專利名稱：篩選抑制tm4sf5功能的抗癌化合物和含有查耳酮化合物的抗癌組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗癌化合物的方法，具體涉及一種篩選已知TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的化合物的方法。而且，本發(fā)明涉及使用該方法篩選的作為抗癌物質(zhì)的查耳酮(苯丙烯酰苯)化合物，和包括查耳酮化合物作為有效成分的抗癌組合物。
背景技術(shù)：
跨膜4L6家族成員5 (TM4SF5或者L6H)是與作為跨膜4L6超家族的一個(gè)成員的腫瘤相關(guān)抗原L6(TM4SF1)同源的蛋白質(zhì)?？缒?L6超家族進(jìn)一步包括IL-TMP和 L6D。L6抗原(TM4SF1)在結(jié)腸、肺部、乳房和卵巢癌中高表達(dá)。與L6抗原(TM4SF1)同源的TM4SF5蛋白質(zhì)(L6H)也在一些類型的癌癥中高表達(dá)，這些癌癥包括胰腺癌、胃癌，結(jié)腸癌和肝癌(MulIer-Pillasch, F.等人，Gene, 208 :25,1998 ；Pascual-Le Tallec, L.等人，J.Clin· Endocrinol. Metab. ,87 :501,2002)。與 L6 抗原(TM4SF1)相比，TM4SF5mRNA 在胃癌組織中以更低水平表達(dá)，但在肝癌和胃癌細(xì)胞系中過表達(dá)(Kaneko，R.等人， Am. J. Gastroenterol.，96(12) :3457,2001)。基于研究結(jié)果，TM4SF5近來已經(jīng)被登記為新的癌基因，如在美國專利US6，350，581 Bl中公開的那樣，其中TM4SF5被命名為人腫瘤相關(guān)抗原(TUAN)。通過在C0S7細(xì)胞中表達(dá) TM4SF5，本發(fā)明的發(fā)明人近來發(fā)現(xiàn)，在Tyr925處的TM4SF5介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重組、粘著斑形成和粘著斑激酶(FAK)磷酸化作用經(jīng)整合蛋白- α 2亞單位被誘導(dǎo)，并通過用含有細(xì)胞生長因子的血清處理而被調(diào)節(jié)(抑制)(Lee, S. Y.等人，Exp. Cell Res.，312 :2983,2006)。但是，TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤生成的分子機(jī)理缺乏理解。TM4SF5在分子水平的功能是未知的，并且用于TM4SF5的致癌作用的證據(jù)在生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)水平上沒有被發(fā)現(xiàn)。另一方面，查耳酮廣泛分布在食用植物中并已知為類黃酮或者異類黃酮 (isoflavonoid)的前體。所述查耳酮的衍生物構(gòu)成植物的黃色顏料，影響植物的顏色并保護(hù)植物不受有害紫外線照射(Methodology of Natural Product Chemistry, W. S. Woo, Seoul National University Press)。查耳酮衍生物在作為紫菀科的一種的金雞菊植物中含量豐富。有代表性的查耳酮包括2' ,6' - 二羥基-4'-甲氧基查耳酮和紅花素，存在于植物中，包括肉桂、紅花和胡椒。二羥基查耳酮主要包含在Rosaceae和Ericaceae科的一些植物物種內(nèi)。根皮苷為在蘋果皮中最初發(fā)現(xiàn)的二羥基查耳酮，并負(fù)責(zé)蘋果樹抗病性。已經(jīng)知道所述查耳酮衍生物具有各種藥物活性，諸如抗原生動(dòng)物活性(Liu，Μ.等人，J.Med. Chem. ,44 :4443,2001)抗炎癥活性(Babu，Μ. Α.等人，Bioorg. Med. Chem. , 10 4035,2003)、免疫調(diào)制(Barfod, L.等人，Int. Immunopharmaco 1.，2 :545，2002)、一氧化氮產(chǎn)生的抑制(Rojas, J.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.，12 1951，2002)、抗癌活性(Kumar,S. K.等人，J. Med. Chem. ,46 :2813,2003)以及 anti-HIV 活性(Artico, M.等人，J.Med. Chem. ,41 :3984,1998)。另外，韓國專利公開號(hào)10-2003-0036993公開了查耳酮化合物具有對(duì)降解基底膜成分的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的抑制活性，(Park,K. H.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.，15 5514,2004)。在這些查耳酮化合物中，磺胺基或磺基取代的查耳酮衍生物已經(jīng)被報(bào)道具有在天然產(chǎn)生的查耳酮中沒有顯示的特定生物學(xué)特性。特別是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，磺胺查耳酮衍生物對(duì)α -葡萄糖苷酶具有強(qiáng)烈的抑制活性(Park，K. H.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.， 15 :5514,2004 ；Korean Patent Publication 10-0751899)。本發(fā)明的發(fā)明人近來還報(bào)道磺基查耳酮衍生物作為選擇性K (+)通道阻斷劑(Park, K. H.等人，Bioorg. Med. Chem. Lett.， 2007)。但是，沒有報(bào)道陳述磺胺或者磺基查耳酮衍生物通過抑制癌基因TM4SF5蛋白質(zhì)的機(jī)制而具有抗癌活性。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了深入全面的研究，從而發(fā)現(xiàn)在人類癌細(xì)胞中顯示的TM4SF5的癌基因潛能是由于其刺激上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)移(EMT)的能力，導(dǎo)致接觸抑制喪失。而且，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，TM4SF5的癌基因功能經(jīng)過新途徑被介導(dǎo)，該途徑包括一系列步驟，包括粘著斑激酶(FAK)磷酸化作用和細(xì)胞液p27kipl聚集，導(dǎo)致MioA活性抑制并改變細(xì)胞形態(tài)?