專利名稱：一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物代謝研究方法，具體涉及一種用模式生物斑馬魚快速研究藥 物代謝的新方法。
背景技術(shù)：
藥物代謝是研究藥物在機(jī)體作用下發(fā)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化特點(diǎn)和規(guī)律的一門科學(xué)。 結(jié)構(gòu)變化包括氧化、還原、分解、結(jié)合等方式。經(jīng)過代謝，其藥理作用被減弱和消失。藥物代 謝研究對(duì)藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)及其他生物醫(yī)學(xué)學(xué)科發(fā)展有重大影響。藥物代謝研究方法常包括體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法和體外實(shí)驗(yàn)法，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法動(dòng)物給藥后，在 一定時(shí)間內(nèi)將動(dòng)物處死，取消化道各部分內(nèi)容物進(jìn)行分析，并檢查血液、尿、糞便、膽汁，檢 測(cè)代謝物的結(jié)構(gòu)變化，研究藥物的代謝轉(zhuǎn)化，并推斷其在消化道內(nèi)的代謝過程。體內(nèi)代謝試 驗(yàn)?zāi)芸陀^的反應(yīng)藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化，但一般藥物用量較大，不利于少量藥物的快速代謝研 究；有些體內(nèi)成分含量低微，即使采用現(xiàn)代分析手段有時(shí)也難以滿足體內(nèi)復(fù)雜體系的檢測(cè) 需求，而加大藥量或進(jìn)一步富集、純化樣本等手段對(duì)結(jié)果的改善也是有限的；體內(nèi)代謝勞動(dòng) 強(qiáng)度相對(duì)較大，常需多人合作完成。體外實(shí)驗(yàn)法體外肝細(xì)胞代謝和胃腸道菌群代謝。肝細(xì) 胞代謝取肝勻漿、肝細(xì)胞微粒體或細(xì)胞色素P450酶與藥物共孵育，檢查原型成分及其代 謝物的種類和含量，是研究肝臟對(duì)藥物代謝的有效體外方法。胃腸道菌群代謝糞便溫孵法 和離體消化道內(nèi)容物溫孵法是研究藥物在消化道內(nèi)代謝的方法。許多藥物成分是在消化道 菌叢作用下代謝的，特別是腸道內(nèi)細(xì)菌的苷鍵水解酶或人的糞便孵液與藥物在厭氧條件下 溫孵，檢查原型成分及其代謝物的種類和含量，是研究腸內(nèi)菌對(duì)藥物代謝的有效方法。體外 實(shí)驗(yàn)法雖然較有效的模擬了藥物在體內(nèi)代謝的不同環(huán)節(jié)，有益于富增、制備代謝產(chǎn)物，但脫 離了完整的代謝體系對(duì)藥物的作用，難以體現(xiàn)在體代謝的綜合結(jié)果；體外實(shí)驗(yàn)條件要求相 對(duì)較高，一般實(shí)驗(yàn)室難以進(jìn)行。因此，建立一種既能體現(xiàn)在體代謝的綜合效應(yīng)，又能實(shí)現(xiàn)條 件簡(jiǎn)單，低勞動(dòng)強(qiáng)度，化合物用量少的高通量代謝研究方法具有重要意義。斑馬魚是一種極好的模式生物，是取代青蛙、果蠅、小白鼠等作為研究對(duì)象的優(yōu)良 試驗(yàn)?zāi)Ｊ紧~。斑馬魚喂養(yǎng)和維持的費(fèi)用更便宜，所需空間場(chǎng)地不大，易于室內(nèi)大規(guī)模繁殖。 成體魚長(zhǎng)3 4cm，養(yǎng)殖成本僅為養(yǎng)小鼠的0. 1%-1%。斑馬魚同人類基因的相似度與小鼠 相當(dāng)，且在蛋白質(zhì)水平上，其關(guān)鍵部位的同源性幾乎是100%，所以可用斑馬魚模擬人類疾 病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol，4，504-12 (2004)]。目前，人們已成功的用斑馬魚 建立許多人類疾病模型，如神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、聽覺、視覺、癌癥等方面的疾病[S. Sumanas and S. Lin, DDT :TARGETS，3，89-96 (2004).]。如中國(guó)專利 200810019040. 5 公開了一種用 斑馬魚研究藥物毒性的方法，專利200780051025. 2公開了一種通過干細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行的器 官的形成和以及酒精損傷器官的再生方法，200310108710. 8公開了利用斑馬魚基因治療 截癱等疾病。并且斑馬魚具有藥物代謝的P450s相關(guān)酶系目前已克隆到的斑馬魚P450s 基因主要包括CyplA、Cyp2K6、Cyp3a65 和 Cyp3Cl、CyplIal、Cyp 19, Cyp26Al、Cyp26Bl 和 Cyp26Dl幾個(gè)家族的成員，它們與人類相應(yīng)基因的同源性約為40% 73% [P. Collodi,C. L. Miranda, X. Zhao, D. R. Buhler, D. W. Barnes. Xenobiotica, 24 (6)，487-493 (1994) ]。 ■ 馬魚具有完整的代謝器官系統(tǒng)和代謝酶系，以及與哺乳動(dòng)物相似的系統(tǒng)及基因，為研究人 類許多常見疾病的發(fā)病機(jī)制提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，同時(shí)也為藥物的作用機(jī)制、安全性評(píng) 價(jià)及代謝研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。因此可將它作為具有完整代謝體系的理想模式生物 用于藥物的代謝研究。國(guó)內(nèi)在這方面的研究尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作方 便、成本低、化合物用量少、勞動(dòng)強(qiáng)度低，且僅需在一般實(shí)驗(yàn)室就可進(jìn)行的快速模式生物斑 馬魚研究藥物代謝的新方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，它包括以下步驟(1)取斑馬魚的成體魚放入盛有水的容器里，分為空白溶液組，空白魚組、空白藥 物組和藥物魚組，空白溶液組和藥物魚組斑馬魚數(shù)量相等，將受試藥物配成所需濃度，加入 到藥物魚組的水溶液中，空白對(duì)照組加入等量的溶媒，空白魚組只加等量溶媒不放斑馬魚、 空白藥物組加溶媒溶解的等量藥物不放斑馬魚，在藥物魚組的斑馬魚暴露于藥液后Oh 24h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)將魚取出，用純凈水迅速洗滌2 3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重， 于-70°C冰箱放置，并取各時(shí)間點(diǎn)魚藥液，于-70°C冰箱放置，空白溶液組，空白魚組和空白 藥物組于Oh和24h時(shí)同法取樣，備用；(2)取步驟⑴得到的各時(shí)間點(diǎn)魚藥液冷凍干燥，殘?jiān)舆m量溶劑溶解，過 0. 45 μ m或0. 22 μ m濾膜或15000轉(zhuǎn)/min離心，取濾液或上清液進(jìn)行高效液相色譜HPLC分 析或高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用LC-MS分析；取各時(shí)間點(diǎn)斑馬魚魚體剪碎，稱重，勻漿，勻漿 液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻漿液離心后直接用溶劑萃取藥物成分，離心取上清或合并萃 取液，過0. 45 μ m或0. 22 μ m濾膜或約15000轉(zhuǎn)/min離心，濾液或上清液進(jìn)行HPLC分析或 LC-MS分析。作為優(yōu)選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其中步驟 (1)中的空白溶液組，空白魚組、空白藥物組和藥物魚組均平行設(shè)3個(gè)組，保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué) 性。作為優(yōu)選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，步驟(1) 中藥物魚組的斑馬魚暴露于藥液后0h，lh, 2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時(shí)間點(diǎn)將魚取出，取 魚體，并在這些時(shí)間點(diǎn)取魚藥液。采用連續(xù)時(shí)間間隔點(diǎn)取樣可以充分明確藥物的代謝方式 和代謝特點(diǎn)，為指導(dǎo)藥物的臨床用藥和藥物劑型的選擇提供科學(xué)依據(jù)。作為優(yōu)選方案，其中步驟(1)所述的溶媒為水或者是含有0 二甲基亞砜助溶 劑的水溶液。對(duì)于水溶性較差的藥物，采用二甲基亞砜助溶，可以有效提高藥物的水溶性， 使藥物均勻分散于水溶中。作為優(yōu)選方案，以上所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，步驟(2) 根據(jù)被分析藥物的性質(zhì)，根據(jù)相似相溶原則選擇溶劑溶解或萃取受試藥物，如藥液殘?jiān)?甲醇溶解，斑馬魚魚體剪碎，稱重，勻漿，勻漿液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻漿液離心后直接 用溶劑萃取藥物成分，離心取上清或合并萃取液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤軇┤芙狻?br> 本發(fā)明考察了將藥液減壓回收至干及直接冷凍干燥兩種方法，結(jié)果表明將藥液直 接凍干可最大限度的減少樣品處理過程的損失及誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，因此步驟(2)將 各時(shí)間點(diǎn)魚藥液冷凍干燥，然后過濾或離心處理后上高效液相色譜HPLC分析或高效液相 色譜與質(zhì)譜聯(lián)用LC-MS分析。