專利名稱：對(duì)幽門螺桿菌定居具有抑制活性的糖蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠從胃根除與消化性潰瘍的出現(xiàn)相關(guān)的幽門螺桿菌的糖蛋白，還涉及包括該糖蛋白的幽門螺桿菌定居的抑制劑，和包括該抑制劑的藥物和食品。
目前據(jù)認(rèn)為從胃根除幽門螺桿菌是完全治愈消化性潰瘍所必要的。如下所述，通常將抗生素與胃酸分泌抑制劑結(jié)合給藥提議為根除幽門螺桿菌的治療方案。
幽門螺桿菌是在一個(gè)末端具有鞭毛的并且在人的胃粘膜定居的螺桿狀的革蘭氏陰性細(xì)菌。澳大利亞的B.J.Marshall和J.R.Warren在1983年報(bào)道了在來自于胃炎或胃潰瘍的患者的胃的生物活檢樣本中經(jīng)常檢測(cè)到該細(xì)菌。當(dāng)時(shí)，將該細(xì)菌命名為幽門彎曲菌，因?yàn)槠湫螒B(tài)和生長(zhǎng)特性與彎曲菌屬相似。之后，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的外膜的脂肪酸組成和核糖體16S-RNA的序列與彎曲菌屬不同。因此現(xiàn)在將該細(xì)菌稱作為幽門螺桿菌并且屬于新建立的螺桿菌屬。
自那以后，基于流行病的研究公開了許多報(bào)告，表明該細(xì)菌引起胃炎，胃潰瘍和十二指腸潰瘍并且與疾病例如胃癌相關(guān)。一旦幽門螺桿菌定居在胃粘膜上，它存活并且居留于胃，不能被根除，雖然對(duì)其感染的免疫應(yīng)答是強(qiáng)烈的，即抗體效價(jià)是高的。因此，除非通過抗生素的治療從胃完全去除幽門螺桿菌，否則在抗生素停止給藥后約一個(gè)月感染將回到治療前的相同水平。另外，由鹽酸將胃的pH保持在低水平，鹽酸是強(qiáng)酸因此大多數(shù)抗生素趨向于被失活。由于該原因，將抗生素和強(qiáng)烈抑制胃酸分泌的質(zhì)子泵抑制劑結(jié)合用于根除幽門螺桿菌。
但是，長(zhǎng)期抗生素給藥具有增加抗性菌株以及引起副作用的嚴(yán)重問題。
日本專利申請(qǐng)公開號(hào)11-263731公開了奶脂小球膜組分有效地抑制幽門螺桿菌感染。但是，公開的內(nèi)容僅僅講授了抑制幽門螺桿菌的血凝集作用的能力可作為對(duì)幽門螺桿菌感染的抑制作用的證據(jù)。另外該公開內(nèi)容說明奶脂小球膜含有各種各樣的成分，并且沒有說明哪些成分是有效的。同樣，Siiri Hirmo等也指出，胃粘蛋白和奶糖蛋白，尤其是從牛酪乳制備的脂小球膜抑制唾液酸-特異性幽門螺桿菌的血凝集作用(FEMS免疫學(xué)與醫(yī)學(xué)微生物20(1998)，第275-281頁(yè))。但是已經(jīng)報(bào)道了幽門螺桿菌的血凝集素表達(dá)和結(jié)合胃粘膜細(xì)胞的能力之間沒有關(guān)系(M.Clyne&B.Drnmm，感染和免疫，1993年10月，第4051-4057頁(yè))。因此，上面提到的專利公開和文章沒有講授或提示能夠抑制幽門螺桿菌對(duì)胃粘膜的吸附的物質(zhì)。
此外，上面的專利公開和文章沒有闡明用于幽門螺桿菌和胃粘膜之間吸附的粘附素和胃粘膜上的受體，它們是抑制幽門螺桿菌感染的重要的靶。
本發(fā)明的目的之-是提供幽門螺桿菌定居的有效的和安全的抑制劑，所述定居與消化性潰瘍的出現(xiàn)相關(guān)，該抑制劑能夠有效抑制幽門螺桿菌定居，沒有副作用和不增加與抗生素的使用相關(guān)的抗藥性菌株，并且提供適用于治療或預(yù)防消化性潰瘍的藥物和食品。
根據(jù)下面的描述，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)以及特性是顯而易見的。
通常，細(xì)菌建立感染的第一步是細(xì)菌與宿主細(xì)胞的吸附并且通過細(xì)菌的生長(zhǎng)而定居。對(duì)于細(xì)菌與宿主細(xì)胞的吸附，粘附素不得不與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合。由該粘附素和受體決定細(xì)菌的感染位點(diǎn)的特異性。如果當(dāng)細(xì)菌與宿主細(xì)胞吸附時(shí)存在受體分子，那么出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制，沒有建立感染。
據(jù)認(rèn)為幽門螺桿菌的粘附素和人胃粘膜上的受體是抑制幽門螺桿菌感染的靶分子。本發(fā)明人根據(jù)對(duì)幽門螺桿菌吸附的機(jī)理的研究，澄清了尚沒有被闡明的幽門螺桿菌的粘附素是幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶(日本專利申請(qǐng)公開號(hào)10-287585)。
