專利名稱：一種可用于對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選的微流芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流芯片，特別涉及一種廉價、易于制備、適合大規(guī)模、高通量、自動化對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選的微流芯片。
背景技術(shù)：
斑馬魚是一種胚胎透明且滲透性強、發(fā)育快速且調(diào)控過程相對保守、體積小且易于操作的模式生物，利用斑馬魚進(jìn)行高通量的藥物篩選在生態(tài)毒理學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)、藥物研發(fā)等眾多領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。在篩選過程中，若能夠?qū)崿F(xiàn)自動化的換液步驟，則可以大量的減少勞動力及實驗的人為誤差。雖然人們已經(jīng)發(fā)展了利用高密度孔板及排槍來進(jìn)行換液的技術(shù)，但該技術(shù)只能提高操作的效率而不能滿足完全自動化的實現(xiàn)整個換液過程的需求。
近幾年，單細(xì)胞的研究越來越受到人們的重視，單個胚胎的研究也將成為生物學(xué)領(lǐng)域的一個熱點。然而，傳統(tǒng)的利用斑馬魚進(jìn)行篩選的方法，都是對幾個或者十幾個胚胎進(jìn)行群體處理及分析，這種群體方法得到的結(jié)果很可能淹沒了個體的信息。但是，由于傳統(tǒng)方法操作繁瑣，使得對單個胚胎逐一進(jìn)行處理不易實現(xiàn)。因此，我們的自動化操作的芯片也將在單個胚胎的研究方面扮演著重要的角色。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對現(xiàn)有技術(shù)中斑馬魚胚胎換液自動化程度低、勞動密集、消耗大的問題，提供一種微流芯片以及微流液體操作系統(tǒng)，該系統(tǒng)可實現(xiàn)斑馬魚胚胎藥物篩選過程中在設(shè)定時間點完成換液的全部過程，在一個優(yōu)選的實施方式中，在一張4X6個“養(yǎng)魚微池”(以下簡稱微池)的芯片中，每個微池中只有一個魚胚胎，這些養(yǎng)魚微池與流體層管道相連接，流體層管道通過程序控制對每個微池中的液體在設(shè)定的時間點實現(xiàn)加藥或洗脫，從而實現(xiàn)自動化的換液過程。如圖I所示，黑色管道為控制管道，紅色管道和綠色管道為流體層管道，黃色部分為微池，微池的入口和出口都采用二分型的管道設(shè)計來平衡阻力。本發(fā)明中的“芯片”與通常本領(lǐng)域所定義的芯片概念相同，其外觀為厚度均一的平整片狀物體，最常見的形狀為長方形或正方形。本發(fā)明中的“一條微流通道”是根據(jù)微流通道在微流芯片上的開口(非微池內(nèi)壁的開口)來確定的，與一個上述的開口連通的微流通道都屬于同一條微流通道。本發(fā)明中的“一條控制通道”是以在微流芯片上的開口為標(biāo)志，與一個上述的開口連通的控制通道都屬于同一條控制通道。本發(fā)明中的“交叉點”指的是微流通道與控制通道在微流芯片上的投影的相交點。顯而易見，由于微流通道和控制通道屬于不同的層，它們之間不可能是連通的。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。