專利名稱：斑馬魚p-糖蛋白抑制劑篩選模型的建立方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物篩選(評價)領(lǐng)域，具體涉及一種簡單、經(jīng)濟、高通量的斑馬魚 P-糖蛋白抑制劑篩選模型的建立方法以及利用該動物模型篩選與評價P-糖蛋白抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的常見疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道，目前全世界每年新發(fā)現(xiàn)癌癥患者約1000萬，死于癌癥的人數(shù)600 700萬，而在中國近20年來的癌癥死亡率上升了近30% [1]?；熓侵委煱┌Y的重要手段，但化療中常見且難以解決的問題是腫瘤多藥耐藥性 (Multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，即腫瘤細胞在化療藥物或其他因素的作用下，對多種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似或不同的抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性[2]。MDR形成的最主要的分子機制是腫瘤細胞多藥耐藥基因MDRl高表達，MDRl基因是ABC基因家族的一個亞族，其編碼產(chǎn)物為P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)。Pgp為跨膜糖蛋白，分子量為170 180KD，Pgp能夠與進入細胞漿的抗腫瘤藥物結(jié)合，借助ATP水解釋放出的能量，直接或間接將藥物泵出細胞；或借 Pgp本身的通道作用，將藥物從細胞內(nèi)泵出細胞外，導(dǎo)致腫瘤細胞內(nèi)藥物濃度降低、細胞毒性或靶向治療作用減弱或喪失，進而使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性 ]。因此，使用Pgp抑制劑是逆轉(zhuǎn)MDR的一個重要手段。近年來，評價與篩選Pgp抑制劑已成為抗腫瘤藥物研究的前沿?zé)?br> 點之一。建立Pgp抑制劑篩選模型對于評價與篩選Pgp抑制劑至關(guān)重要。目前Pgp抑制劑篩選模型主要有兩大類，一類是體外細胞模型，另一類是體內(nèi)耐藥動物模型。體外細胞模型研究是利用腫瘤耐藥細胞株來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)、開發(fā)及評價新的抗癌方法等[4_8]。該模型研究方法雖然簡單、所需費用較低，但體外細胞缺少藥物在生物整體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化和體內(nèi)的循環(huán)分布，不能反映藥物在體內(nèi)的真實情況，對Pgp 抑制劑的實際療效預(yù)測性差。體內(nèi)耐藥動物模型的建立主要通過原位移植[9]、皮下移植_ 和腹腔移植[11]三種途徑。通常認為原位移植優(yōu)于皮下移植，主要是由于能夠模擬體內(nèi)的器官微環(huán)境，雖能更好的反映腫瘤的形態(tài)特點和生物學(xué)行為，但由于操作復(fù)雜，創(chuàng)傷性大，每次接種數(shù)量有限，腫瘤深在不利于觀察和治療的部位，應(yīng)用受到一定程度的限制；皮下移植法盡管操作簡單，易于觀察，但腫瘤生長局限，幾乎無轉(zhuǎn)移；腹腔移植法由于位置深，難以觀察，潛伏期長且腫瘤生長慢。因此建立一種既能很好地模擬藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程，又能快速、準確的評價與篩選地Pgp抑制劑的動物模型具有重要意義。斑馬魚是一種新穎的模式生物。與傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優(yōu)勢，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環(huán)節(jié)驗證的欠缺及傳統(tǒng)體內(nèi)篩選模型實驗周期長、操作復(fù)雜、成本高的弊端。斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因的相似度高達85%以上，實驗結(jié)果可比性強。與鼠類等哺乳動物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時觀察分析多個器官，實驗周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費用低[12]。更重要的是，斑馬魚模型具有與生俱來的優(yōu)點①飼養(yǎng)成本低，性成熟周期短；②繁殖能力強，一尾雌魚每次可產(chǎn)200 300枚卵；③生長發(fā)育速度快，在受精后M小時04hpf)， 斑馬魚主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實驗周期；④胚胎及幼魚透明，體外受精，體外發(fā)育，可直接觀察，并可同時分析多個器官系統(tǒng)；⑤胚胎有可以提供營養(yǎng)的卵黃，第一周內(nèi)不需喂食，可避免化合物處理時化合物與食物成份的相互作用；