本發(fā)明人已經(jīng)研究了能夠抑制脲酶與胃粘膜的吸附的物質(zhì)并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖蛋白例如來自于牛奶的糖蛋白或來自于雞蛋的蛋清的糖蛋白能夠通過特異性結(jié)合到脲酶上而去除胃中定居的幽門螺桿菌，該脲酶是一種粘附素，定位于幽門螺桿菌細(xì)胞的表面層，并且此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用能夠甚至以小量而特異性地結(jié)合到脲酶上的糖蛋白能夠顯著有效去除幽門螺桿菌，其中通過利用與脲酶特異性結(jié)合而從這些含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化糖蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，通過利用與幽門螺桿菌脲酶的特異性結(jié)合的親和柱技術(shù)從含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化能夠特異性結(jié)合到脲酶上的糖蛋白，并且將分離和純化的糖蛋白用作為幽門螺桿菌定居的抑制劑。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合到幽門螺桿菌的脲酶上的糖蛋白，通過利用與幽門螺桿菌脲酶的特異性吸附的方法進(jìn)行分離和純化獲得了糖蛋白。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了幽門螺桿菌定居的抑制劑，它包含上面提到的作為活性成分的糖蛋白。本發(fā)明也提供了適用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(包括人)的由幽門螺桿菌引起的或與幽門螺桿菌相關(guān)的疾病(例如消化性潰瘍)的藥物組合物，包括上面提到的糖蛋白和藥物學(xué)可接受的載體或稀釋劑。此外，本發(fā)明提供了當(dāng)以有效量攝取時(shí)能夠預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物(包括人)的由幽門螺桿菌引起的或與幽門螺桿菌相關(guān)的疾病(例如消化性潰瘍)的食品，它包含上面提到的糖蛋白。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的利用特異性吸附到幽門螺桿菌脲酶上的方法是利用固定了幽門螺桿菌脲酶的柱的親和層析方法。該柱上固定的脲酶可以是重組脲酶。
附

圖1是顯示脲酶與純化的豬胃粘蛋白粘附方式的圖。
附圖2是顯示脲酶粘附的抑制速率的圖。
附圖3是顯示幽門螺桿菌定居的小鼠中幽門螺桿菌的去除速率的圖。
根據(jù)本發(fā)明，通過利用特異性結(jié)合到幽門螺桿菌脲酶上的方法從含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化能夠特異性結(jié)合到脲酶上的糖蛋白。
用于本發(fā)明的含有糖蛋白的物質(zhì)可以是含有糖蛋白的物質(zhì)例如哺乳動(dòng)物的奶或禽類的蛋的蛋清，卵帶，卵黃膜或蛋黃。優(yōu)選的是，使用牛奶的乳清和雞蛋的蛋清，特別是高分子量的乳清蛋白濃縮物和高分子量蛋清蛋白質(zhì)濃縮物。
糖蛋白是綴合的蛋白質(zhì)，其中由約2-6種類型的單糖組成的糖鏈共價(jià)結(jié)合到的蛋白質(zhì)。糖蛋白在生物體中廣泛分布。包含于糖蛋白的單糖是N-乙酰-D-葡糖胺，N-乙酰-D-半乳糖胺，D-甘露糖，D-半乳糖，L-巖藻糖，唾液酸等等。有分子量和構(gòu)型不同的各種各樣的糖蛋白存在。根據(jù)在糖鏈和蛋白質(zhì)之間鍵的形式，通常有兩種類型的糖蛋白，即N-連接的糖蛋白和O-連接的糖蛋白(粘蛋白型)。糖蛋白的糖鏈的類型，分子量和構(gòu)型以及功能或生理活性依賴于所存在的糖蛋白的位置而變化。
包含于牛奶的糖蛋白包括乳鐵蛋白，分泌性IgA，IgG，IgM，游離的分泌性成分(FSC)，奶粘蛋白等等。包含于雞蛋的蛋清的糖蛋白包括卵類粘蛋白，卵清蛋白，卵運(yùn)鐵蛋白，卵黃高磷蛋白，卵粘蛋白等等。
在制備含有糖蛋白的物質(zhì)時(shí)，可以使用任何已知的方法。通過用常規(guī)方式從奶去除乳脂和酪蛋白以獲得乳清，隨后用合適的方式例如超濾膜處理進(jìn)行乳清的分級(jí)濃縮以獲得高分子量的乳清蛋白質(zhì)濃縮物(含有糖蛋白的物質(zhì))，從牛奶制備含有糖蛋白的物質(zhì)。也可以這樣制備含糖蛋白的物質(zhì)，即，從乳清除去脂蛋白，任選接著濃縮和透析，隨后采用合適的方式例如利用Sepharose柱的凝膠過濾方法等等和用膜處理對(duì)獲得的物質(zhì)進(jìn)行純化。任選地，可進(jìn)行進(jìn)一步的處理例如蛋白酶處理，堿性水解等等以便獲得低分子量的糖蛋白。用于本發(fā)明的牛奶可以是初乳或初乳后面產(chǎn)生的牛奶。
例如采用下面的程序可以從雞蛋的蛋清制備含有糖蛋白的物質(zhì)。將濃稠的蛋清與收集的蛋清分離。通過超離心回收膠狀的部分并且采用例如超聲波處理或勻漿化處理技術(shù)將它溶解。通過凝膠過濾，膜處理或任何其他技術(shù)處理得到的溶解的物質(zhì)以獲得含有糖蛋白的物質(zhì)。如果必要將由此獲得的含有糖蛋白的物質(zhì)進(jìn)一步利用程序例如凝膠過濾進(jìn)行純化。
通常通過勻漿化或超聲波處理將糖蛋白溶解并且然后通過凝膠過濾或乙醇沉淀分離高分子量組分，從消化道粘膜或其凝膠層回收含有糖蛋白的物質(zhì)。通過用鹽酸胍、脲，鹽溶液，或表面活性劑提取，或用還原試劑或蛋白酶處理，進(jìn)行含有糖蛋白的物質(zhì)的溶解。通過與四價(jià)銨鹽形成不溶的復(fù)合物或通過在酸性條件下沉淀，回收一些種類的含有糖蛋白的物質(zhì)。