一種可用于對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選的微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括至少一個微流層、至少一個與微流層相鄰的控制層、將相鄰的微流層和控制層連接起來的連接層和至少一個用于容納斑馬魚胚胎并為其提供生長環(huán)境的微池；所述微流層具有至少2條微流通道；每一個微池的內(nèi)部空間與至少兩條微流通道連通，其中至少一條微流通道用于往微池中注入液體，上述微流通道稱為輸入微流通道，其余的微流通道用于從微池中抽出液體，上述微流通道稱為輸出微流通道；每一條微流通道在微流芯片上具有一個開口與外界連通，在至少一個微池內(nèi)壁上具有至少一個開口與微池內(nèi)部空間連通，所述開口的橫截面小于微池中魚胚胎的橫截面；所述控制層具有至少一條控制通道，每一條控制通道在微流芯片上具有一個開口與外界連通，其他部分均在微流芯片內(nèi)部；每一條微流通道與所述控制通道具有至少一個交叉點，至少一個交叉點位置的連接層由彈性體材料構(gòu)成，當(dāng)控制通道中的壓力增加到一定值時，上述至少一個交叉點位置的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內(nèi)表面緊密接觸至完全阻斷微流通道，使其處于斷開的狀態(tài)，當(dāng)控制通道中的壓力恢復(fù)時，交叉點位置的彈性體連接層恢復(fù)原態(tài)，微流通道重新連通，上述交叉點處的彈性體連接層具有閥門的功能，稱為彈性體閥門。采用上述技術(shù)方案便可以實現(xiàn)對斑馬魚胚胎全自動地進(jìn)行藥物篩選。在每個微池中放置一個魚胚胎，通過與其連通的某一條或多條微流通道往其中輸入溶液，該溶液可 以是供魚胚胎發(fā)育的緩沖溶液，也可以是影響胚胎發(fā)育的藥物溶液；通過與微池連通的其他微流通道從微池中抽出溶液，由于微流通道在微池內(nèi)壁上的開口的橫截面小于魚胚胎的橫截面，在抽出溶液的過程中，魚胚胎并不會被抽走，且抽吸過程經(jīng)檢測不足以明顯影響胚胎的正常發(fā)育?？刂仆ǖ琅c微流通道形成交叉點，在某些交叉點處使用彈性體材料形成連接層，便可以在這些交叉點處形成彈性體閥門，通過調(diào)節(jié)控制通道中的壓力便可以控制上述彈性體閥門的開或閉，從而控制對應(yīng)位置的微流通道的連通或斷開。將合適尺寸的管道從外部連接到微流芯片的微流通道入口和控制通道入口，在每一個與控制通道相連的管道上設(shè)置一個電磁閥，電磁閥與計算機連接，與輸入微流通道相連的外部管道稱為輸入管道，與輸出微流通道相連的外部管道稱為輸出管道，往輸入管道中預(yù)先注入一定量的液體(溶液)，使用時，將上述輸入管道與提供正壓的壓力泵連接，將輸出管道與提供負(fù)壓的壓力泵連接，將與控制通道相連的外部管道與提供正壓的壓力泵連接，通過計算機編程控制電磁閥在設(shè)定的時間打開或關(guān)閉，便可以實現(xiàn)全自動地對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選。在一個優(yōu)選的實施方案中，微流層、控制層和連接層均由彈性體材料構(gòu)成，控制通道在與微流通道的部分或全部交叉點處擴大形成空腔，該空腔的尺寸大于上述交叉點處微流通道的寬度，所述尺寸指空腔在微流通道的寬度方向上的尺寸，上述具有空腔的交叉點處的連接層具有閥門的功能，稱為彈性體閥門。微流層、控制層和連接層均由彈性體材料構(gòu)成是為了用簡便的實驗室方法制備微流芯片。由于許多彈性體材料具有良好的加工成型的性能，例如熱塑性、熱固性、輻射誘導(dǎo)交聯(lián)等，無需昂貴的設(shè)備以及復(fù)雜的方法，采用實驗室簡單的常用設(shè)備便可以方便地制備出各種結(jié)構(gòu)的微流芯片。控制通道在與微流通道的部分或全部交叉點處擴大形成空腔，由于空腔位置的連接層較薄、面積較大，因此當(dāng)控制通道中的壓力增加時，空腔位置處的連接層將最先膨脹，并且膨脹的形變較大，控制合適的壓力便可以保證只有空腔范圍內(nèi)的連接層膨脹至與微流通道內(nèi)壁緊密接觸，從而只在形成空腔處的交叉點阻斷微流通道。將空腔的尺寸設(shè)置為大于上述交叉點處微流通道的寬度，便可以保證空腔處的連接層膨脹時能徹底阻斷對應(yīng)位置的微流通道。