本發(fā)明所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，作為優(yōu)選方案，其中步 驟(2)采用Agilent 1100型系列高效液相色譜儀或采用靈敏度高的Waters Alliance 2695-ZQ 2000高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀來(lái)測(cè)定斑馬魚水溶液中藥物和斑馬魚體內(nèi)組織 中藥物的含量和結(jié)構(gòu)的變化情況，具有靈敏度高，檢測(cè)限低的優(yōu)點(diǎn)。作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，篩選的 受試藥物可為化學(xué)藥品、中藥及其提取物、中藥復(fù)方及其提取物、天然藥物，或它們的組合 物，作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述的受試藥物為丹參酮類化合物、丹參藥材或含有丹參的中 藥復(fù)方、中成藥等。丹參為一種良好的心血管用藥，具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng) 血安神功效，主治月經(jīng)不調(diào)，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕積聚，胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不 眠；肝脾腫大，心絞痛，臨床在心血管用藥上非常廣泛，含有中藥丹參的中藥復(fù)方藥物多達(dá) 上百種，丹參中起藥效的物質(zhì)主要有菲醌類的隱丹參酮、丹參酮IIA或丹參酮I，這些活性 成分是丹參起藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此研究隱丹參酮、丹參酮IIA或丹參酮I的代謝情況可以 有效了解丹參或是含有丹參中藥復(fù)方等藥物的體內(nèi)代謝情況。與小鼠、大鼠、犬等哺乳動(dòng)物不同，斑馬魚的體積較小，口服或注射給藥方式很困 難，因此，步驟(1)中本發(fā)明將受試藥物溶解于斑馬魚所生活的水中，斑馬魚會(huì)自主連續(xù)的 從溶液中吸收受試藥物并在體內(nèi)進(jìn)行代謝，藥物的代謝物也會(huì)隨著斑馬魚的排泄物被連續(xù) 的排到水中，這樣就可通過分析溶液中藥液的成分變化來(lái)掌握藥物的部分代謝信息；斑馬 魚成體魚長(zhǎng)約3 4cm，其體內(nèi)血液量極微量，難以實(shí)現(xiàn)采血，通過取血來(lái)分析血樣的可行 性存在問題，而對(duì)整體魚內(nèi)成分進(jìn)行分析也能掌握藥物在魚體內(nèi)的變化情況，這樣，就能通 過定時(shí)取樣分析藥物在斑馬魚體內(nèi)及體外的變化規(guī)律來(lái)較為全面的探索斑馬魚對(duì)藥物的 代謝情況，此法簡(jiǎn)單可行。有益效果本發(fā)明提供的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法和現(xiàn)有技術(shù)相 比具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，選用斑馬魚作為藥物代 謝研究的對(duì)象，通過優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)分組方法，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是對(duì)藥物給藥方式 的優(yōu)選、藥物經(jīng)斑馬魚代謝后提取方法和分析方法的優(yōu)選，整個(gè)實(shí)驗(yàn)方法可操作性強(qiáng)，能客 觀的反應(yīng)藥物在體內(nèi)的真實(shí)代謝情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，能克服一般體外代謝實(shí)驗(yàn)難以 體現(xiàn)在體代謝綜合結(jié)果的缺點(diǎn)，且能克服一般體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)所用藥量大、勞動(dòng)強(qiáng)度大的缺 點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)方法可重復(fù)性強(qiáng)，尤其是所需受試藥物量少，成本低，勞動(dòng)強(qiáng)度低，應(yīng)用范圍廣 泛，且可成批量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，工作效率高。


圖1隱丹參酮藥液Oh時(shí)隱丹參酮提取離子流2隱丹參酮質(zhì)譜圖