有利的是，將牛奶或雞蛋的蛋清用作含糖蛋白的物質(zhì)的原料，因?yàn)檫@些物質(zhì)可以廉價(jià)、大量地獲得，而且可以輕易地用簡(jiǎn)單的程序從其制備含糖蛋白的物質(zhì)。同樣，在由奶制備含糖蛋白的物質(zhì)時(shí)，可使用奶乳清。過去，由于沒有利用奶乳清的有效方式而將其丟棄，盡管在制造乳酪等的過程中奶乳清作為副產(chǎn)品而大量產(chǎn)生。因此，可以在工業(yè)上大量地從乳清制備含糖蛋白的物質(zhì)，而且就成本和可行性而言使用得自奶的含糖蛋白的物質(zhì)是非常有利的。
有利的是，牛奶或雞蛋的蛋清中的糖蛋白是高穩(wěn)定性的并且不會(huì)因?yàn)榧訜峄蛟诘蚿H時(shí)而失去其生理學(xué)活性，因此易于從起始材料回收和純化，就配制為食品或藥物，加工和儲(chǔ)存而言都是有利的。
利用與脲酶特異性吸附的方法可用于從含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化特異性結(jié)合到幽門螺桿菌脲酶上的糖蛋白。優(yōu)選的是，使用固定了幽門螺桿菌脲酶的柱的親和層析方法。作為固定于柱上的脲酶，優(yōu)選的是使用重細(xì)脲酶，因?yàn)榭梢垣@得大量的勻質(zhì)的脲酶。
可以常規(guī)方式制備重組脲酶。例如可以提取幽門螺桿菌的基因組DNA，通過PCR方法將編碼脲酶分子的基因擴(kuò)增以獲得擴(kuò)增的DNA，隨后采用已知的方法將其整合到大腸桿菌表達(dá)載體(例如pKK233-2)。將獲得的載體摻入到合適的宿主大腸桿菌(例如大腸桿菌XL1-Blue)而產(chǎn)生重組體。可以將重組體在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而表達(dá)脲酶。可以通過回收表達(dá)的脲酶而獲得重組脲酶。在制備重組脲酶時(shí)，可以使用采用酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。例如在分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第二版)(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，和在DNA克隆2(第二版)(IRL出版社)中描述了制備重組脲酶的程序。
利用固定配體的載體將脲酶固定到一個(gè)柱，該載體能夠結(jié)合包含于脲酶的一個(gè)氨基(-NH3)，羧基(-COOH)，巰基(-SH)，或羥基(-OH)(例如NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow)。通過將包含含有糖蛋白的物質(zhì)的樣品通過該柱，隨后洗去非特異性吸附的蛋白質(zhì)，然后從柱上用合適的洗脫溶液洗脫特異性吸附到脲酶上的糖蛋白，可以進(jìn)行利用脲酶固定的柱的糖蛋白的分離和純化。
根據(jù)上面提到的方法，可以僅僅有效地從各種類型的含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化特異性結(jié)合到脲酶上的糖蛋白。由此獲得的糖蛋白可抑制由幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶與胃粘膜的粘蛋白的粘附，如下面的實(shí)施例證明的。由于脲酶定位于幽門螺桿菌細(xì)胞的表面，由上面提到的方法產(chǎn)生的特異性結(jié)合到脲酶上的糖蛋白(下文中稱為本發(fā)明的糖蛋白)掩蔽了粘附素(即脲酶)，方法是在胃中與脲酶優(yōu)勢(shì)結(jié)合從而抑制幽門螺桿菌與胃粘膜上受體的粘附。在動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)了這一點(diǎn)，觀察到本發(fā)明的糖蛋白對(duì)從胃去除幽門螺桿菌的作用。還有，本發(fā)明的糖蛋白是天然存在的并且是非常安全的。因此，本發(fā)明的糖蛋白可用作為胃中幽門螺桿菌定居的抑制劑并且可用于預(yù)防或治療由幽門螺桿菌引起或與之相關(guān)的疾病例如消化性潰瘍。
因此，本發(fā)明的糖蛋白可用作為幽門螺桿菌定居的抑制劑以配制為藥物或食品。尤其是，過去已經(jīng)吃了來自于奶或雞蛋的蛋清的糖蛋白，所以可將其配制為食品例如具有抗幽門螺桿菌活性的特定的保健食品，特定食用的食品(包括老年人的食品或病人的食品)，或食用補(bǔ)充劑或具有抗幽門螺桿菌活性的健康食品。
當(dāng)將本發(fā)明的糖蛋白加入到作為特定的保健食品，或特定食用的食品時(shí)，可以將糖蛋白加入到食品，通常量為食品重量的大約0.005-0.5％，和優(yōu)選的是0.01-0.1％。加入本發(fā)明的糖蛋白的特定保健食品包括奶，乳制品，肉制品，蛋黃醬，調(diào)味品，飲料，冰淇淋，豆腐(黃豆凝乳)，每日菜，一種魚、貝、藻混合煎煮品(tsukudani)(在醬油中煮沸的保存的食品)，豆醬，面糊，速食面，噴灑于米飯上的粉末狀食品，腌制的蔬菜，粉末狀的湯，水合的湯，糖果，罐裝食品，蒸餾過的囊狀食品，冷凍食品等等。其中被持續(xù)消耗的食品是優(yōu)選的，但是不是必要的。當(dāng)加入到病人用的食品例如低鈉食品，低能量食品或低蛋白質(zhì)食品時(shí)，可以將本發(fā)明的糖蛋白加入到湯，飲料，液體食物等等以制備各種形式的食品。
例如通過將賦形劑例如葡聚糖，粘附劑例如酪蛋白酸鈉并且如果必要營(yíng)養(yǎng)物(例如維生素，礦物質(zhì))，乳化劑，穩(wěn)定劑，調(diào)味劑等等加入到本發(fā)明的糖蛋白中以制備液體食物，從而可以制備食用增補(bǔ)食品。