在一個優(yōu)選的實施方案中，微流層、控制層和連接層的數(shù)目均為I ;多個微池排列成a行Xb列的點陣，其中a和b均為大于或等于4的正整數(shù)；微流層中的微流通道數(shù)目為2，其中一條微流通道為輸入微流通道，另一條微流通道為輸出微流通道；每一條微流通道均分叉形成分支，在每一個微池內(nèi)壁形成一個或多個開口從而與微池的內(nèi)部空間連通；每一條微流通道與控制通道形成aXb個彈性體閥門，所述彈性體閥門設(shè)置于微流通道上適當(dāng)?shù)奈恢茫瑥亩梢酝ㄟ^彈性體閥門控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。在上述技術(shù)方案中，微流層只具有2條微流通道，每一條都與所有的微池連通，其中一條與提供正壓的壓力泵連接，往微池中輸入溶液，另外一條與提供負(fù)壓的壓力泵連接，從微池中抽出溶液。彈性體閥門設(shè)置于微流通道上適當(dāng)?shù)奈恢?，一般設(shè)置在微流通道在微池內(nèi)壁上的出口附近的微流通道上，每一個微池都對應(yīng)2個彈性體 閥門，其中一個控制輸入微流通道，另一個控制輸出微流通道，因此通過一共2XaXb個彈性體閥門便可以控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。當(dāng)每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁僅形成一個開口時，可以將所述彈性體閥門設(shè)置于上述開口與最近的一個分叉之間；當(dāng)每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁形成多個開口時(多個開口是由微流通道經(jīng)過一次分叉形成的)，所述彈性體閥門位于與上述開口距離最近的兩個分叉之間，上述多個開口等間距地分布在微池內(nèi)壁上，目的是使得液體更換的效率更高，以及使得液體的注入能更快地分散均一；優(yōu)選地，每一條控制通道只與一條微流通道形成一個彈性體閥門，也就是2 X a X b個彈性體閥門對應(yīng)2 X a X b條控制通道，從而可以單獨地控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。在一個優(yōu)選的實施方案中，微流層、控制層和連接層的數(shù)目均為I ;多個微池排列成a行Xb列的點陣，其中a和b均為大于或等于4的正整數(shù)；微流層中的微流通道數(shù)目為b+Ι，其中b條微流通道為輸入微流通道，一條微流通道為輸出微流通道；b條輸入微流通道中的每一條均分叉形成分支，在某一列微池中的每一個微池的內(nèi)壁形成一個或多個開口，從而與微池內(nèi)部空間連通；輸出微流通道則分叉形成分支，在每一個微池內(nèi)壁形成一個或多個開口從而與微池的內(nèi)部空間連通；b條輸入微流通道中的每一條均與控制通道形成a個彈性體閥門，輸出微流通道與控制通道形成aXb個彈性體閥門，所述彈性體閥門設(shè)置于微流通道上適當(dāng)?shù)奈恢茫瑥亩梢酝ㄟ^彈性體閥門控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。設(shè)置b條微流通道用于往微池中注入液體，每列微池與同一條微流通道連通，b列微池就對應(yīng)b條微流通道，這樣設(shè)置的目的是為了可以在不同列的微池中輸入不同的溶液，從而進(jìn)行對比實驗。當(dāng)每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁僅形成一個開口時，可以將所述彈性體閥門設(shè)置于上述開口與最近的一個分叉之間；當(dāng)每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁形成多個開口時(多個開口是由微流通道經(jīng)過一次分叉形成的)，所述彈性體閥門位于與上述開口距離最近的兩個分叉之間，上述多個開口等間距地分布在微池內(nèi)壁上，目的是使得液體更換的效率更高，以及使得液體的注入能更快地分散均一；優(yōu)選地，每一條控制通道只與一條微流通道形成一個彈性體閥門，也就是2 X aXb個彈性體閥門對應(yīng)2 X aXb條控制通道，從而可以單獨地控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。在一個優(yōu)選的實施方案中，每一個微池內(nèi)壁上，輸入微流通道的開口與輸出微流通道的開口處于相對的位置。這樣設(shè)置的目的也是為了提高液體更換的效率。在實驗中，一般先通過微流通道抽出微池中原有的溶液，然后再注入新的溶液，由于注入口和抽出口處于相對的位置，原有溶液和新注入的溶液混合的可能性就減小，從而提高了更換溶液的效率。
