專利名稱：斑馬魚(yú)多發(fā)性硬化癥模型的建立方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物篩選(評(píng)價(jià))領(lǐng)域，具體涉及一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高通量的斑馬魚(yú)多發(fā)性硬化癥模型的建立方法，并利用該動(dòng)物模型篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物或評(píng)價(jià)化合物誘導(dǎo)的神經(jīng)髓鞘損傷的方法。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫病，可能是遺傳易感個(gè)體與環(huán)境因素作用而發(fā)生的神經(jīng)免疫過(guò)程，由于其發(fā)病率較高，成慢性病程和傾向于年輕人罹患，而成為最重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一 [1]。流行病學(xué)顯示該病在北美洲約有40萬(wàn)例患者，我國(guó)約有6. 5萬(wàn)例患者，全球的患者超過(guò)100萬(wàn)例，女性患者多于男性，多發(fā)于20-40歲年齡段的人群[2]。MS新藥研發(fā)是國(guó)際主要制藥公司新藥研發(fā)的重點(diǎn)項(xiàng)目之一。盡管目前臨床已經(jīng)有多種MS治療藥物，包括激素類、免疫調(diào)節(jié)類、免疫抑制類、他汀類藥物等，但是這些藥物對(duì)MS的療效有限，且毒副作用大，費(fèi)用高， 因此迫切需要研發(fā)新的MS治療藥物[3]。MS病理?yè)p傷機(jī)制與T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，膽堿能神經(jīng)的功能異常，胞漿型磷脂酶A2、激肽釋放酶等酶的激活和大量自由基釋放等密切相關(guān)[4]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為MS是由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，即人體對(duì)其自身組織發(fā)動(dòng)免疫攻擊而造成發(fā)病。MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)也證實(shí)激活的T細(xì)胞啟動(dòng)了 MS的炎性過(guò)程導(dǎo)致脫髓鞘等病變，并伴隨炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)和炎性介質(zhì)釋放，產(chǎn)生大量自由基、細(xì)胞因子及趨化因子等活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)可以直接成為發(fā)病的原因或加重因素，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)血管及組織的完整性破壞和功能異常[2_5]。EAE的臨床表現(xiàn)及病理改變與急性多發(fā)性硬化癥極其相似，因而成為研究MS免疫病理學(xué)機(jī)制及其實(shí)驗(yàn)性治療的最佳動(dòng)物模型[6]。EAE是一種人工誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性自身免疫疾病，可以在多種動(dòng)物品系中誘導(dǎo)產(chǎn)生。EAE可以通過(guò)主動(dòng)免疫脊髓組織勻漿誘導(dǎo)產(chǎn)生，或經(jīng)免疫弗氏完全佐劑乳化的髓鞘抗原蛋白如髓鞘堿性蛋白、蛋白脂蛋白或髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，也可經(jīng)被動(dòng)注入髓鞘抗原反應(yīng)活性的T細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生[7_14]。雖然 EAE是經(jīng)典的研究MS的方法，但該模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高、特異性不強(qiáng)、重復(fù)性差、且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選的目的。目前還沒(méi)有合適的研究髓鞘的體外細(xì)胞模型。有研究曾采用背根神經(jīng)節(jié)(DOG)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的方法來(lái)探索髓鞘形成過(guò)程中生長(zhǎng)因子對(duì)髓鞘形成的影響 [15_16]。但細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)體系的建立耗時(shí)較長(zhǎng)，方法不穩(wěn)定，重復(fù)性差，尚不適宜進(jìn)行體外高通量MS治療藥物篩選，并且體外細(xì)胞缺少藥物在生物整體的代謝轉(zhuǎn)化和體內(nèi)的循環(huán)分布， 不能反映藥物在體內(nèi)的真實(shí)情況[17]。因此建立一種能很好的模擬藥物在體內(nèi)的過(guò)程，又能快速方便的評(píng)價(jià)與篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物的動(dòng)物模型具有重要意義。斑馬魚(yú)是一種新穎的模式生物。與傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚(yú)篩選模型具有諸多優(yōu)勢(shì)，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環(huán)節(jié)驗(yàn)證的欠缺及傳統(tǒng)體內(nèi)篩選模型實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、成本高的弊端。斑馬魚(yú)是一種脊椎動(dòng)物，與人類基因的相似度高達(dá)85%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。與鼠類等哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚(yú)胚胎透明，可同時(shí)觀察分析多個(gè)器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低_。更重要的是，斑馬魚(yú)模型具有與生俱來(lái)的優(yōu)點(diǎn)[18_19]:①飼養(yǎng)成本低，性成熟周期短繁殖能力強(qiáng)，一尾雌魚(yú)每次可產(chǎn)200 300枚卵；③生長(zhǎng)發(fā)育速度快，在受精后24小時(shí)(24hpf)， 斑馬魚(yú)主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實(shí)驗(yàn)周期；④胚胎及幼魚(yú)透明，體外受精，體外發(fā)育，可直接觀察，并可同時(shí)分析多個(gè)器官系統(tǒng)；⑤胚胎有可以提供營(yíng)養(yǎng)的卵黃，第一周內(nèi)不需喂食，可避免化合物處理時(shí)化合物與食物成份的相互作用；
⑥胚胎體積小，幼魚(yú)體長(zhǎng)只有l(wèi)_4mm，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6、12、24、48或96孔板內(nèi)進(jìn)行分析；