當(dāng)將本發(fā)明的糖蛋白用作為保健食品時(shí)，包含該糖蛋白作為活性成分，其量為食品重量的大約0.1-3％。可以將該糖蛋白與賦形劑例如乳糖，玉米淀粉，晶體纖維素或PVP，或與粘合劑，任選地與營(yíng)養(yǎng)物例如維生素和礦物質(zhì)一起配制以形成各種形式的食品例如精細(xì)顆粒，片劑，顆粒劑。
本發(fā)明的糖蛋白可單獨(dú)或與常規(guī)添加劑一起用作為藥物組合物以預(yù)防或治療消化性潰瘍等等。采用常規(guī)的方法將糖蛋白單獨(dú)或與添加劑一起形成口服給藥的制劑例如片劑，顆粒劑，粉劑，膠囊或液體制劑?？梢允褂玫奶砑觿┌ㄙx形劑，粘合劑，崩解劑，潤(rùn)滑劑，抗氧化劑，著色材料，矯味劑等等。
可用于藥物組合物的賦形劑包括羧甲基纖維素鈉，瓊脂，輕的無水的硅酸，明膠，晶體纖維素，山梨醇，滑石粉，糊精，淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇，硅酸鋁鎂，磷酸氫鈣等等。
可使用的粘合劑包括阿拉伯膠，海藻酸鈉，乙醇，乙基纖維素，酪蛋白酸鈉，羧甲基纖維素鈉，瓊脂，純水，明膠，淀粉，黃著膠，乳糖，羥基纖維素，羥甲基纖維素，羥丙基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮等。
可使用的崩解劑包括羧甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，羧甲基纖維素鈣，晶體纖維素，淀粉，羥丙基淀粉等等。
可使用的潤(rùn)滑劑包括硬脂酸，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，滑石，氫化油，蔗糖脂肪酸酯，蠟等等。
可使用的抗氧化劑包括生育酚，棓酸酯，二丁基羥基甲苯(BHT)，丁基羥基苯甲醚(BHA)，抗壞血酸等等。
如果需要可以加入其他添加劑或試劑，例如抗酸劑(例如碳酸氫鈉，碳酸鎂，沉淀的碳酸鈣，合成的水滑石)，用于保護(hù)胃粘膜的試劑(例如合成的硅酸鋁，硫糖鋁，和銅葉綠酸鈉)和消化酶(例如生物淀粉酶制劑或脂酶)。用于預(yù)防或治療消化性潰瘍等等的藥物組合物可以通過口服途徑給藥。對(duì)于成年人本發(fā)明的糖蛋白的劑量通常是每天2-30毫克和優(yōu)選的是5-20毫克(干重)。
另外，用于預(yù)防或治療消化性潰瘍等等的上述藥物組合物可以進(jìn)一步包括胃酸分泌抑制劑。將糖蛋白和胃酸分泌抑制劑結(jié)合可更有效從胃去除幽門螺桿菌?？梢允褂玫奈杆岱置谝种苿┑睦影℉2阻滯劑例如法莫替丁，尼唑替丁，羅沙替丁，雷尼替丁或西咪替丁和質(zhì)子泵抑制劑例如奧美拉唑，蘭索拉唑或雷貝拉唑鈉。對(duì)于成人胃酸分泌抑制劑的劑量?jī)?yōu)選的是每天20-30毫克。
給出下面的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。應(yīng)該明白本發(fā)明不僅限于實(shí)施例中列舉的特定詳述。
實(shí)施例1(1)幽門螺桿菌重組脲酶的制備提取幽門螺桿菌菌株TU130的基因組DNA，通過PCR方法擴(kuò)增編碼脲酶分子的DNA。將擴(kuò)增的DNA整合到表達(dá)載體pKK233-2(Amersham Pharmacia Biotec)以獲得可用于表達(dá)脲酶的載體。將載體摻入到大腸桿菌XL 1-Blue獲得能夠表達(dá)脲酶的大腸桿菌。在37℃將重組細(xì)菌在1升含有100微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中以100rpm振蕩培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入0.5mM的濃度的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以便誘導(dǎo)表達(dá)，并且將細(xì)胞進(jìn)一步在上述相同條件下振蕩培養(yǎng)過夜。通過在4000×g離心20分鐘(+4℃)收集大腸桿菌細(xì)胞。
將獲得的細(xì)胞在Tris緩沖液中懸浮以裂解(50mM Tri-HCl(pH 8.0)，100mMNaCl，1mM EDTA)。在加入0.1毫克/毫升溶菌酶之后，將懸浮液在冰上放置30分鐘。然后，將懸浮液在-80℃冰凍1小時(shí)以上，并且在室溫下解凍。通過超聲波處理懸浮液，加入1％濃度的Triton X-100。在30000×g離心30分鐘(+4℃)收集重組脲酶的包含體。
將這些包含體懸浮于緩沖液中以便洗滌包含體(50mM Tri-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，含有0.1％SDS的1mM EDTA，1.0％Triton X-100，0.1％脫氧膽酸鈉)并且以30000×g離心10分鐘(+4℃)。將沉淀的包含體以相同的方式再洗滌兩次， 通過在8M脲溶液(8M脲，50mM Tri-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，1mM DTT)中懸浮這些包含體，然后將懸浮液在室溫下保持1小時(shí)而將其溶解在將獲得的懸浮液在30000×g離心30分鐘之后(+4℃)，將上清液在100倍體積的添加了1mM EDTA(pH6.5)的20mM磷酸鹽緩沖液中透析，從而變性脲酶的構(gòu)型以獲得含有重細(xì)脲酶的物質(zhì)以便純化。