5
圖3隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后中隱丹參酮提取離子流4隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)隱丹參酮提取離子流5隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)隱丹參酮質(zhì)譜6隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后脫氫產(chǎn)物丹參酮IIA提取離子流7隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)脫氫產(chǎn)物丹參酮IIA提取離子 流8隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)脫氫產(chǎn)物丹參酮IIA質(zhì)譜9隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)脫氫產(chǎn)物丹參酮IIA的羥基化 產(chǎn)物質(zhì)譜10隱丹參酮藥液經(jīng)斑馬魚作用18h后隱丹參酮的羥基化產(chǎn)物離子流11丹參酮IIA藥液Oh時(shí)丹參酮IIA提取離子流12丹參酮IIA質(zhì)譜13丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后中丹參酮IIA提取離子流14丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)丹參酮IIA提取離子流15丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后斑馬魚體內(nèi)丹參酮IIA質(zhì)譜16丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后丹參酮IIA羥基化產(chǎn)物離子流17丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后丹參酮IIA羥基化產(chǎn)物質(zhì)譜18丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用18h后斑馬魚體內(nèi)丹參酮IIA羥基化產(chǎn)物質(zhì) 譜19丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后羥基化丹參酮IIA脫氫產(chǎn)物離子流20丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用18h后斑馬魚體內(nèi)羥基化丹參酮IIA脫氫產(chǎn) 物離子流21丹參酮IIA藥液經(jīng)斑馬魚作用18h后斑馬魚體內(nèi)羥基化丹參酮IIA脫氫產(chǎn) 物質(zhì)譜22丹參酮I藥液Oh時(shí)丹參酮IIA提取離子流23丹參酮I質(zhì)譜24丹參酮I藥液經(jīng)斑馬魚作用24h后中丹參酮I提取離子流25丹參酮I藥液經(jīng)斑馬魚作用18h后斑馬魚體內(nèi)丹參酮I提取離子流26丹參酮I藥液經(jīng)斑馬魚作用18h后斑馬魚體內(nèi)丹參酮I質(zhì)譜圖
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例一用模式生物斑馬魚研究丹參中隱丹參酮的代謝1.材料與儀器受試藥物丹參中隱丹參酮化合物配制方法稱取相當(dāng)于隱丹參酮1 2mg溶于IOml 二甲亞砜(DMSO)中，加IOOOml 樂百氏純凈水，搖勻。
動(dòng)物斑馬魚，由南京大學(xué)模式生物研究所提供。試劑乙腈、甲酸為色譜純(德國(guó)，Merck公司)，二甲基亞砜(DMS0，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué) 試劑有限公司)，超純水樂百氏純凈水。儀器Agilent 1100型系列高效液相色譜儀，包括G1311A四元梯度泵、G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B DAD檢測(cè)器；Chemstation 6. 01色譜工作站(美國(guó)， Agilent公司)。Waters Alliance 2695-ZQ 2000液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括雙高壓泵， 自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，電噴霧離子化接口，2695型液相色譜儀，Masslynx 4. 0色譜工作站 (美國(guó)，Waters 公司)。METTLER TOLEDO AB135-S 分析天平(瑞士，METTLERT0LED0 公司)， KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。