⑦給藥方式簡(jiǎn)單溶于水的小分子物質(zhì)可直接經(jīng)皮膚、鰓及消化系統(tǒng)進(jìn)入斑馬魚(yú)體內(nèi)；不溶于水的物質(zhì)、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)可進(jìn)行顯微注射。因此斑馬魚(yú)可作為很好的評(píng)價(jià)與篩選藥物的高通量體內(nèi)脊椎動(dòng)物模型。研究表明斑馬魚(yú)的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特性和細(xì)胞譜系關(guān)系與哺乳動(dòng)物具有高度的可比性[2CH23]。斑馬魚(yú)體內(nèi)與髓鞘形成相關(guān)的基因(如dm20基因，mbp基因和PO 基因等)與哺乳動(dòng)物具有很好的同源性[23]。盡管這些基因與哺乳動(dòng)物有些不同，但高度保守的基因序列足夠表達(dá)出功能類似的蛋白(表1)[24]。斑馬魚(yú)大約發(fā)育到2dpf時(shí)大腦內(nèi)緊湊型髓鞘已經(jīng)形成，在此之前，斑馬魚(yú)少突膠質(zhì)細(xì)胞中與髓鞘形成相關(guān)的三大基因呈共同表達(dá)[24]。表I斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物中與髓鞘相關(guān)的主要蛋白的比較
權(quán)利要求
1.一種活體斑馬魚(yú)多發(fā)性硬化癥模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚(yú)選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組若干個(gè)不同濃度的誘導(dǎo)劑處理組和I個(gè)空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相同體積的相應(yīng)溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
2.一種評(píng)價(jià)或篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚(yú)選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組若干個(gè)化合物組合處理組、I個(gè)模型組、I個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組、I個(gè)溶劑對(duì)照組和I個(gè)空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相同體積的相應(yīng)溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
3.一種評(píng)價(jià)化合物誘導(dǎo)的髓鞘損傷的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斑馬魚(yú)選取挑取發(fā)育正常的斑馬魚(yú)放入微孔板中；(2)化合物處理移除微孔板中的培養(yǎng)液，設(shè)置多個(gè)實(shí)驗(yàn)組若干個(gè)待測(cè)化合物處理組、I個(gè)髓鞘損傷陽(yáng)性對(duì)照組、I個(gè)溶劑對(duì)照組和I個(gè)空白對(duì)照組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)微孔板的規(guī)格分別加入相同體積的相應(yīng)溶液，然后恒溫培養(yǎng)；(3)整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色；(4)圖像分析和/或微孔板分析；(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中斑馬魚(yú)為2dpf的斑馬魚(yú)，所述步驟(2)中斑馬魚(yú)培養(yǎng)時(shí)間為96小時(shí)，所述步驟(2)中空白對(duì)照組使用的溶液為斑馬魚(yú)養(yǎng)殖用水。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中的誘導(dǎo)劑為溴化乙錠 (EB)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(3)整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色包括以下步驟1)固定；2)水化；3)加入封閉液，室溫下輕輕搖晃；.4)將斑馬魚(yú)與兔抗斑馬魚(yú)神經(jīng)髓鞘蛋白抗體(anti-MBP)共同4°C靜置孵育過(guò)夜；.5)PBST 清洗；.6)加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育，避光；.7)PBST 清洗。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中化合物組合處理組加入的溶液為EB和待測(cè)化合物的混合溶液，模型組加入的溶液為EB溶液，陽(yáng)性對(duì)照組加入的溶液為 EB和多發(fā)性硬化癥治療藥物的混合溶液，溶劑對(duì)照組中加入的溶液為O. 1%的DMS0。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中待測(cè)化合物處理組加入的溶液為待測(cè)化合物溶液，髓鞘損傷陽(yáng)性對(duì)照組中加入的溶液為EB溶液，溶劑對(duì)照組中加入的溶液為O. 1%的DMS0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述步驟(4)圖像分析具體步驟為整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色結(jié)束后，顯微鏡拍照并保存，一方面通過(guò)觀察斑馬魚(yú)髓鞘熒光強(qiáng)度來(lái)定性評(píng)價(jià)，另一方面利用軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算斑馬魚(yú)髓鞘熒光強(qiáng)度；所述步驟(4)微孔板分析具體步驟為整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色后，將斑馬魚(yú)轉(zhuǎn)入96孔板中，每孔I 尾，然后將微孔板置于多功能微孔板分析儀下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，定量評(píng)價(jià)化合物對(duì)髓鞘再生的影響或化合物誘導(dǎo)的髓鞘損傷。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，所述步驟(3)整體斑馬魚(yú)神經(jīng)髓鞘熒光染色使用免疫組織化學(xué)染色方法、活性染料熒光染色方法或非活性染料熒光染色方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種斑馬魚(yú)多發(fā)性硬化癥模型的建立方法，并利用該動(dòng)物模型篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物或評(píng)價(jià)化合物誘導(dǎo)的神經(jīng)髓鞘損傷的方法。主要包括斑馬魚(yú)選取，化合物處理，整體斑馬魚(yú)免疫熒光染色，圖像分析和/或微孔板分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析幾個(gè)步驟。本發(fā)明的方法具有經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速、高效、化合物用量少等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)高通量篩選多發(fā)性硬化癥治療藥物的目的，并對(duì)加速多發(fā)性硬化癥治療藥物的研發(fā)進(jìn)程及多發(fā)性硬化癥患者的治療意義重大。
文檔編號(hào)A61K31/473GK102600156SQ20121001607
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者朱鳳, 朱曉宇, 李春?jiǎn)? 郭勝亞 申請(qǐng)人:杭州環(huán)特生物科技有限公司