為了純化含有上述重組脲酶的物質(zhì)，用10凝膠床體積的添加了1mMEDTA(pH6.5)的20mM磷酸鹽緩沖液平衡硫酸噻氯酚-m(Cellulofine sulfate-m)(Chisso公司)。將重新調(diào)節(jié)到pH6.5的50毫升該物質(zhì)應(yīng)用到上述用添加了1mMEDTA(pH6.5)的20mM磷酸鹽緩沖液平衡的硫酸噻氯酚-m，并且然后將添加了1mMEDTA的20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)通過該凝膠。將具有含有脲酶的峰值的合并的級(jí)份調(diào)節(jié)到pH5.5并且應(yīng)用到用10凝膠床體積的添加了1mM EDTA(pH5.5)的20mM磷酸鹽緩沖液預(yù)平衡硫酸噻氯酚-m。之后，用20mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)洗滌該凝膠。然后，將含有0.15M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4通過該凝膠提取脲酶。將含有脲酶的合并的級(jí)份在100倍體積的蒸餾水中透析，凍干以形成粉末狀的重組脲酶。通過SDS-PAGE和Western印跡分析證實(shí)獲得的重組脲酶與幽門螺桿菌的天然脲酶相同。(2)含有固定化重組幽門螺桿菌脲酶的柱的制備將2克的NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotec公司)懸浮于約50毫升的1mM HCl中，并且在室溫下吸脹15分鐘。將吸脹的凝膠在玻璃濾紙上吸濾并且用10倍體積的1mM HCl洗滌兩次。然后將凝膠懸浮于50毫升的偶合緩沖液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.8)，在玻璃濾紙上吸濾。將在上述(1)中制備的10毫克的粉末狀純化的重組脲酶溶解于10毫升的偶合緩沖液。將獲得的溶液立即與該凝膠混合，并且將其在4℃在一個(gè)振蕩器中緩慢振蕩反應(yīng)過夜。
在通過吸濾去除反應(yīng)混合物之后，將獲得的凝膠懸浮于封閉緩沖液(0.2M甘氨酸，pH8.3)并且置于4℃緩慢振蕩過夜以封閉剩余的反應(yīng)基團(tuán)。在將凝膠在玻璃濾紙上吸濾之后，用50毫升的偶合緩沖液，50毫升的洗凍緩沖液(0.1M乙酸，0.5M NaCl，pH4.0)，和100毫升的添加了0.5M NaCl(pH4.0)的20mM磷酸鹽緩沖液依次洗滌。將獲得的凝膠懸浮于約5倍體積的含有0.5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液pH5.5，將其直接傾倒至一個(gè)柱上填充。將該柱轉(zhuǎn)移到低溫室內(nèi)并且用3床體積的含有0.1M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液pH5.5平衡，將該柱用作為含有固定化幽門螺桿菌重組脲酶的柱以用于分離本發(fā)明的糖蛋白。(3)從牛奶乳清制備高分子量的乳清蛋白質(zhì)濃縮物在4℃以2000×g將20升的牛奶離心15分鐘以便去除奶脂，回收上清液。然后將1M乙酸滴加到該上清液直到pH為4.6以去除酪蛋白。在將上清液在室溫下保持1小時(shí)之后，通過離心去除酪蛋白獲得牛乳清。然后，通過超濾將調(diào)節(jié)到pH6的乳清分級(jí)分離以將1000000Da濃縮到1/12體積，獲得了高分子量的乳清蛋白質(zhì)濃縮物。
(4)從雞蛋的蛋清制備高分子量的蛋清蛋白質(zhì)濃縮物從白來航母雞下蛋后一個(gè)星期內(nèi)的50個(gè)未受精的雞蛋，僅僅收集蛋清并且篩選以將濃蛋清分離，懸浮于Mensel緩沖液(pH9.5，離子強(qiáng)度＝0.01)并且在10W和9kHz(+2℃)用超聲波處理10分鐘而溶解。用超過濾膜將溶解的產(chǎn)物分級(jí)分離以將300000Da的級(jí)分的分子量濃縮到1/12的體積，獲得了高分子量的蛋清蛋白質(zhì)濃縮物。
(5)利用脲酶固定的柱分離脲酶特異性結(jié)合的糖蛋白將上述程序(3)和(4)制備的高分子量蛋白濃縮物各1升調(diào)節(jié)到pH5.5。在低溫室內(nèi)進(jìn)行下面的程序。用10倍床體積的含有NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(PH5.5)預(yù)平衡上述程序(2)中制備的脲酶固定的柱。將上面提到的各個(gè)樣品通過該柱。然后用10倍床體積的含有0.5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH5.5)洗滌該柱以去除非特異性吸附的蛋白質(zhì)。用含有0.5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)從柱上洗脫特異性結(jié)合到柱上的脲酶的糖蛋白。在100倍蒸餾水透析和隨后的冷凍之后，每次約獲得1克的本發(fā)明的糖蛋白，即特異性結(jié)合幽門螺桿菌脲酶的糖蛋白。
試驗(yàn)1體外試驗(yàn)利用上面描述的程序(3)制備的高分子量乳清蛋白質(zhì)濃縮物，程序(4)制備的高分子量的蛋清蛋白質(zhì)，和實(shí)施例1程序(5)制備的本發(fā)明的糖蛋白在體外試驗(yàn)系統(tǒng)中檢測(cè)對(duì)幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶與胃粘膜粘附的抑制作用。(材料和方法)本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的粘附素是幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶。由于該脲酶很好地結(jié)合到胃粘膜的粘蛋白，如下所述制備的豬胃粘蛋白用于脲酶粘附測(cè)試。