優(yōu)選地，彈性體材料選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、環(huán)狀聚烯烴共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ;C0C)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龍、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡膠、聚異戊二烯、丁基橡膠、齒化丁基橡膠、聚丁二烯、丁苯橡膠、丁腈橡膠、氯丁二烯橡膠、乙丙橡膠、表氯醇橡膠、聚丙烯酸酯橡膠、硅酮橡膠、氟硅橡膠、含氟彈性體(FKM)、全氟彈性體(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、節(jié)肢彈性蛋白(resilin)、彈性蛋白(elastin)、聚酰亞胺、酹醒樹脂中的一種或者任意兩種以上的混合物。實施例中使用聚二甲基硅氧烷制備微流芯片，這是由于PDMS具有許多有利于微澆筑、微模塑和微圖案化的材料特性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解，所有本領(lǐng)域現(xiàn)有的彈性體材料都能應(yīng)用于本發(fā)明的微流芯片中，而并不限于上述優(yōu)選的實例。
本發(fā)明還提供一種可用于對斑馬魚胚胎進(jìn)行自動藥物篩選的裝置，其特征在于該裝置包括上述微流芯片、與微流通道以及控制通道連通的管道、與所述管道連接的泵、設(shè)置在所述管道上的電磁閥、以及與所述電磁閥連接并對電磁閥進(jìn)行控制的計算機。使用該裝置進(jìn)行實驗的時候，若實驗時間較長，還可以在芯片上蓋一層蓋板，以防止微池中溶液的蒸發(fā)。使用上述裝置對斑馬魚胚胎進(jìn)行自動藥物篩選的方法，按照如下步驟進(jìn)行1)在每個微池中放入一枚斑馬魚胚胎以及緩沖溶液；2)在與輸入微流通道連接的管道中預(yù)先通入實驗所用的溶液；3)開啟與管道連接的泵，其中與輸入微流通道以及控制通道連接的泵產(chǎn)生正壓，與輸出微流通道 連接的泵產(chǎn)生負(fù)壓；4)通過計算機控制電磁閥，在設(shè)定的時間打開或關(guān)閉電磁閥，便可以實現(xiàn)對斑馬魚胚胎進(jìn)行全自動的藥物篩選。各個泵試驗中都處于開啟狀態(tài)，電磁閥開啟的時候，泵提供的壓力就能傳達(dá)到控制通道中去，于是控制通道上的彈性體閥門便膨脹，關(guān)閉對應(yīng)的微流通道，因此雖然泵處于工作狀態(tài)，微池中的溶液并不會被更換；當(dāng)需要更換溶液的時候，通過計算機控制關(guān)閉與輸出微流通道交叉的控制通道上的電磁閥，電磁閥所在的管路上與控制通道相連那一端的壓力便消除，彈性體閥門恢復(fù)原態(tài)，輸出微流通道變?yōu)檫B通狀態(tài)，在泵的負(fù)壓作用下，微池中的溶液被抽出；然后，通過計算機開啟上述電磁閥，輸出微流通道斷開，采用同樣的步驟使輸入微流通道連通，往微池中輸入新的溶液，一個換液循環(huán)便完成了。通過計算機的程序(例如Labview)可以方便的實現(xiàn)整個實驗過程的全自動化。不難發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所帶來的技術(shù)效果是很顯著的。I)傳統(tǒng)的方法需要人工換液，操作及其繁瑣，而且當(dāng)實驗通量較大的時候，其需要的操作量是相當(dāng)巨大的，而采用本發(fā)明的裝置進(jìn)行操作，往微池中加入魚胚胎之后，所有的操作都由計算機控制自動完成，節(jié)省了大量的人力。