一種獲得斑馬魚突變體的新方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及斑馬魚基因組DNA經(jīng)過改造后，用顯微注射法導入斑馬魚受精卵獲得突變個體的方法，具體地說，涉及一種如何利用斑馬魚自身的基因組DNA改變獲得突變體的方法方法。
【背景技術】
[0002]轉(zhuǎn)基因育種包括外源總DNA片段直接導入和基因工程兩大技術體系。前者是將帶有目的性狀基因的供體總DNA片段導入受體，通過對后代的篩選獲得帶有目的性狀的新品種。后者則是將控制目的性狀的基因分離出來，在體外與轉(zhuǎn)化載體構建成重組分子后再導入受體，通過對轉(zhuǎn)化后代的篩選獲得表達目的基因性狀的新品種。兩個方法各有優(yōu)缺點，在魚類育種均有研究報道，其中不乏成功的案例。
[0003]外源總DNA片段直接導入優(yōu)點是操作程序簡單，適合于多基因性狀和基因背景不明確性狀的轉(zhuǎn)化。但是該方法在國外鮮見報道，可能是由于該方法的理論基礎尚未得到深入的研究證實，再加上很少有確切的結果報道(如用該方法得到一個突變體和相應的導入序列，并證實該序列的導入的確可以產(chǎn)生該突變現(xiàn)象)，所以對該方法的質(zhì)疑比較多。但是由于這個方法簡便易行，國內(nèi)最近幾年此類研究報道仍有很多，其中不乏一些優(yōu)良品系的出現(xiàn)，證明該方法對改良很多數(shù)量性狀還是很有效的，但需要一定的改進才能發(fā)揮其潛力。
[0004]對轉(zhuǎn)基因改良品種爭議很大，反對意見主要集中在三個方面:第一，轉(zhuǎn)基因違反自然，因而是有害的；第二，動植物里引入了外源功能的基因后，它們所提供的食物對人體是否安全；第三，過于勿忙地推廣轉(zhuǎn)基因動植物是否可能影響農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境。這類爭論在短時間內(nèi)不易得出結論。
[0005]中國專利公開號CN101633936A公開了一種魚類轉(zhuǎn)基因育種的方法，將某種魚類本身的基因組DNA經(jīng)過預處理，成為一種有別于原基因組DNA的DNA重排片斷，用轉(zhuǎn)基因的方法將DNA重排片斷導入原種魚類的卵細胞中，和原種魚類的基因組發(fā)生作用，形成變異的基因，并產(chǎn)生外形突變的個體，從中篩選生產(chǎn)性狀優(yōu)良的個體，進行進一步選育；通過設計好的擴增固定引物gmprimer 2對這些突變個體基因組進行擴增，用目標區(qū)域擴增多態(tài)性TRAP方法判斷DNA重排片斷是否進入突變個體的基因組。該方法的不足在于:由于很多導入的DNA重排片斷沒有接頭序列，無法跟蹤導入片斷；且導入很多小片斷，突變效果不好；另外接頭序列太短，擴增導入片斷十分困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種法完全可以不借助外源基因?qū)敫脑彀唏R魚基因組獲得斑馬魚突變體的新方法。
[0007]本發(fā)明采用以下技術方案:
[0008]—種獲得斑馬魚突變體的新方法，包括將斑馬魚本身的基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶完全消化，將酶切片段用DNA連接酶進行連接，獲得一種有別于原基因組DNA的新DNA重排片斷；將所述新DNA重排片段用另一種限制性內(nèi)切酶不完全消化；將不完全消化的新DNA重排片段用DNA連接酶連接人工接頭；PCR擴增；將擴增產(chǎn)物用顯微注射法導人斑馬魚受精卵；篩選斑馬魚突變體。
[0009]進一步地，所述人工接頭如下:
[0010]Gmadaptorl gtcatctcaaaccatctacacggaaccaaacacatgaagccg ；
[0011 ] Gmadaptor2 aattcggcttcatgtgtttggttccgtgtagatggtttgagatga。
[0012]上述人工接頭Gmadaptorl、Gmadaptor2用作跟蹤系列，作為鑒定突變體的分子標記。