豬胃粘蛋白的制備殺死約2個(gè)月大的健康豬，回收他們的胃，用含有0.15M NaCl，5mM N-乙基馬來酰亞胺(NEM)，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1mM EDTA的0.1mM磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)洗滌胃內(nèi)部。將胃切開，將胃粘膜刮下，并且懸浮于上面提到的緩沖液。將該粘膜懸浮液置于冰上用Polytron勻漿機(jī)打勻，并且以15000×g離心回收上清液。再以25000×g離心該上清液以回收上清液，在蒸餾水中透析并且凍干以獲得粗胃粘蛋白。然后，將該凍干的粗胃粘蛋白溶解于含有0.15M NaCl，6M鹽酸胍和蛋白酶抑制劑(5mM NEM，1mM PMSF，1mM EDTA)的0.mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，并且平鋪在氯化銫密度梯度(1.5克/毫升)并且在34000×g離心48小時(shí)。采用硝基纖維素膜印跡分析并且用高碘酸Schiff’s試劑染色檢測(cè)含有唾液酸的級(jí)分。將被染色的級(jí)分收集并且平鋪在氯化銫密度梯度上，離心。收集染色陽性的級(jí)分并且凍干。然后，將凍干的產(chǎn)物通過用0.1M磷酸鹽緩沖液(0.1M NaCl，pH6.8)預(yù)平衡的Sepharose CL-4B柱進(jìn)行凝膠過濾以進(jìn)行分級(jí)分離。將PAS染色陽性并且具有高濃度蛋白質(zhì)的級(jí)份合并并且在PBS(pH6.8)中透析以獲得純化的豬胃粘蛋白，儲(chǔ)存于-80℃直到使用。由SDS-PAGE證實(shí)獲得的胃粘蛋白是66kDa的糖蛋白。
脲酶與豬胃粘蛋白的粘附測(cè)試如下所述制備用于脲酶粘附測(cè)試的微滴板。
向96孔微滴板的每個(gè)孔中加入50微升份的純化的豬胃粘蛋白(1.27毫克/毫升)，并且通過在4℃保持過夜將其固定。當(dāng)將微滴板用于脲酶粘附測(cè)試時(shí)通過向每個(gè)孔加入3％BSA在37℃反應(yīng)60分鐘進(jìn)行封閉，然后用含有0.15M NaCl和0.05％吐溫20的20mM磷酸鹽緩沖液洗滌該平板三次。
利用上面制備的微滴板進(jìn)行脲酶粘附測(cè)試以便觀察脲酶與固定到微滴板上的豬胃粘蛋白的粘附，如下所述。
將從幽門螺桿菌菌株TU130制備的天然脲酶和由實(shí)施例1的程序(1)制備的重組脲酶生物素化并且用由含有0.15M NaCl和0.05％吐溫20的具有不同pH范圍(將pH預(yù)調(diào)節(jié)到2.0，3.0，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0或6.5)的20mM磷酸鹽緩沖液組成的粘附介質(zhì)稀釋生物素化的脲酶至終濃度為7.0微克/亳升。將由此獲得的各個(gè)脲酶樣品加入到粘蛋白固定的上面提到的微滴板的2個(gè)孔以在37℃敏化60分鐘。然后，為了測(cè)定粘附到孔上的脲酶的量，將鏈霉抗生物素蛋白(streptoavidin)HRP加入到各個(gè)孔在37℃反應(yīng)60分鐘。然后，加入作為底物的鄰苯二胺2HCl和H2O2進(jìn)行反應(yīng)。將3N硫酸用于終止該反應(yīng)。將連續(xù)稀釋2倍的已知量的生物素化脲酶置于運(yùn)行的平板上，將其校正曲線用于測(cè)定樣品中脲酶的量。
對(duì)脲酶粘附的抑制試驗(yàn)利用本發(fā)明的糖蛋白(實(shí)施例1的程序(5))，高分子量的乳清蛋白質(zhì)濃縮物(實(shí)施例1的程序(3))，高分子量的蛋清蛋白質(zhì)濃縮物(實(shí)施例1的程序(4))進(jìn)行脲酶粘附的抑制測(cè)試。首先，將各個(gè)具有不同濃度的樣品與生物素化的豬胃粘蛋白混合，將各個(gè)混合物轉(zhuǎn)移到用脲酶固定的96孔平板的一個(gè)孔，并且在37℃敏化60分鐘。然后，用粘附介質(zhì)(pH4.0)將微滴板上的各個(gè)孔洗滌5次，并且在65℃加熱10分鐘進(jìn)行固定。用粘附介質(zhì)(pH7.0)將固定的孔洗滌1次，將鏈霉抗生物素蛋白HRP加入到各個(gè)孔，由如上所述的ELISA檢測(cè)粘附到脲酶的生物素化的豬胃粘蛋白。(結(jié)果)脲酶粘附到純化的豬胃粘蛋白的方式如圖1所示，天然的脲酶和重組脲酶特異性地粘附到豬胃粘蛋白上，該粘附方式取決于pH。由于認(rèn)為在約pH3.0時(shí)脲酶粘附反應(yīng)反映了在胃粘膜中幽門螺桿菌的定居特性，在該pH范圍內(nèi)能夠抑制脲酶粘附的物質(zhì)可以抑制胃中幽門螺桿菌的定居。由于重組脲酶顯示相同于天然脲酶的粘附特性，當(dāng)利用固定了重組脲酶的柱純化時(shí)本發(fā)明的糖蛋白被認(rèn)為通過屏蔽幽門螺桿菌的脲酶而抑制胃中幽門螺桿菌定居。