2)斑馬魚的發(fā)育過程持續(xù)很長時間，一般需要2-3天，在整個實驗過程中，操作員都必須守候在實驗室，隨時對其進(jìn)行換液操作，而采用本發(fā)明的裝置進(jìn)行操作，則只需事先編好程序，實驗開始之后就不需要人工監(jiān)護(hù)，只需等待實驗自動完成之后取實驗結(jié)果；3)傳統(tǒng)的實驗方法往往由于人力操作成本的限制，需要在同一個微池中養(yǎng)育多個胚胎，以獲得足夠多的樣本數(shù)，但是同一個微池中的多個胚胎之間可能會相互影響彼此的發(fā)育，對實驗結(jié)果造成不利影響，而采用本發(fā)明的裝置則沒有上述問題，由于實現(xiàn)了全自動化的操作，而芯片的制造簡單而廉價，可以很方便地制造出具有大量微池的微流芯片，在保證樣本數(shù)的前提下，每一個微池中只養(yǎng)育一個胚胎，從而消除了胚胎之間的相互影響，使得實驗結(jié)果更加可靠。


圖I本發(fā)明的一種優(yōu)選結(jié)構(gòu)的微流芯片示意圖，黑色管道為控制管道，紅色管道和綠色管道為流體層管道，黃色部分為“養(yǎng)魚微池”(簡稱微池)，微池的入口和出口都采用二分型的管道設(shè)計來平衡阻力。圖2使用本發(fā)明的微流芯片替換養(yǎng)魚微池中液體的過程照片。(a)為操作之前，微池中充滿了綠色染料，(b)為操作之后，微池中的綠色染料被替換為紅色染料。圖3(a)_(c)展示了使用本發(fā)明的微流芯片對正常斑馬魚胚胎經(jīng)過兩個換液循環(huán)操作后被染成綠色的過程。圖4用本發(fā)明的微流芯片對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物處理結(jié)果。(a)-(c)使·用Hedgehog通路的小分子抑制劑cytopamine對轉(zhuǎn)基因魚系Tg(8gli:GFP)的胚胎在6hpf-36hpf進(jìn)行處理的結(jié)果,其中Tg(8gli:GFP)是利用Hedgehog通路下游基因Gli的結(jié)合位點串聯(lián)八次做出來的GFP報告魚系。(a)0yM濃度藥物刺激下，軀干部熒光很強。(b)在50 μ M濃度的藥物刺激下，軀干部熒光基本正常。(c)在100 μ M濃度的藥物刺激下，軀干部的突光非常弱。(d)-(g)使用Hedgehog通路的小分子抑制劑cytopamine對血管特異性轉(zhuǎn)基因魚系Tg(Flk:eGFP)在不同的時間段進(jìn)行處理的結(jié)果。(d) O μ M濃度藥物刺激下，在各不同的處理時間下，均發(fā)育正常，熒光顯微鏡下觀察節(jié)間血管，熒光很強，發(fā)育正常。(e)在6hpf-36hpf施加100 μ M的藥物刺激，節(jié)間血管未見生長，發(fā)育不正常。(f)6hpf-17hpf施加100 μ M的藥物刺激，節(jié)間血管發(fā)育基本正常。(g)在17hpf-36hpf施加100 μ M的藥物刺激，節(jié)間血管未見生長，發(fā)育不正常。
具體實施例方式以下舉例說明微流芯片的制備方法，下面的實施例中使用較簡便的光刻膠GM1070、ΑΖ4620以及PDMS制備，但并不表示微流芯片只能由這樣的方法制備，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解，任何本領(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)都可以用來制備具有本發(fā)明結(jié)構(gòu)的微流芯片。I.制備方法I. I.微流芯片模板的制備I. I. I.控制層模板的制作方法用Auto CAD軟件設(shè)計控制層的模板再由蘇州美精微光電有限公司打印。清洗硅片，先用丙酮后用異丙醇清洗，吹干。把清洗后的硅片至于110°c加熱板上加熱lOmin。將GM1070光刻膠倒在硅片上，用勻膠機甩勻2000rpm，60sec。將硅片至于平整臺面上放置IOmin0將娃片至于65°C加熱臺上烘5min,再將娃片轉(zhuǎn)移到95°C加熱臺上烘15min。