LABC0NC0冷凍干燥機(jī)(美 國(guó)，LABC0NC0公司)，TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1給藥與取樣方法取斑馬魚，分別置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12組，每組5條魚。其中 1組為1 % DMSO純凈水(空白魚組)，其它為隱丹參酮10Z0 DMSO純凈水溶液(藥物魚組)。 同時(shí)設(shè)空白溶液組(1 % DMSO純凈水)和空白藥物組(1 % DMSO隱丹參酮純凈水溶液)。藥 物魚組分別于斑馬魚暴露藥液后0h，lh，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時(shí)間點(diǎn)將魚取出，用純 凈水迅速洗滌3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，于_70°C冰箱放置。并取各時(shí)間點(diǎn)魚藥液 SmL (各3份)，分別混合，于-70°C冰箱放置?？瞻兹芤航M，空白魚組和空白藥物組于0h，24h 時(shí)同法取樣。2. 2樣品處理藥液處理將不同時(shí)間點(diǎn)魚藥液各8mL，冷凍干燥，殘?jiān)覫mL甲醇溶解，過 0. 22 μ m濾膜，濾液進(jìn)樣20 μ L進(jìn)行HPLC-MS分析。斑馬魚體處理取各時(shí)間點(diǎn)斑馬魚平行組間混合，剪碎，稱取lg，加5mL生理鹽水 勻漿，3500r/min離心lOmin，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，氮?dú)獯蹈?，?渣加ImL甲醇溶解制成Ig魚/mL的溶液，過0. 22 μ m濾膜，濾液進(jìn)樣20 μ L進(jìn)行HPLC-MS 分析。2. 3分析條件液相條件色譜柱ZorbaxExtend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m, Agilent)和 C18 預(yù) 柱(4.6X12. 5mm ID,5ym)；柱溫25°C ；流動(dòng)相A為樂百氏純凈水(與質(zhì)譜聯(lián)用時(shí)改為 0. 05%甲酸水)，B為乙腈，A + B= 100%，采用梯度洗脫0 5min，45% B，5 lOmin， 45 50% B, 10 30min，50 90% B，30 35min，90 100% B ；流速1. OmL/min ；檢測(cè) 波長(zhǎng)270nm ；記錄時(shí)間35min ；進(jìn)樣量為20 μ L。質(zhì)譜條件毛細(xì)管電壓2. 50kV,錐孔電壓30V，干燥氣流速350L/h，離子源溫 度120°C，輔助氣溫度350°C ；離子檢測(cè)方式全掃描檢測(cè)(SCAN)，離子極性正離子 (positive)，離子化方式氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI)，掃描范圍100-800m/z。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用HPLC-MS法檢測(cè)丹參中隱丹參酮經(jīng)斑馬魚作用后的代謝產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)24h內(nèi)斑 馬魚藥液中隱丹參酮或斑馬魚體內(nèi)中的隱丹參酮發(fā)生羥基化、脫氫代謝產(chǎn)物(具體實(shí)驗(yàn)結(jié) 果見表1)。結(jié)果與已有隱丹參酮代謝研究文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致丹參中隱丹參酮在動(dòng)物體內(nèi)的代謝途徑主要為脫氫和羥基化，基中脫氫產(chǎn)物丹參酮IIA是隱丹參酮的主要代謝產(chǎn)物，[Sim JH, Yang M，Han J，Wang BR, Ma XC, Xu M，Liu P，Guo DA. Rapid Commun Mass Spectrom， 21 (14) ,2211-2226 (2007)]，表明采用本發(fā)明提供的用模式生物斑馬魚研究中藥丹參代謝 實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，實(shí)驗(yàn)方法可行。且實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，斑馬魚藥液中隱丹參酮或斑馬魚 體內(nèi)中的隱丹參酮在4h始能檢測(cè)到代謝產(chǎn)物丹參酮IIA，可為臨床劑型和臨床用藥提供科 學(xué)依據(jù)。如將丹參酮類化合物制備成口服或靜脈注射給藥制劑提供參考依據(jù)。表1丹參中隱丹參酮經(jīng)斑馬魚作用后的代謝產(chǎn)物鑒定
保留代謝產(chǎn)物時(shí)間 tR(mi η)分子量 MW[Μ+Η}+[M+Na}+代謝途徑魚外 藥液魚體 內(nèi)鑒定 方式質(zhì)譜圖隱丹參酮22.32296297.31319.30原型成分++對(duì)照如圖1-5