本發(fā)明的糖蛋白抑制脲酶的粘附如圖2所示，用高分子量的乳清蛋白質(zhì)濃縮物，高分子量的蛋清蛋白質(zhì)濃縮物，和從各個(gè)蛋白質(zhì)濃縮物純化的本發(fā)明的糖蛋白，依賴于劑量地抑制脲酶粘附到豬胃粘蛋白。本發(fā)明的糖蛋白甚至在低濃度時(shí)顯示約100％的抑制活性，它是顯著高效率的。脲酶定位于幽門螺桿菌細(xì)胞的表面，因此本發(fā)明的脲酶結(jié)合的糖蛋白可以抑制幽門螺桿菌的感染，即可以通過與胃中幽門螺桿菌細(xì)胞的脲酶的結(jié)合和屏蔽該脲酶(粘附素)從胃中去除幽門螺桿菌。
實(shí)施例2體內(nèi)試驗(yàn)該試驗(yàn)在動(dòng)物模型上進(jìn)行以進(jìn)一步證實(shí)試驗(yàn)1的結(jié)果
(方法)試驗(yàn)動(dòng)物是對(duì)幽門螺桿菌感染具有高敏感性的無毛的小鼠(NSHr/ICR，人類和動(dòng)物繁殖研究院，編號(hào)IRA-NHI-9701)(ATCC#72024)(臨床診斷試驗(yàn)免疫學(xué)5578-582，1998)。給各個(gè)小鼠口服1×109CFU的NSP335菌株進(jìn)行攻擊。在育種一個(gè)星期之后，以將不同濃度的本發(fā)明的糖蛋白加入到飼料中給小鼠給藥4個(gè)星期。將本發(fā)明的糖蛋白與H2封閉劑(法莫替丁)或質(zhì)子泵抑制劑(奧美拉唑)一起給另一組給藥。每個(gè)組各10個(gè)小鼠。在樣品給藥完成之后，將各個(gè)組的小鼠殺死。回收小鼠的胃，在去除內(nèi)含物之后，用勻漿機(jī)將完整的粘膜打勻以便形成乳液，將其用于檢測(cè)幽門螺桿菌。幽門螺桿菌的檢測(cè)是如下完成通過將乳液置于培養(yǎng)基(Poremedia幽門螺桿菌分離培養(yǎng)基，Eiken Kagaku)以檢測(cè)幽門螺桿菌，采用氣體容器(gas pack)方法在37℃保溫5天，并且對(duì)菌落計(jì)數(shù)。
(結(jié)果)本發(fā)明的糖蛋白對(duì)幽門螺桿菌定居的小鼠中去除幽門螺桿菌的作用如圖3所示，本發(fā)明的糖蛋白可以以濃度依賴性的方式從胃中去除幽門螺桿菌。在最大劑量時(shí)(20微克/毫升)去除率是100％，在最小劑量(1微克/毫升)時(shí)去除率是70-75％，這是顯著高的去除率，與體外試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。對(duì)照組的100％小鼠(10/10)被幽門螺桿菌感染。根據(jù)該結(jié)果，根據(jù)優(yōu)先與幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶結(jié)合并且屏蔽脲酶(一種粘附素)，可以認(rèn)為本發(fā)明的糖蛋白能夠抑制幽門螺桿菌感染。另外，將糖蛋白與胃酸分泌抑制劑結(jié)合顯示加強(qiáng)的效率。
下文，給出各種制劑的例子。用于該實(shí)施例的糖蛋白是由實(shí)施例1的程序(5)制備的糖蛋白。制劑1(食物)(咀嚼膠姆糖)膠基 25.0碳酸鈣2.0山梨醇54.0甘露醇16.0調(diào)味劑1.0糖蛋白1.0水補(bǔ)充到100.0(％重量)
(冰淇淋)奶油(40％脂肪含量) 33.97奶(3.7％脂肪含量) 33.16脫脂蒸發(fā)的奶16.08糖 11.75玉米糖漿4.67穩(wěn)定劑 0.3糖蛋白 0.02總量100％(重量％)制劑2(特殊食用的食品)(粉末狀湯)用于煮的豆粉67.5小麥粉 3.9小麥胚芽2.5干酵母粉2.5洋蔥粉 4.8肉提取物粉 15.5鹽 0.2香料(白胡椒等等)1.8調(diào)味品(氨基酸等等) 0.2糖蛋白 0.1總量100％(重量％)(干湯)10.0克/200毫升雞蛋4.0肉提取物1.3洋蔥提取物 1.73胡蘿卜膏2.16翅藻屬(kombu)提取物 0.1乳化劑 0.1鹽 0.2
香料(紅胡椒) 0.2調(diào)味品(氨基酸等等) 0.2糖蛋白 0.01總量 10.0克制劑3(保健食品)配方1100克的精細(xì)顆粒中糖蛋白1克乳糖(200M)59克玉米淀粉 35克PVP(K-30) 5克通過常規(guī)的濕成粒方法將這些成分配制為精細(xì)顆粒。配方2100克顆粒中糖蛋白2克乳糖(200M)60克玉米淀粉 33克PVP(K-300)5克通過常規(guī)的擠出成粒方法將這些成分配制為顆粒制劑4食用添加劑食品液體食品(200毫升/包)糖蛋白0.01麥芽糖糊精39.0酪蛋白鈉 13.0植物油12.0維生素1.0礦物質(zhì)1.5乳化劑0.2奶蛋白質(zhì) 10.3磷酸鈉1.8磷酸鉀1.2調(diào)味劑0.5
穩(wěn)定劑(角叉菜膠) 1.5水 加至100.0(重量％)補(bǔ)藥(湯型)糖蛋白0.02胡蘿卜(胡蘿卜膏) 10.0高脂稀奶油12.0乳糖 1.8洋蔥(洋蔥提取物) 1.5奶蛋白粉 0.5奶寡聚糖 1.5清燉湯粉 0.5小麥胚0.5蛋殼鈣0.2乳清鈣0.1鹽0.2乳化劑0.2水 加至100.0(重量％)制劑5(Medicen)配方11.5千克的精細(xì)顆粒中糖蛋白15克乳糖 1100克玉米淀粉 340克PVP(K-30) 45克采用濕式造粒方法將這些成分形成顆粒，隨后通過常規(guī)方法干燥和形成精細(xì)顆粒。
配方2片劑1.糖蛋白 15克2.乳糖 400克
3.玉米淀粉 150克4.晶體纖維素210克5.PVP(K-300)25克6.硬脂酸鎂 10克采用濕式造粒法將上述成分1-5形成顆粒，然后加入硬脂酸鎂形成粉末以制備片劑，然后將這些粉末擠壓形成片劑(200毫克/片劑)。
配方31.5千克的顆粒中糖蛋白 20克乳糖(200M) 950克玉米淀粉480克PVP(K-30) 50克將這些成分完全混合并且采用擠壓造粒法制備顆粒，隨后通過常規(guī)方法干燥和形成顆粒。