待娃片冷卻后,紫外光曝光,曝光量200mJ/cm2。將娃片至于65°C加熱臺上烘5min,再將娃片轉(zhuǎn)移到95°C加熱臺上烘15min。在負(fù)膠顯影液中顯影，用丙酮和異丙醇沖洗干凈。最后將硅片放到155°C加熱臺上烘3h。I. I. 2.流體層模板的制作方法用Auto CAD軟件設(shè)計流體層的正膠模板后由蘇州美精微光電有限公司打印。清洗硅片，先用丙酮后用異丙醇清洗，吹干。把清洗后的硅片至于110°c加熱板上加熱lOmin。再用六甲基氮二硅烷(HMDS)熏蒸硅片lOmin。將AZ4620光刻膠倒在硅片上，用勻膠機甩勻1200rpm,60seco將娃片至于平整臺面上放置lOmin。將娃片至于95°C加熱臺上烘3min。再將硅片至于115°C加熱臺上烘5min。之后在涂有正膠的模板上再涂上一層AZ4620，用勻膠機甩勻1200rpm,60sec。將娃片至于平整臺面上放置lOmin。將娃片至于95°C加熱臺上烘4min。再將娃片至于115°C加熱臺上烘6min。待娃片冷卻后，紫外光曝光，曝光量200mJ/cm2。用AZ顯影液(顯影液與水的比例為I : 2)顯影，顯影后將硅片至于清水中浸泡30min。最后將硅片至于加熱臺上，從20°C升溫到22 0°C，6°C /h，并且在220°C停留3h。流體層的負(fù)膠掩模用AutoCAD軟件設(shè)計后由蘇州美精微光電有限公司打印。將GM1070光刻膠倒在有正膠流體層的娃片上，用勻膠機甩勻IOOOrpm,60sec。將該娃片至于平整臺面上放置lOmin。將娃片至于65°C加熱臺上烘5min,再將娃片轉(zhuǎn)移到95°C加熱臺上烘15min。待娃片冷卻后，在曝光機的顯微鏡下將正負(fù)膠的圖形對準(zhǔn)，紫外光曝光，曝光量200mJ/cm2 ο將娃片至于65°C加熱臺上烘5min,再將娃片轉(zhuǎn)移到95°C加熱臺上烘15min。在負(fù)膠顯影液中顯影，用丙酮和異丙醇沖洗干凈。最后將硅片放到155°C加熱臺上烘3h。1.2.微流芯片的制備1.2.1.微流芯片的微流層(fluid layer)的制作用GE RTV615PDMS，取 50g 的 PDMS(A) (a)和 IOg 的 PDMS (b)放入同一容器中。將配好PDMS的容器放入混合器中，混合除泡各3min，2000rpm。模具用流體層模板。模板用三甲基氯硅烷(TMS)熏蒸lOmin。將模板放在用鋁箔包好的培養(yǎng)皿中，之后將混合好的PDMS灌在模板上，放入保干器中抽氣。放入烘箱中80°C，烘40min。1.2.2.微流芯片的控制層(fluid layer)和連接層的制作用GE RTV615PDMS,取IOg的PDMS⑷和O. 5g的PDMS⑶放入同一容器中。將配好PDMS的容器放入混合器中，混合除泡各3min，2000rpm。模具用控制層模板。模板放在勻膠臺上，倒上混合好的PDMS，勻膠1300rpm，60sec，放置約20min，使PDMS表面平整。放入烘箱 80。。，烘 40min。I. 2. 2.微流芯片的基底層(fluid layer)的制作將配好的20 I的PDMS用混合器混合均勻，混合除泡各3min，2000rpm。載玻片放在勻膠臺上，倒上混合好的PDMS，勻膠1500rpm，60sec，放置約20min，使PDMS表面平整。放入烘箱80°C，烘20min。I. 2. 3.微流芯片芯片蓋(即上文所述防止微池中溶液蒸發(fā)的“蓋板”)的制作用GE RTV615PDMS，取20g的PDMS⑷和Ig的PDMS⑶放入同一容器中。將配好PDMS的容器放入混合器中，混合除泡各3min，2000rpm。模具用無圖案的硅片將模板放在用鋁箔包好的培養(yǎng)皿中，之后將混合好的PDMS灌在模板上，放入保干器中抽氣。放入烘箱中80°C，烘60min。取出制備好的芯片蓋PDMS，取下硅片，PDMS膠塊切成合適大小待用。I. 3.芯片各層進(jìn)行不可逆熱聚合的處理取出制備好的流體層PDMS，取下硅片，沿著邊框線將膠塊切開，然后用直徑為I. 5mm的打孔針在流體層進(jìn)樣口打孔，用直徑為4mm的打孔針在“養(yǎng)魚微池”的位置打孔。