；谶@以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人付出了許多努力來篩選抑制TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的抗癌物質(zhì)，從而完成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供篩選抑制TM4SF5介導(dǎo)的腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的抗癌化合物的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供使用上述方法篩選的抗腫瘤化合物，優(yōu)選為磺胺或者磺基查耳酮化合物，以及包括抗腫瘤化合物作為有效成分的抗癌組合物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了篩選抗癌化合物的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)表達(dá)序列號(hào)2的多肽的癌細(xì)胞，并使用抗癌候選物處理癌細(xì)胞；(b)在用抗癌候選物處理的癌細(xì)胞中檢測(cè)下列中至少一種(i)在編碼粘著斑激酶(FAK)的氨基酸序列的第577位色氨酸(Tyr577)的磷酸化作用，(ii)將FAK結(jié)合到 Rho-GTPase活化蛋白質(zhì)(IihoGAP)或者將FAK結(jié)合到與FAK有關(guān)的GIPase調(diào)節(jié)子(GRAF)， (iii)細(xì)胞液p27Kipl的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，(ivWhoA活性，和(v) Racl活性；和(c)當(dāng)下列事件發(fā)生時(shí)，與當(dāng)沒有用抗癌候選物進(jìn)行處理時(shí)相比較，確定抗癌候選物是否能夠作為抗癌物質(zhì)(i)降低Tyr577上FAK的磷酸化作用，(ii)抑制FAK結(jié)合到 RhoGAP或者FAK結(jié)合到GRAF，(iii)減少細(xì)胞液p27Kipl的表達(dá)和穩(wěn)定性，(iv)增強(qiáng)IihoA活性，或者(ν)降低Racl活性。在本發(fā)明的方法中，步驟(b)進(jìn)一步包括檢測(cè)選擇下組中至少一種包括細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞-細(xì)胞接觸模式或者接觸生長，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SM)或者波形蛋白的表達(dá)，E-鈣粘蛋白的表達(dá)和上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)移 (EMT)；并且步驟(c)進(jìn)一步包括下列事件細(xì)胞形態(tài)從桿狀變化成多邊形，降低了在細(xì)胞
7粘著形成中涉及的蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞-細(xì)胞接觸的保持，細(xì)胞生長的接觸抑制，降低了 α-SMA或者波形蛋白的表達(dá)，增加了 E-鈣粘蛋白的表達(dá)和或者降低了上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)移 (EMT)。另外，步驟(b)進(jìn)一步包括檢測(cè)選自下組的至少一種，包括在細(xì)胞外基質(zhì)或者血清的存在下細(xì)胞轉(zhuǎn)移或者運(yùn)動(dòng)，侵入到包括細(xì)胞外基質(zhì)的膠原凝膠中，侵入到作為細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物的Matrigel中，和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性；并且步驟(c)進(jìn)一步包括下列事件在細(xì)胞外基質(zhì)或者血清的存在下降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移或者運(yùn)動(dòng)，降低侵入到膠原凝膠中，降低侵入到Matrigel中，或者M(jìn)MP活性的降低。本發(fā)明還提供了使用上述方法篩選并由下列化學(xué)式1或2表示的抗癌查耳酮化合物，以及包括查耳酮化合物作為有效成分的抗癌組合物，以及用于治療并預(yù)防癌癥的查耳酮化合物的用途。化學(xué)式1
權(quán)利要求
1. 一種由下列化學(xué)式1或2表示的抗癌查耳酮化合物，其特征在于，化學(xué)式1O戶2Ri-S-N H其中，R2和R3為獨(dú)立的氫或者羥基；R4為(C1-C5)烷基或者具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)取代基的(C6-C10)芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(C1-C5)烷基，O其中，R2和R3為獨(dú)立的氫或者羥基；R4為(C1-C5)烷基或者具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)取代基的(C6-C10)芳基，該組包括氫、鹵素、氮和(C1-C5)烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤查耳酮化合物，其特征在于，查耳酮化合物為選自下組的至少一種，該組包括4' -(ρ-甲苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 4' -(P-甲苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮； 4' -(P-甲苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮； 3' -(ρ-甲苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 2' -(ρ-甲苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 4' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 4' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮； 4' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮； 3' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 3' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮； 3' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮； 2' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 2' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮； 2' -(ρ-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮； 4' -(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 4' - (m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮； 4' - (m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮； 3' -(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮； 3' -(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮； 