專利名稱：用模式生物斑馬魚篩選誘導(dǎo)心肌細胞形成的藥物的方法
用模式生物斑馬魚篩選誘導(dǎo)心肌細胞形成的藥物的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種候選藥物的高內(nèi)涵篩選方法，尤其涉及以心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚為模型，篩選促進心肌細胞形成的藥物前體(小分子化合物)的方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病是危害人類健康的最常見疾病，其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)超過惡性腫瘤位居第一位。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不斷取得進步，但對心肌梗死和心力衰竭等缺血性心臟病的治療仍然面臨巨大挑戰(zhàn)，發(fā)展能夠在心肌梗死區(qū)激發(fā)心肌細胞形成和再生以增加心肌細胞數(shù)量的治療方法，在臨床上具有巨大的醫(yī)療前景和經(jīng)濟效益。發(fā)現(xiàn)新的能夠誘導(dǎo)外源或內(nèi)源的成年心臟干細胞分化成心肌細胞的生物試劑和小分子物質(zhì)對于心臟的損傷修復(fù)有治療意義。因此建立一種有效的篩選促進心肌細胞形成的小分子化合物的方法具有重要意義。
斑馬魚是一種非常好的模式生物，斑馬魚全身透明的特性有助于觀察其表型的改變，是國內(nèi)外研究藥物的有效工具。建立帶有綠色或者紅色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，易于觀察不同化合物對其表型的影響。成體斑馬魚長3-4厘米，一次交配能夠獲得100-200枚胚胎，每周產(chǎn)卵一次，其喂養(yǎng)和維持的費用較低，所需空間場地不大，適于室內(nèi)大規(guī)模繁殖。 目前，斑馬魚主要用于遺傳發(fā)育方面，利用其作為研究對象篩選能夠促進心肌細胞形成的小分子化合物的方法還沒有相關(guān)報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種操作方便，成本低，實驗結(jié)果可靠準確，快速篩選誘導(dǎo)心肌細胞形成的小分子化合物的方法。
本發(fā)明提供的篩選誘導(dǎo)心肌細胞形成的小分子化合物的方法，采用模式生物轉(zhuǎn)基因斑馬魚，具體步驟如下1、對從藥物庫中取出的各種不同結(jié)構(gòu)的小分子化合物，用DMSO (二甲亞砜)作為助溶劑，配成ImM的儲存液；在表型篩選時，將每種化合物用胚胎培養(yǎng)液稀釋成1_30μΜ。
2、使心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(CmlC2:EGFP)純合體進行交配，獲得胚胎，培養(yǎng)至50% 外包期(受精后5小時)；然后將胚胎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板(如96孔板)中，每孔置入適量胚胎(如 3枚胚胎)，同時加入不同小分子化合物的胚胎培養(yǎng)液，在20-30°C胚胎培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；其中，DMSO作為空白對照組；在胚胎發(fā)育不同階段(例如培養(yǎng)至M小時，48小時，72小時等不同階段)，對胚胎心臟大小和心臟形態(tài)進行仔細的檢查，并且通過細胞核標記的轉(zhuǎn)基因斑馬 iTg(CmlC2:DSRed-nUC)進行心肌細胞計數(shù)；最后對實驗結(jié)果進行初步判定，分析各個小分子化合物對心肌細胞形成的影響。
3、檢查胚胎的整體形態(tài)(比如背腹體軸和前后體軸等)及其它器官(包括大腦，眼睛，脊索和體節(jié)等)是否受到影響；通過觀察結(jié)果分析判定各個小分子化合物是否對胚胎其它器官有毒性作用。
根據(jù)上述兩個篩選標準，能夠獲得促進心肌細胞形成的藥物分子，而這些藥物分子對胚胎和其它器官則沒有毒性作用或者毒性較??；本發(fā)明提供的用模式生物斑馬魚篩選促進心肌細胞形成的小分子化合物的新方法和現(xiàn)有技術(shù)比較有以下優(yōu)點可操作性強，實驗準確性高，化合物初篩的成功率高，同時活體內(nèi)觀察，化合物組織特異性強，可直接觀察化合物的毒副作用，提高候選藥物篩選的效率。


圖1為體內(nèi)篩選鑒定影響心臟發(fā)育的小分子化合物篩選過程示意圖。
圖2為心肌小分子化合物對心臟形成的影響。其中，A為心肌小分子化合物對心肌細胞的數(shù)量的影響；B心肌小分子化合物對不同發(fā)育時期心肌細胞形成發(fā)育影響的示意圖；C為心肌小分子化合物對不同發(fā)育時期心肌細胞數(shù)量的影響。
具體實施方式
根據(jù)下述實施例，可以更好的理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施所描述的具體的化合物的來源，濃度，斑馬魚的選擇及其結(jié)果僅適用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)力要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