⑥胚胎體積小，幼魚體長只有l(wèi)_4mm，能夠在一個標準的6、12、24、48或96孔板內(nèi)進行分析；
⑦給藥方式簡單溶于水的小分子物質(zhì)可直接經(jīng)皮膚、鰓及消化系統(tǒng)進入斑馬魚體內(nèi)；不溶于水的物質(zhì)、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)可進行顯微注射。因此斑馬魚可作為很好的疾病模型研究材料。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究證實斑馬魚具有52個ABC轉(zhuǎn)運基因，包括人類所有的48個ABC轉(zhuǎn)運基因[14_15]，斑馬魚ABC基因與人類ABC基因的同源性高達77%，兩者具有一一對應(yīng)的關(guān)系[16]。目前ABC基因(特別是ABCC1/MRP1，即MDRl基因)已被廣泛研究，斑馬魚ABCCl/ MRPl基因位于第3條染色體上，并且含有一個長度為4，557bp的開放閱讀框，該基因編碼的多肽由1，518個氨基酸組成，與人類ABCCl基因的同源性達到70%。斑馬魚在Ihpf時， ABCCl基因呈高度表達；Ihpf至12hpf發(fā)育階段，ABCCl基因廣泛分布于整個胚胎；24hpf至 72hpf發(fā)育階段，主要分布于眼睛和腦部[17]。目前國內(nèi)外還未見有利用整體斑馬魚模型篩選Pgp抑制劑的報道，有少數(shù)研究也只是探討化合物(毒物)對斑馬魚Pgp的毒性機理或針對MDR基因進行遺傳學(xué)分析[17_19]。 國際公開號為WO 2005/080974(01. 09. 2005 Gazette 2005/35)的專利研究發(fā)現(xiàn)，通過對斑馬魚血腦屏障中Pgp機制的抑制作用可篩選中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療藥。與該專利不同的是，本發(fā)明利用整體斑馬魚模型評價與篩選Pgp抑制劑。環(huán)孢菌素A是一種從真菌屬中提取的天然藥物，它能競爭性地與Pgp結(jié)合，阻斷Pgp泵出藥物功能從而逆轉(zhuǎn)MDR[2°]。脂質(zhì)體熒光染料羅丹明B已被證實為一種Pgp特異性底物[21]。本發(fā)明選用羅丹明B為Pgp的底物，環(huán)孢菌素A為建立Pgp模型的陽性對照藥物。由于多藥耐藥性機制的存在，正常斑馬魚將羅丹明B泵出體外，從而存留在體內(nèi)的熒光染料很少，熒光強度很弱；而用環(huán)孢菌素A處理后， Pgp的活性受到抑制，Pgp底物羅丹明B不能被排出，從而存留在斑馬魚體內(nèi)的羅丹明B增多，熒光強度增強。推廣開來，若某種化合物能夠增加羅丹明B在斑馬魚體內(nèi)的存留，則該種化合物可作為潛在的Pgp抑制劑(見

圖1)。經(jīng)廣泛的實驗條件優(yōu)化，本發(fā)明選用4hpf階段的斑馬魚作為實驗材料，藥物處理時間長度為Mh (即斑馬魚發(fā)育至2 !pf時)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，發(fā)明人經(jīng)過研究，旨在提供一種簡單、 經(jīng)濟、高通量的斑馬魚P-糖蛋白抑制劑篩選模型的建立方法以及利用該動物模型篩選與評價P-糖蛋白抑制劑的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種活體斑馬魚P-糖蛋白抑制劑篩選模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚放入微孔板中；
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(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個實驗組，每個實驗組包括1個羅丹明B處理組、1 個Pgp抑制陽性對照組和1個空白對照組，每個實驗組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相應(yīng)的溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)圖像分析和/或微孔板分析。優(yōu)選的，所述的羅丹明B處理組中 加入的溶液為羅丹明B溶液，所述的Pgp抑制陽性對照組中加入的溶液為與羅丹明B處理組等體積的羅丹明B與環(huán)孢菌素A的混合溶液， 混合溶液中羅丹明B的濃度與羅丹明B處理組中相同，環(huán)孢菌素A的濃度為10mM。優(yōu)選的，所述的步驟(1)中斑馬魚為4hpf的斑馬魚。優(yōu)選的，所述步驟(2)化合物處理中斑馬魚培養(yǎng)M小時。優(yōu)選的，所述的步驟( 化合物處理中斑馬魚于下恒溫培養(yǎng)。優(yōu)選的，空白對照組中使用的溶液為斑馬魚養(yǎng)殖用水。優(yōu)選的，所述步驟(3)圖像分析步驟如下處理一段時間后，每組隨機選取若干尾斑馬魚，利用立體熒光顯微鏡側(cè)位拍照并保存，一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚熒光強度可定性評價環(huán)孢菌素A對Pgp的抑制效應(yīng)，另一方面利用圖像處理軟件對圖像進行定量分析，計算斑馬魚熒光強度，環(huán)孢菌素A對Pgp的抑制效應(yīng)計算公式如下
權(quán)利要求