品 對(duì)照丹參酮IIA27.6294295.23317.22隱丹參酮 脫氫++對(duì)照 品 對(duì)照如圖6-8丹參酮IIA 羥基化產(chǎn)物11.203310311.30333.23丹參酮IIA 羥基化+文獻(xiàn) 對(duì)照如圖9隱丹參酮 羥基化產(chǎn)物14.76312313隱丹參酮 羥基化+文獻(xiàn) 對(duì)照如圖10隱丹參酮 羥基化產(chǎn)物26.22312313隱丹參酮 羥基化+文獻(xiàn) 對(duì)照如圖10隱丹參酮 羥基化產(chǎn)物37.08312313隱丹參酮 羥基化+文獻(xiàn) 對(duì)照如圖10實(shí)施例二用模式生物斑馬魚研究丹參中丹參酮IIA的代謝1.材料與儀器受試藥物丹參中丹參酮IIA化合物配制方法稱取相當(dāng)于丹參酮IIA 1 2mg溶于IOml 二甲亞砜(DMSO)中，加 IOOOml樂百氏純凈水，搖勻。動(dòng)物、試劑、儀器同實(shí)施例一。2.實(shí)驗(yàn)方法2. 1給藥與取樣方法取斑馬魚，分別置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12組，每組5條魚。其中 1組為DMSO純凈水(空白魚組)，其它為丹參中丹參酮IIA 1% DMSO純凈水溶液(藥 物魚組)。同時(shí)設(shè)空白溶液組(1 % DMSO純凈水)和空白藥物組(1 % DMSO丹參酮IIA純凈 水溶液)。藥物魚組分別于斑馬魚暴露藥液后0h，lh，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時(shí)間點(diǎn)將 魚取出，用純凈水迅速洗滌3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，于_70°C冰箱放置。并取各時(shí) 間點(diǎn)魚藥液8mL(各3份)，混合，-70°C冰箱放置?？瞻兹芤航M，空白魚組和空白藥物組于0h，24h時(shí)同法取樣。2. 2樣品處理藥液處理將不同時(shí)間點(diǎn)魚藥液各8mL，冷凍干燥，殘?jiān)覫mL甲醇溶解，過 0. 45 μ m濾膜，濾液進(jìn)樣20 μ L進(jìn)行HPLC-MS分析。斑馬魚體處理取各時(shí)間點(diǎn)斑馬魚平行組間混合，剪碎，稱取lg，加5mL生理鹽水 勻漿，3500r/min離心lOmin，上清液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，氮?dú)獯蹈?，?渣加ImL甲醇溶解制成Ig魚/mL的溶液，過0. 45 μ m濾膜，濾液進(jìn)樣20 μ L進(jìn)行HPLC-MS 分析。2. 3分析條件同實(shí)施例一。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用HPLC-MS法檢測(cè)丹參中丹參酮IIA經(jīng)斑馬魚作用后的代謝產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)24h內(nèi) 斑馬魚藥液中丹參酮IIA或斑馬魚體內(nèi)中的丹參酮IIA的羥基化、脫氫代謝產(chǎn)物(具體實(shí) 驗(yàn)結(jié)果見表2)。結(jié)果與已有丹參酮IIA代謝研究文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致丹參酮IIA在動(dòng)物體內(nèi)的 代謝途徑主要為羥基化和脫氫[Sun JH, Yang Μ, Han J, Wang BR, Ma XC, Xu M，Liu P，Guo DA. RapidCommun Mass Spectrom，21(14)，2211—2226(2007) ；Li P,Wang GJ,Li J,Hao HP, and Zheng CN. J. of Mass Spectrom,41(5),670-684(2006) ；Li P,Wang GJ,Li J, Hao HP, Zheng CN. Chromatogr. A, 1104 (1-2)，366-369 (2006)]。進(jìn)一步表明本發(fā)明提供的用模式生 物斑馬魚研究中藥丹參中丹參酮類化合物代謝實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。且實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明， 斑馬魚藥液中丹參酮IIA或斑馬魚體內(nèi)中的丹參酮IIA在12h始能檢測(cè)到羥基化產(chǎn)物代謝 產(chǎn)物，可為臨床劑型和臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。如將丹參酮類化合物制備成口服或靜脈注 射給藥制劑提供參考依據(jù)。表2丹參酮IIA經(jīng)斑馬魚作用后的代謝產(chǎn)物鑒定
權(quán)利要求