[0013]進一步地，所述將斑馬魚本身的基因組DNA完全消化的限制性內(nèi)切酶為Msp I酶；
[0014]進一步地，所述將新DNA重排片段不完全消化的限制性內(nèi)切酶為Ecoli I酶；
[0015]進一步地，所述DNA連接酶為T4DNA連接酶；
[0016]進一步地，所述連接人工接頭的新DNA重排片段大于2kb ;
[0017]進一步地，所述PCR擴增引物如下:
[0018]Gmprimerl tcatctcaaaccatctacacgo
[0019]進一步地，所述PCR擴增程序為:95°C預變性2min，33個循環(huán)，72°C延長5min ;每個循環(huán)包括95°C變性30s，50°C退火45s，72°C延伸2min。
[0020]進一步地，所述PCR擴增反應體系以50ul計包含25ul的2 XMastermix、lul的引物 Gmprimerl，22ul 超純水；
[0021]具體地，上述獲得斑馬魚突變體的新方法，包括以下步驟:
[0022]1)提取斑馬魚基因組DNA ；
[0023]2)將斑馬魚基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MspI完全消化；
[0024]3)將消化好的斑馬魚基因組DNA重新連接，形成新DNA重排片段(即有別于斑馬魚原基因組DNA的新DNA重排片斷)；
[0025]4)將所述新DNA重排片段用限制性內(nèi)切酶Ecoli I不完全消化；
[0026]5)將不完全消化的DNA片段連接上述人工接頭；
[0027]6) PCR 擴增；
[0028]7)將擴增產(chǎn)物用顯微注射法導人斑馬魚受精卵；
[0029]8)篩選斑馬魚突變體。
[0030]上述獲得斑馬魚突變體的新方法，其中:
[0031]步驟1)包括用蛋白酶K消化斑馬魚組織提取斑馬魚基因組DNA ;優(yōu)選采用斑馬魚肌肉組織或血液。
[0032]具體包括:取斑馬魚任何組織，優(yōu)選肌肉組織或血液，加入含蛋白酶K裂解液孵育(裂解液含5ul蛋白酶K(10mg/ml))，55°C 4小時；待裂解完全后，加入500ul的酚:氯仿(1:1)，渦旋震蕩，12，OOOrpm，離心lOmin，轉(zhuǎn)移300微升上清至另一無核酸酶EP管中，加入2.5倍的無水乙醇，混勾后12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，加入lml 75%乙醇，混勾，12，OOOrpm離心lOmin，棄上清，通風櫥瞭干；加入50ul超純水，37°C溶解，得斑馬魚基因組DNA。
[0033]步驟2)包括:將斑馬魚基因組DNA于37°C用Msp I酶酶切4小時，得酶切片段。
[0034]具體包括:取10ug斑馬魚基因組DNA，加入10ul Msp I酶，20ul 10X酶切buffer，加入超純水補足至200ul體積，37°C酶切4小時，得酶切混合物。
[0035]步驟3)包括:將酶切片段用T4DNA連接酶進行連接(4°C過夜)。
[0036]具體包括:將上述酶切混合物放入95°C水浴鍋中l(wèi)Omin滅活Msp I，然后用酚氯仿除去蛋白雜質(zhì)，用無水乙醇沉淀，沉淀以70%乙醇清洗，通風櫥晾干；沉淀經(jīng)超純水重懸，得酶切片段，然后直接用T4DNA連接酶進行連接(4°C過夜)。
[0037]更具體包括:將酶切混合物放入95°C水浴鍋中l(wèi)Omin滅活Msp I，然后加入超純水，同時加入300ul的酸氯仿(1:1)，禍旋震蕩10s，12, OOOrpm離心lOmin，取上清250ul至另一無核酸酶新EP管中，加入25ul的3M NaoAC(醋酸鈉)(ρΗ5.4)和2.5倍體積無水乙醇沉淀，-80°C沉淀2小時，12，OOOg離心lOmin，去除上清，沉淀以70%乙醇清洗兩次，通風櫥晾干。沉淀經(jīng)45ul超純水重懸。酶切片段直接用T4DNA連接酶進行連接(4°C過夜)。
[0038]連接反應體系為60ul (酶切片段45ul、T4DNA連接酶3ul、和5 X T4 DNA連接buffer 12ul)。
