本發(fā)明屬于水牛胚胎培養(yǎng)及檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種適合代謝組學(xué)水牛胚胎培養(yǎng)及檢測(cè)胚胎發(fā)育潛能的方法。
背景技術(shù)：
：代謝組學(xué)是研究細(xì)胞和生物體的所有代謝中間體和終產(chǎn)物的一門新興科學(xué)，相對(duì)于DNA或蛋白質(zhì)等生物高分子而言，代謝組學(xué)的研究對(duì)象一股為分子質(zhì)量在1000Da以下的小分子。由于代謝網(wǎng)絡(luò)處于基因調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的下游，因此代謝組學(xué)研究反映了基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組受內(nèi)外環(huán)境影響下相互協(xié)調(diào)作用的最終結(jié)果，代謝組學(xué)的研究更接近于細(xì)胞或生物的表型。代謝組的功能和代謝組學(xué)的重要性使代謝組學(xué)成為生物學(xué)中繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后的又一個(gè)重要的組學(xué)平臺(tái)，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、微生物學(xué)、環(huán)境學(xué)和食品科學(xué)等生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域。代謝組學(xué)具有如下特點(diǎn)：首先，與細(xì)胞或機(jī)體的基因和蛋白質(zhì)相比，代謝物數(shù)量顯著少，人類基因組大約包含2.5萬個(gè)基因，編碼10萬～20萬個(gè)轉(zhuǎn)錄子，翻譯100萬種蛋白質(zhì)，卻僅產(chǎn)生2500～3000種代謝物，故代謝組檢測(cè)要比轉(zhuǎn)錄組或蛋白組檢測(cè)簡(jiǎn)單廉價(jià)。其次，轉(zhuǎn)錄組及蛋白組的改變并不總是與細(xì)胞表型相關(guān)，而代謝物組是基因表達(dá)的終產(chǎn)物，反應(yīng)了細(xì)胞的真實(shí)功能狀態(tài)，可較前者更準(zhǔn)確地評(píng)估基因功能。最后，基因過度表達(dá)等微小變化經(jīng)轉(zhuǎn)錄組和蛋白組逐級(jí)放大后，在代謝物水平上更易被檢測(cè)。胚胎質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到胚胎移植后妊娠效率。目前對(duì)胚胎質(zhì)量的評(píng)估中，應(yīng)用最為廣泛的是對(duì)胚胎發(fā)育時(shí)期各階段的形態(tài)特征進(jìn)行評(píng)分。近年來在形態(tài)學(xué)結(jié)合實(shí)時(shí)成像分析系統(tǒng)對(duì)胚胎發(fā)育過程進(jìn)行連續(xù)觀察并對(duì)其進(jìn)行選擇，但卻無具體的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)來判定，且容易受觀察者主觀影響。而通過檢測(cè)胚胎培養(yǎng)基中代謝物的代謝組學(xué)方法可更有效地分析胚胎活性，有效地反映細(xì)胞發(fā)育情況，預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育的最終結(jié)果，對(duì)提高胚胎附植率將有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種適合代謝組學(xué)水牛胚胎培養(yǎng)及檢測(cè)胚胎發(fā)育潛能的方法，該法可為胚胎生產(chǎn)中的胚胎移植前胚胎質(zhì)量提供判斷依據(jù)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：適合代謝組學(xué)的水牛胚胎培養(yǎng)方法，第一步，取未成熟的水牛卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟、體外受精后獲得假定受精胚胎進(jìn)行群體培養(yǎng)；第二步，待胚胎發(fā)育到囊胚階段，進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)。上述適合代謝組學(xué)的水牛胚胎培養(yǎng)方法，按以下操作進(jìn)行：取未成熟的水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟，將體外成熟的卵子經(jīng)體外受精后，把假定受精胚胎放到共培養(yǎng)液體系中，微滴群體培養(yǎng)；待胚胎發(fā)育到囊胚階段，用撿卵針撿出囊胚，用PBS溶液洗滌1-2次，放入事先在培養(yǎng)箱中平衡2h以上的20μl蓋油的SOF液(SOF液成分參照Carolantetal.，1995，Theriogenology43：1115-l128)培養(yǎng)，每個(gè)胚胎一滴，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后，收集代謝液到200μl的EP管中-80℃凍存。檢測(cè)水牛胚胎發(fā)育潛能的方法，按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，單胚胎培養(yǎng)后收集代謝液；通過LC/MS檢測(cè)囊胚代謝液成分，通過PCA數(shù)據(jù)分析鑒定胚胎發(fā)育能力。代謝液按以下操作進(jìn)行預(yù)處理：首先把樣品從-80℃冰箱中，放入冰面上解凍，然后用超純水預(yù)洗滌一次膜的MerckMillipore離心過濾管，4度12000g.min-1離心15min。