一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取斑馬魚的成體魚放入盛有水的容器里，分為空白溶液組，空白魚組、空白藥物組和藥物魚組，空白溶液組和藥物魚組斑馬魚數(shù)量相等，將受試藥物配成所需濃度，加入到藥物魚組的水溶液中，空白對(duì)照組加入等量的溶媒，空白魚組只加等量溶媒不放斑馬魚、空白藥物組加溶媒溶解的等量藥物不放斑馬魚，在藥物魚組的斑馬魚暴露于藥液后0h～24h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)將魚取出，用純凈水迅速洗滌2～3次，處死，去除魚鰭和魚磷，稱重，于 70℃冰箱放置，并取各時(shí)間點(diǎn)魚藥液，于 70℃冰箱放置，空白溶液組，空白魚組和空白藥物組于0h和24h時(shí)同法取樣，備用；(2)取步驟(1)得到的各時(shí)間點(diǎn)魚藥液冷凍干燥，殘?jiān)舆m量溶劑溶解，過0.45μm或0.22μm濾膜或15000轉(zhuǎn)/min離心，取濾液或上清液進(jìn)行高效液相色譜HPLC分析或高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用LC MS分析；取各時(shí)間點(diǎn)斑馬魚魚體剪碎，稱重，勻漿，勻漿液加甲醇或乙腈除蛋白，或勻漿液離心后直接用溶劑萃取藥物成分，離心取上清或合并萃取液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤軇┤芙?，過0.45μm或0.22μm濾膜或約15000轉(zhuǎn)/min離心，濾液或上清液進(jìn)行HPLC分析或LC MS分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特征在于，步驟(1)中藥物魚組的斑馬魚暴露于藥液后0h，lh，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h時(shí)間點(diǎn)將魚取出，并取魚藥液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特征在于，步 驟(1)所述的溶媒為水或者是含有0 二甲基亞砜助溶劑的水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特征在于，步 驟(2)根據(jù)被分析藥物的性質(zhì)選擇溶劑溶解或萃取。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特征在于，步 驟(2)采用Agilent 1100型系列高效液相色譜儀或Waters Alliance 2695-ZQ 2000高效 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特 征在于，所述的受試藥物為化學(xué)藥品、中藥、中藥復(fù)方、天然藥物或它們的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，其特征在于，所 述的受試藥物為丹參酮類化合物、丹參藥材或含有丹參的中藥復(fù)方、中成藥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用模式生物斑馬魚研究藥物代謝的新方法，該方法通過選用斑馬魚作為藥物代謝研究的對(duì)象，通過優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)分組方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，采用優(yōu)選的藥物給藥方式進(jìn)行給藥，并采用優(yōu)選的方法提取經(jīng)斑馬魚代謝后的藥物代謝物，并采用優(yōu)選的分析方法對(duì)代謝物進(jìn)行分析，整個(gè)實(shí)驗(yàn)方法可操作性強(qiáng)，能客觀的反應(yīng)藥物在體內(nèi)的真實(shí)代謝情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度高，能克服一般體外代謝實(shí)驗(yàn)難以體現(xiàn)在體代謝綜合結(jié)果的缺點(diǎn)和一般體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)所用藥量大、勞動(dòng)強(qiáng)度高的缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)方法可重復(fù)性強(qiáng)，所需受試藥物量少，成本低，勞動(dòng)強(qiáng)度低，應(yīng)用范圍廣泛，且可成批量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，工作效率高。
文檔編號(hào)A61P25/20GK101957346SQ201010258459
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月20日
發(fā)明者彭蘊(yùn)茹, 李萍, 賈曉斌, 聞曉東, 陳君, 韋英杰, 齊煉文 申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院;中國(guó)藥科大學(xué)