取出制備好的控制層和連接層PDMS，將流體層PDMS貼在控制層和連接層PDMS上方，在顯微鏡下對齊疊放兩層PDMS。放入烘箱80°C，80min。沿邊緣撕下已經(jīng)聚合的兩層PDMS芯片，然后在控制層進(jìn)樣口處用直徑為I. 5mm的打孔針打孔。將作好的芯片貼在芯片基底上。80°C烘過夜。實施例I微流芯片的結(jié)構(gòu)。本實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的微流芯片的一個優(yōu)選結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)如圖I所示。開口在微流芯片上方的輸入微流通道分叉形成3個分支，每一個分支又進(jìn)一步分叉形成2個小分支，形成的6個分支分別與6列微池中某一列微池的內(nèi)部空間連通，每個分支進(jìn)一步分叉為4個小分支在每一個微池內(nèi)壁上形成4個開口，4個開口等間距地分布在微池內(nèi)壁上，使得液體的注入、更換更加高效；輸出微流通道一共有6條，每一條與一列微池連通，同樣的，微流通道在每一個微池內(nèi)壁上形成4個開口，4個開口等間距地分布在微池內(nèi)壁上，使得液體的抽出、更換更加高效。控制通道一共22條，對應(yīng)有66個彈性體閥門，用于控制微池與微流通道連通狀態(tài)的彈性體閥門設(shè)置在離微池最近的2個分叉之 間，通過調(diào)節(jié)上述22條控制通道中的壓力，便可以控制上述66個彈性體閥門的開或閉，從而控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)?？刂仆ǖ酪约皬椥泽w閥門的設(shè)置并不限于上述方式，總的原則是用盡量少的控制通道以及閥門來控制盡可能多的微流通道，這種設(shè)計方法屬于成熟的現(xiàn)有技術(shù)，可以參考文獻(xiàn)Todd Thorsen et al. /iMicrofluidic Large-ScaleIntegration”，Science，Vol.298，580-584，2002-10-18。實施例2本實施例用染料實驗說明本發(fā)明提供的微流液體操作系統(tǒng)可以實現(xiàn)養(yǎng)魚微池中液體的替換。在真空抽氣泵驅(qū)動及電磁閥的控制下，微池中的液體通過微管道及軟管與負(fù)壓相連，在一個負(fù)大氣壓的作用下，10秒內(nèi)，養(yǎng)魚微池內(nèi)的液體被完全吸出芯片，此過程為吸液過程。在壓縮空氣的驅(qū)動及電磁閥的控制下，微池中的液體通過微管道及軟管與正壓相連，在一個大氣壓的作用下，5秒內(nèi)，養(yǎng)魚微池內(nèi)的液體軟管中的液體被送到指定的微池中，在微池中積蓄了一定高度的液體，此過程成為送液過程。一個抽液過程和一個送液過程共同被稱為一個循環(huán)。一個循環(huán)后微池中的液體即可被替換。圖2(a)_(b)展示了微流芯片的一個微池中一個循環(huán)后綠色染料被替換成紅色染料的過程。實施例3本實施例利用斑馬魚胚胎在芯片中自動被染料染色過程實驗說明本發(fā)明提供的微流液體操作系統(tǒng)可以用于進(jìn)行魚胚胎的藥物處理。用綠色染料來染正常的斑馬魚胚胎。先將斑馬魚胚胎和緩沖溶液一同放入養(yǎng)魚微池中。先進(jìn)行吸液過程，此后用綠色染料進(jìn)行進(jìn)液過程，之后重復(fù)吸液過程，最后用緩沖溶液進(jìn)行進(jìn)液過程。圖3(a)_(c)展示了正常斑馬魚胚胎經(jīng)過兩個循環(huán)后被染成綠色的過程。實施例4本實施例利用Hedgehog通路的特異性小分子抑制劑cytopamine抑制斑馬魚體節(jié)間血管生長的現(xiàn)象說明本微流芯片在不同的時間點處理胚胎，得到藥物作用的關(guān)鍵時期方面的應(yīng)用。首先，本實施例利用不同濃度藥物對斑馬魚胚胎進(jìn)行處理找到藥物處理的有效濃度。本實施例使用Hedgehog通路下游分子Gli的結(jié)合位點做成的熒光報告系統(tǒng)做成轉(zhuǎn)基因魚系Tg(8gli:GFP)，該魚系可用來指示Hedgehog是否激活而使Gli結(jié)合其結(jié)合位點啟動GFP表達(dá)。