LC/MS檢測(cè)條件及參數(shù)按以下設(shè)置：選擇前用乙晴沖洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min；選擇方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，0-2min5％乙腈，2-20min5％乙腈-95％乙腈，20min-23min100％乙晴，23min-23.1min5％乙晴，23.1min-25min5％乙晴，流速為0.30mL/min；進(jìn)樣量：2μL；一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：HESTSOURCE參數(shù)：針對(duì)目前水牛胚胎質(zhì)量檢測(cè)存在的問題，發(fā)明人建立了一種適合代謝組學(xué)的水牛胚胎二步培養(yǎng)法，該法經(jīng)體外成熟、體外受精后獲得假定受精胚胎進(jìn)行群體培養(yǎng)，待胚胎發(fā)育到囊胚階段，進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)。以此為基礎(chǔ)，發(fā)明人還建立了一種檢測(cè)水牛胚胎發(fā)育潛能的方法，即按上述培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，單胚胎培養(yǎng)后收集代謝液；通過LC/MS檢測(cè)囊胚代謝液成分，通過PCA數(shù)據(jù)分析鑒定胚胎發(fā)育能力。試驗(yàn)表明，本發(fā)明根據(jù)PCA數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，以孵化能力作為判定，可以對(duì)胚胎發(fā)育潛能進(jìn)行預(yù)測(cè)，直接應(yīng)用與胚胎體外生產(chǎn)中胚胎移植前，對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行有數(shù)據(jù)依據(jù)的檢測(cè)，避免了肉眼預(yù)測(cè)選擇胚胎的缺陷，彌補(bǔ)了人為判斷的不足，將大大節(jié)約生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)成本。附圖說明圖1是應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)水牛胚胎發(fā)育潛能的負(fù)極質(zhì)譜圖。圖中：對(duì)照組為1藍(lán)色點(diǎn)，胚胎代謝液檢測(cè)組為2紅色點(diǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1兩步法收集水牛囊胚代謝液第一步，經(jīng)屠宰場(chǎng)獲得的卵巢，抽取未成熟的水牛卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟，將體外成熟的卵子經(jīng)體外受精后，把假定受精胚胎放到共培養(yǎng)液體系中，微滴群體培養(yǎng)，20μl的培養(yǎng)體系中放入15-20個(gè)胚胎，蓋油；第二步，將體外受精第7d發(fā)育到桑葚胚胎階段的胚胎，用撿卵針撿出發(fā)育到桑葚胚或囊胚的胚胎，用PBS溶液洗滌1-2次(以消除原有代謝液成分的影響)，放入事先在培養(yǎng)箱中平衡2h以上的20μl蓋油的SOF液(無血清)培養(yǎng)，每個(gè)胚胎一滴，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5-6h后，從培養(yǎng)箱拿出，用1ml移液器吸出所蓋礦物油，待在40倍的體式顯微鏡下觀察到液滴的頂端無油覆蓋時(shí)終止吸礦物油。用內(nèi)徑為0.5-0.8mm的撿卵針把代謝液放入到500μl的滅菌EP管中，再把胚胎移入到含有血清的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)胚胎的孵化潛能。每個(gè)胚胎對(duì)應(yīng)一管代謝液，每個(gè)胚胎為17μl左右代謝液放入-80℃的冰箱中待檢測(cè)，在代謝液進(jìn)行處理分析前，保持代謝液的凍存狀態(tài)。結(jié)果顯示，采用兩步法，在囊胚期進(jìn)行單滴培養(yǎng)，從囊胚率上兩步法培養(yǎng)的囊胚孵化率為4.85％，對(duì)照---群體培養(yǎng)組(從受精后，假定胚胎直到發(fā)育到囊胚一直采用群體培養(yǎng))的對(duì)照組為3.85％，差異不顯著。說明在胚胎發(fā)育到囊胚階段進(jìn)行單滴培養(yǎng)收集代謝液，沒有影響到囊胚的孵化情況，見表1。表1兩步水牛單胚胎培養(yǎng)方法不同組別比較組別總胚胎數(shù)孵化數(shù)(％)兩步法培養(yǎng)37118(4.85)對(duì)照組1044(3.85)實(shí)施例2應(yīng)用LC/MS進(jìn)行水牛單囊胚代謝液的檢測(cè)(1)采用兩步法收集囊胚階段的代謝液參照實(shí)施例1。(2)LC/MS檢測(cè)代謝液的成分樣品的預(yù)處理：由于培養(yǎng)液中帶有0.3％的BSA，因此，在LC/MS檢測(cè)前，要進(jìn)行去除蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)，首先把樣品從-80℃冰箱中，放入冰面上解凍，然后用超純水預(yù)洗滌一次膜的MerckMillipore離心過濾管，4度12000g.min-1離心15min，去除代謝液中BSA(牛血清白蛋白)的影響。LC/MS檢測(cè)參數(shù)選擇前用乙晴沖洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min。選擇方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，0-2min5％乙腈，2-20min5％乙腈-95％乙腈，20min-23min100％乙晴，23min-23.1min5％乙晴，23.1min-25min5％乙晴，流速為0.30mL/min；進(jìn)樣量：2μL；一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：二級(jí)質(zhì)譜(dd-MS2/dd-SIM)參數(shù)：HESTSOURCE參數(shù)：(3)PCA分析得到的負(fù)極質(zhì)譜圖，導(dǎo)入到熱電公司的Sevier軟件中，進(jìn)行主成分分析(PCA分析)。從圖1中可以看到，通過上述實(shí)施方式，對(duì)照組的代謝液(不放囊胚，但同樣的處理?xiàng)l件)與囊胚代謝液組(放囊胚的代謝液，處理?xiàng)l件與對(duì)照組相同)，經(jīng)過LC/MS處理，在負(fù)極模式下，經(jīng)過PCA分析，完全可以將對(duì)照組與囊胚代謝液組分開。當(dāng)前第1頁1 2 3