3' -(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮； 2' -(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；化學(xué)式22'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；4'-(ρ-氟苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(ο-氟苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(ρ-硝基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(ο-硝基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(ρ-氨基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(ο-氨基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'_(苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'_(甲磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(ρ-氟苯基磺酸)-4-羥基查耳酮；4'- (m-氟苯基磺酸)-4-羥基查耳酮；4'- (ρ-硝基苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(ρ-氨基苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'_(苯磺酸)-4-羥基查耳酮；4'_(甲磺酸)-4-羥基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_3，4-二羥基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_2，3-二羥基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_2，4-二羥基查耳酮；4'-(P-甲苯磺酰胺)_2，5-二羥基查耳酮；3'-(P-甲苯磺酰胺)_3，4-二羥基查耳酮；2'-(P-甲苯磺酰胺)_3，4-二羥基查耳酮；4'-(ρ-羥基苯磺酰胺4'-(ρ-羥基苯磺酰胺4'-(ρ-羥基苯磺酰胺4'-(ρ-羥基苯磺酰胺3'-(ρ-羥基苯磺酰胺3'-(ρ-羥基苯磺酰胺3'-(ρ-羥基苯磺酰胺3'-(ρ-羥基苯磺酰胺2'-(ρ-羥基苯磺酰胺2'-(ρ-羥基苯磺酰胺2'-(ρ-羥基苯磺酰胺2'-(ρ-羥基苯磺酰胺4'_(m-羥基苯磺酰胺-3，4-二羥基查耳酮 -2，3-二羥基查耳酮 -2，4-二羥基查耳酮 -2，5-二羥基查耳酮 -3，4-二羥基查耳酮 -2，3-二羥基查耳酮 -2，4-二羥基查耳酮 -2，5-二羥基查耳酮 -3，4-二羥基查耳酮 -2，3-二羥基查耳酮 -2，4-二羥基查耳酮 -2，5-二羥基查耳酮 -3，4-二羥基查耳酮4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；3'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；2'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；4'_(p-氟苯磺酰胺)-3，4-二.羥基查耳酮；4'-(m-氟苯磺酰胺)-3，4-二.羥基查耳酮；4'-(0_氟苯磺酰胺)-3，4-二.羥基查耳酮；4'_(p-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(m-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(o-硝基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'_(p-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(m-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(ο-氨基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(苯磺酰胺)_3，4-雙羥基查耳酮；4'-(甲磺酰胺)_3，4_:二羥基查耳酮；4'_(p-甲苯基苯磺酰胺)-2-氯-4-羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-4-羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3-羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2-羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；4'_(p-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-3,4-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,3-二羥基查耳酮；4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,4-二羥基查耳酮；和4'-(m-羥基苯磺酰胺)-2,5-二羥基查耳酮。
3. 一種抗癌組合物，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的查耳酮化合物作為有效成分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的查耳酮化合物在治療和預(yù)防癌癥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選抗癌化合物的方法和使用該方法篩選的抗癌化合物，具體涉及一種篩選抗癌化合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)表達(dá)癌基因蛋白跨膜4L6家族成員5(TM4SF5)的癌細(xì)胞，其表達(dá)為序列號(hào)2的多肽，使用抗癌候選物處理癌細(xì)胞，并且當(dāng)候選物顯示對(duì)腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的拮抗活性時(shí)基于通過TM4SF5的分子機(jī)理的一些事件確定抗癌候選物。本發(fā)明還涉及使用該方法篩選的具有抗癌活性的查耳酮化合物，以及包括該化合物作為有效成分的抗癌組合物。
文檔編號(hào)C07C311/44GK102199113SQ201110081180
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2007年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月7日
發(fā)明者樸基憲, 李申愛, 李重元, 柳永裴, 柳炯元 申請(qǐng)人:慶尚大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán), 首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財(cái)團(tuán)