[0039]取1 μ 1連接產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測連接后的片段大小，其余59ul連接產(chǎn)物于70°C lOmin滅活T4DNA連接酶。然后，加入241ul超純水，同時加入300ul酚氯仿(1:1)，渦旋震蕩10秒，12，000g，離心lOmino取上清250ul至另一新的EP管中，加入25ul的3M NaoAC(pH5.4)和2.5倍體積無水乙醇沉淀DNA，_80°C沉淀2小時，12，000g離心lOmin，去除上清，沉淀以70%乙醇清洗二次，室溫晾干。然后以55ul超純水溶解沉淀；得連接產(chǎn)物。
[0040]步驟4)包括:將連接產(chǎn)物用EcoRI酶切，酶切不完全消化?；厥沾笥?kb的片段。[0041 ]酶切反應體系為 20ul (含 lul EcoR1、2ul 10 X digets1n buffer，17ul 的連接片段)Ο
[0042]具體包括:將連接產(chǎn)物于70 V lOmin滅活T4DNA連接酶；然后用酚氯仿去除蛋白雜質(zhì)，用無水乙醇沉淀DNA，沉淀以70%乙醇清洗，晾干；然后以超純水溶解沉淀；再用EcoRI酶切，酶切反應時間是40分鐘。
[0043]步驟5)包括:
[0044]取大于2kb的酶切片段；與所述人工接頭Gmadaptorl，Gmadaptor2混勾，直接用T4 DNA連接酶進行反應。連接產(chǎn)物用試劑盒進行回收。
[0045]具體包括:將膠回收的片段和接頭Gmadaptorl，Gmadaptor2 (濃度為100um)混勾(20ul反應體積，引物各2ul，5 X T4DNA連接酶buffer 4 μ 1，12ul切膠回收片段)后，95°C，反應5分鐘，冷卻。直接用T4 DNA連接酶進行連接反應(20ul反應體系，含lulT4 DNA連接酶，4ul 5XT4 DNA連接酶buffer和15ul上述產(chǎn)物)。室溫連接2小時。連接產(chǎn)物用PCRclean up試劑盒進行回收?；厥杖軇?0ul超純水。
[0046]步驟6)包括:利用引物Gmprimerl (5um)進行擴增。反應體系為50ul，包含2 XMastermix 25ul (諾唯贊公司)、引物(Gmprimerl tcatctcaaaccatctacacg) lul，超純水22ul，上述回收的PCR產(chǎn)物2ul。
[0047]擴增程序為:95°C預變性2min，33個循環(huán)(95°C變性30s，50°C退火45s，72°C延伸2min) ;72°C延長5min。擴增產(chǎn)物用試劑盒進行回收，
[0048]步驟7)包括:將擴增產(chǎn)物用超純水稀釋至25ng/ul的工作濃度，用作斑馬魚胚胎的顯微注射。每胚胎的注射量約lnl，注射后的胚胎飼養(yǎng)在28.5°C的孵箱中。
[0049]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術方法的的不足進行了改進，將DNA重排片斷連接接頭序列，用PCR產(chǎn)物直接導入，確定導入片斷肯定有接頭序列；導入都是DNA重排大片斷，突變效果更好；
[0050]本發(fā)明的有益效果在于:不需要借助轉(zhuǎn)入任何外源序列就可以產(chǎn)生斑馬魚新突變體。借助分子標記能輕易知道發(fā)生突變的具體位置。目前，一般采用的魚類轉(zhuǎn)基因育種方法為異源總DNA導入法，但無法跟蹤導入序列，本發(fā)明采用將魚類本身的基因組用一種限制性內(nèi)切酶切斷，重新連接，再換一種限制性內(nèi)切酶酶切，得到的新片斷完全來自該種魚類，可以在該種魚類的基因組中找到同源序列，但由于二次連接后次序被打亂，又不完全是該種魚類原來的序列。研究證明這樣的序列更容易被保留，并對該種魚類的基因組產(chǎn)生影響，產(chǎn)生突變型。經(jīng)過多年的試驗，證明本方法可行。通過對斑馬魚的研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法可以獲得很多表型發(fā)生變化的個體。本發(fā)明提供了一種新的方法和思路，利用斑馬魚本身的基因組DNA，經(jīng)過預處理，形成新的