1.一種活體斑馬魚P-糖蛋白抑制劑篩選模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個實驗組，每個實驗組包括1個羅丹明B處理組、1個 Pgp抑制陽性對照組和1個空白對照組，每個實驗組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相應(yīng)的溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)圖像分析和/或微孔板分析。
2.一種評價P-糖蛋白抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個實驗組若干個化合物組合處理組、模型組、Pgp抑制陽性對照組和空白對照組，每個實驗組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相應(yīng)的溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)圖像分析和/或微孔板分析。
3.一種篩選P-糖蛋白抑制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個實驗組若干個化合物組合處理組、模型組、Pgp抑制陽性對照組和空白對照組，每個實驗組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相應(yīng)的溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)圖像分析和/或微孔板分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的羅丹明B處理組中加入的溶液為羅丹明B溶液，所述的Pgp抑制陽性對照組中加入的溶液為與羅丹明B處理組等體積的羅丹明B與環(huán)孢菌素A的混合溶液，混合溶液中羅丹明B的濃度與羅丹明B處理組中相同，環(huán)孢菌素A的濃度為IOmM.
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于所述的步驟(1)中斑馬魚為受精后4小時Ghpf)的斑馬魚，所述步驟( 化合物處理中斑馬魚培養(yǎng)M小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項所述的方法，其特征在于所述化合物組合處理組中加入的溶液為羅丹明B和待測化合物的混合溶液，模型組中加入的溶液為羅丹明B溶液，Pgp抑制陽性對照組中加入的溶液為羅丹明B和環(huán)孢菌素A的混合溶液，其中化合物組合處理組、 模型組、Pgp抑制陽性對照組中羅丹明B的濃度相同。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)圖像分析步驟如下處理一段時間后，每組隨機選取若干尾斑馬魚，利用立體熒光顯微鏡側(cè)位拍照并保存，一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚熒光強度可定性評價環(huán)孢菌素A對Pgp的抑制效應(yīng)，另一方面利用圖像處理軟件對圖像進行定量分析，計算斑馬魚熒光強度，環(huán)孢菌素A對Pgp的抑制效應(yīng)計算公式如下
8.根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項所述的方法，其特征在于所述步驟(3)圖像分析步驟如下處理一段時間后，每組隨機選取若干尾斑馬魚，利用立體熒光顯微鏡側(cè)位拍照并保存， 一方面通過觀察對比各實驗組斑馬魚熒光強度可定性評價定性評價或篩選Pgp抑制劑，另一方面利用圖像處理軟件對圖像進行定量分析，計算斑馬魚熒光強度，待測化合物對PgP 的抑制效應(yīng)計算公式如下
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于所述的步驟( 化合物處理中斑馬魚于下恒溫培養(yǎng)，所述的空白對照組中使用的溶液為斑馬魚養(yǎng)殖用水。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述化合物組合處理組、模型組、Pgp抑制陽性對照組中羅丹明B濃度為50mM，Pgp抑制陽性對照組中環(huán)孢菌素A濃度為10mM，化合物組合處理組一共設(shè)置5個，5個化合物組合處理組中待測化合物濃度分別為0. 1 μ M、 1 μ Μ、10 μ Μ、100 μ Μ、1000 μ Mo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種活體斑馬魚P-糖蛋白抑制劑篩選模型的建立以及評價或篩選P-糖蛋白抑制劑的方法，主要包括斑馬魚選取，化合物處理，圖像分析和/或微孔板分析幾個步驟。本發(fā)明的方法具有經(jīng)濟、簡便、快速、高效、化合物用量少等優(yōu)點。本發(fā)明能顯著提高P-糖蛋白抑制劑評價或篩選的速度，對加快大規(guī)模P-糖蛋白抑制劑的篩選和評價具有重要意義。
文檔編號G01N33/543GK102288750SQ20111023172
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者朱曉宇, 李春啟, 郭勝亞 申請人:杭州環(huán)特生物科技有限公司