1.選擇合適的化合物庫或合成新的化合物本實例化合物的來源，從美國范德比特大學(xué)(Vanderbilt University)化學(xué)生物所的高通量藥物篩選庫中獲取4000個不同結(jié)構(gòu)的化合物，用DMSO將每種小分子化合物均配制成ImM的儲存液。
2.選擇觀察目的相關(guān)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系本實例目的是觀察促進心肌細胞形成的小分子化合物，因此選擇帶有心肌標記基因的斑馬魚Tg(cmlc2:EGFP)品系(國際斑馬魚資源中心可購買)和Tg(cmlc2:DsRed-nuc)品系 (國際斑馬魚資源中心可購買)。
3.不同化合物濃度的選擇，選擇最佳濃度化合物本實例化合物庫中所選擇的濃度是ΙΟμΜ，因此在化合物處理胚胎前，先將每種化合物用胚胎培養(yǎng)液稀釋100倍成為ΙΟμΜ。
4.魚卵的選擇將用心臟標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(CmlC2:EGFP)純合體進行交配獲得胚胎，培養(yǎng)至50% 外包期(受精后5小時)。
5.化合物的處理過程將50%外包期(受精后5小時)的胚胎轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔中置入3枚胚胎，同時加入不同小分子化合物的胚胎培養(yǎng)液，在觀.5°C胚胎培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，其中DMSO作為空白對照組。具體過程如示意圖1。
6.觀察胚胎分別發(fā)育至M小時，48小時，72小時對胚胎心臟大小，心臟形態(tài)及心臟收縮性進行仔細的檢查，并且通過細胞核標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(CmlC2:DSRed-nuC)進行心肌細胞計數(shù)(圖2)。此外，還仔細檢查了胚胎的整體形態(tài)(比如背腹體軸和前后體軸等)及其它器官，包括大腦，眼睛，脊索和體節(jié)等是否受到影響。最后通過這些觀察結(jié)果來初步判定小分子化合物是否特異性的誘導(dǎo)心肌細胞的形成，以及這些小分子化合物是否對胚胎及其它器官有毒性作用。
以上所述僅是本發(fā)明的一個實例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，例如化合物對其它臟器表型的影響等，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范疇。
權(quán)利要求
1. 一種用模式生物斑馬魚篩選誘導(dǎo)心肌細胞形成的藥物的方法，其特征在于，具體步驟為(1)、對從藥物庫中取出的各種不同結(jié)構(gòu)的小分子化合物，用二甲亞砜作為助溶劑，配成IrnM的儲存液；在表型篩選時，將每種化合物用胚胎培養(yǎng)液稀釋成1-30μΜ ；(2)、使心臟轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(CmlC2:EGFP)純合體進行交配，獲得胚胎，培養(yǎng)至50%外包期；然后將胚胎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板中，每孔置入適量胚胎，同時加入不同小分子化合物的胚胎培養(yǎng)液，在20-30°C胚胎培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；其中，二甲亞砜作為空白對照組；在胚胎發(fā)育的不同階段，對胚胎心臟大小和心臟形態(tài)進行仔細的檢查，并且通過細胞核標記的轉(zhuǎn)基因斑馬iTg(CmlC2:DSRed-nUC)進行心肌細胞計數(shù)；最后對實驗結(jié)果進行初步判定，分析各個小分子化合物對心肌細胞形成的影響；(3)、檢查胚胎的整體形態(tài)，及其它器官包括大腦，眼睛，脊索和體節(jié)等是否受到影響； 通過觀察結(jié)果分析判定各個小分子化合物是否對胚胎其它器官有毒性作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為用模式生物斑馬魚篩選誘導(dǎo)心肌細胞形成的藥物的方法。本發(fā)明首先將25-30對Tg(cmlc2:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚純合體進行交配獲得胚胎，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，每孔中加入適量已發(fā)育至50%外包期的斑馬魚胚胎，用含有1-30μM小分子化合物的胚胎培養(yǎng)液放置于培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；然后對胚胎心臟大小、心臟形態(tài)和心肌細胞數(shù)目進行仔細檢查；此外，還檢查胚胎的整體形態(tài)(比如背腹體軸和前后體軸等)及其它器官形成是否受到影響。最后通過這些實驗結(jié)果來初步判定這些小分子化合物是否促進心肌細胞的形成而不影響其它器官的發(fā)育。通過這種方法所篩選出來的新藥特異性強，毒副作用低。
文檔編號C12Q1/02GK102520130SQ201110403099
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者鐘濤 申請人:復(fù)旦大學(xué)