù)，計(jì)算Ct值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)，結(jié)果如表一所示，擴(kuò)增曲線及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，各梯度組內(nèi)重復(fù)檢測的變異系數(shù)最大為0.57%，表明該方法具有較好的組內(nèi)重復(fù)性。而進(jìn)行的組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各梯度的變異系數(shù)最大為2.94%，表明該方法具有較好的組間重復(fù)性。
[0060]表一不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品cRNA重復(fù)檢測結(jié)果分析表
[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，包括以下步驟: 1)提取待測樣品總RNA作為反應(yīng)模板； 2)以步驟I所提取的RNA為模板，利用Τ3基因型的特異性引物T3-4R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA ； 3)利用特異性引物T3-4F和T3-4R，以及步驟2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測； 所述的特異性引物T3-4F和T3-4R序列如下:
T3-4F:TCTAAATTCTACCCGAGGCAT
T3-4R:TTTTCCGCTTGTGTATAAACGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其特征在于: 所述步驟2的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系10 μ L，其中RNA反應(yīng)模板4 μ L，5XRT-buffer 2 μ L，濃度為 10mM/L 的 dNTPs (λ 5 μ L，濃度為 10 μ mol/L 的引物 T3-4R0.5 μ L，濃度為30U/L的RNA酶抑制劑RNasin 0.5 μ L,濃度為100U/ μ L的反轉(zhuǎn)錄酶RTase0.5 μ L，無RNase超純水2 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄30分鐘，94°C加熱I分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其特征在于: 所述步驟3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系20 μ L，其中2 X SYBRGreen SupermixlO μ L，濃度為 10 μ mol/L 的引物 T3-4F 和 T3-4R 各 0.2 μ L，無 RNase 超純水8.6 μ L，步驟2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA模板I μ L ；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C預(yù)變性30秒，95°C變性5秒，63 °C退火15秒，72 °C延伸20秒，40個(gè)循環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測柑橘衰退病毒T3基因型的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，其特征在于: 所述步驟3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測，以柑橘Fbox基因?yàn)閮?nèi)參照基因，采用2_Λ Δε?方法對(duì)CTV Τ3基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103937909SQ201410142402
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】陶珍珍, 周常勇, 周彥, 宋震, 李中安 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所