配方41.5千克的精細(xì)顆粒中糖蛋白 15克法莫替丁 20克乳糖 1100克玉米淀粉 320克PVP(K-30)45克采用濕式造粒法制備顆粒，隨后通過常規(guī)方法干燥和形成精細(xì)顆粒。
配方5片劑1.糖蛋白 20克2.法莫替丁20克3.乳糖400克4.玉米淀粉135克5.晶體纖維素 200克6.PVP(K-300) 25克7.硬脂酸鎂10克采用濕式造粒法將上述成分1-6形成顆粒，然后加入硬脂酸鎂形成粉末以制備片劑，然后將這些粉末擠壓形成片劑(200毫克/片劑)。
配方61.5千克顆粒中糖蛋白 20克法莫替丁 30克乳糖(200M) 950克玉米淀粉 450克PVP(K-30) 50克采用擠壓造粒法將這些成分制成顆粒，隨后通過常規(guī)方法干燥和形成顆粒。
從以上所述可以看出，根據(jù)本發(fā)明，提供了幽門螺桿菌定居的安全和有效的抑制劑以及含有該抑制劑的食品和藥物。由于從含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化了特異性結(jié)合到脲酶上的作為粘附素的糖蛋白并且用于本發(fā)明，即使當(dāng)使用少量的糖蛋白時(shí)也可以有效地阻止幽門螺桿菌粘附到胃粘膜上。因此，可以有效地抑制由幽門螺桿菌引起的疾病例如消化性潰瘍，而沒有副作用出現(xiàn)。與已經(jīng)用于治療消化性潰瘍的抗生素不同，本發(fā)明的糖蛋白可以從胃特異性地去除幽門螺桿菌而沒有產(chǎn)生抗藥性的細(xì)菌。作為本發(fā)明的糖蛋白的起始材料，可以將廉價(jià)并且可大量獲得的牛奶和雞蛋用于以簡(jiǎn)單方式制備顯示優(yōu)越效果的糖蛋白。
權(quán)利要求
1.特異性地結(jié)合到幽門螺桿菌的脲酶上的糖蛋白，該糖蛋白是通過利用使用與幽門螺桿菌脲酶特異性吸附的方法從含有糖蛋白的物質(zhì)分離和純化而獲得的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖蛋白，其中使用與幽門螺桿菌脲酶特異性吸附的方法是利用固定了脲酶的柱的親和層析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的糖蛋白，其中固定在柱上的幽門螺桿菌脲酶是重細(xì)脲酶
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的糖蛋白，其中含有糖蛋白的物質(zhì)是來源于牛奶乳清的物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的糖蛋白，其中含有糖蛋白的物質(zhì)是來源于牛奶乳清的高分子量乳清蛋白質(zhì)濃縮物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的糖蛋白，其中含有糖蛋白的物質(zhì)是來源于雞蛋蛋清的高分子量蛋清蛋白質(zhì)濃縮物。
7.幽門螺桿菌定居的抑制劑，包括作為活性成分的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的糖蛋白。
8.用于預(yù)防和/或治療包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物由幽門螺桿菌引起的或與其相關(guān)的疾病的藥物組合物，包括權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的糖蛋白。
9.當(dāng)消費(fèi)有效量時(shí)能預(yù)防和/或治療包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物由幽門螺桿菌引起的或與其相關(guān)的疾病的食品，包括權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的糖蛋白。
10.幽門螺桿菌定居的抑制劑組合物，包括權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的糖蛋白和胃酸分泌抑制劑。
11.用于預(yù)防或治療包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物由幽門螺桿菌引起的或與其相關(guān)的疾病的藥物組合物，包括權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的糖蛋白和胃酸分泌抑制劑。
全文摘要
胃中幽門螺桿菌定居的抑制劑包括作為活性成分的特異性結(jié)合到幽門螺桿菌脲酶上的糖蛋白。利用其上固定了幽門螺桿菌脲酶的柱進(jìn)行親和層析從含有糖蛋白的物質(zhì),特別是來源于牛奶乳清或雞蛋的蛋清,分離和純化該糖蛋白。該糖蛋白能夠有效地抑制幽門螺桿菌定居,因此可用于預(yù)防或治療由幽門螺桿菌感染引起的疾病例如消化性潰瘍。也提供了包括該抑制劑的食品和藥物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1331250SQ01123320
公開日2002年1月16日 申請(qǐng)日期2001年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月14日
發(fā)明者兒玉義勝, 木村修武 申請(qǐng)人:株式會(huì)社源, 日清制粉株式會(huì)社