在芯片中，用塑料吸管將每個養(yǎng)魚微池放入一枚斑馬魚胚胎及緩沖溶液并且用芯片蓋蓋好，之后放入28°C水浴鍋中培養(yǎng)。在水浴鍋中，保持鍋內(nèi)的水接觸但不淹沒芯片上表面。通過芯片上較小的開口連接軟管，軟管中預(yù)先通入不同濃度的藥物，同一列用同一濃度的cytopamine藥物進(jìn)行刺激，不同列間刺激藥物的濃度不同，藥物濃度分別為O μ M，50 μ M和ΙΟΟμΜ。每個養(yǎng)魚微池中的魚會按照設(shè)定的程序被加以不同濃度的藥物，斑馬魚胚胎在6hpf-36hpf (hours past fertilization)受到藥物刺激。每次換液操作為實施例I中的一個循環(huán)。36hpf時，將芯片從水浴鍋中拿出，取下芯片蓋并且用塑料吸管吸出芯片內(nèi)的魚，去卵膜在顯微鏡下記錄結(jié)果。圖4(a)-(c)顯示出了 36hpf，轉(zhuǎn)基因魚系Tg(8gli:GFP)的斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果圖。結(jié)果顯示斑馬魚胚胎在不同濃度的藥物刺激下有不同響應(yīng)。如圖4，(a)魚胚胎在0μ M濃度藥物刺激下，軀干部熒光很強。(b)在50μΜ濃度的藥物刺激下，軀干部熒光基本正常。(c)在ΙΟΟμΜ濃度的藥物刺激下，軀干部的熒光非常弱。以上結(jié)果說明100 μ M可為藥物處理的有效濃度。其次，本實施例用有效濃度的藥物在不同的時間點處理胚胎，得到藥物作用 時期的關(guān)鍵時間。本實施例使用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因魚系Tg(Flk = GFP)來觀察斑馬魚胚胎體節(jié)間血管的生長情況。用上述胚胎處理方法，每列用同一濃度的cytopamine藥物進(jìn)行刺激，不同列間刺激藥物的濃度不同，藥物濃度分別為O μ M，100 μ Μ。每一行施加相同的處理時間，不同行之間的處理時間不同，第一行為6hpf_36hpf (hourspast fertilization)，第二行藥物的刺激時間為6hpf_17hpf,三行藥物刺激時間為17hpf-36hpf，。每一行魚胚胎在相應(yīng)藥物處理時間外的6hpf-36hpf的其他時間均在普通緩沖溶液中，無藥物刺激。每個微池中的魚會按照設(shè)定的程序被加以不同濃度的藥物及刺激時間的操作。每次換液操作為實施例I中的一個循環(huán)。在36hpf時，將芯片從水浴鍋中拿出，取下芯片蓋并且用塑料吸管吸出芯片內(nèi)的魚，去卵膜在顯微鏡下記錄結(jié)果。圖4 (d) - (g)顯示出了 36hpf，轉(zhuǎn)基因魚系Tg(Flk = GFP)的斑馬魚在熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果圖。如圖4，(d)結(jié)果顯示斑馬魚胚胎在ΟμΜ濃度藥物刺激下，在各不同的處理時間下，均發(fā)育正常，熒光顯微鏡下觀察節(jié)間血管，熒光很強，發(fā)育正常。(e)在6hpf-36hpf施加100 μ M的藥物刺激，節(jié)間血管未見生長，發(fā)育不正常。(f)6hpf-17hpf施加ΙΟΟμΜ的藥物刺激，節(jié)間血管發(fā)育基本正常。(g)在17hpf-36hpf施加100 μ M的藥物刺激，節(jié)間血管未見生長，發(fā)育不正常。本實施例的結(jié)果初步說明17hpf_36hpf是Hedghog通路影響節(jié)間血管生長的關(guān)鍵時期，此結(jié)果與傳統(tǒng)方法所得結(jié)果有一致性。
權(quán)利要求
1.一種可用于對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選的微流芯片，其特征在于所述微流芯片包括至少一個微流層、至少一個與微流層相鄰的控制層、將相鄰的微流層和控制層連接起來的連接層和至少一個用于容納斑馬魚胚胎并為其提供生長環(huán)境的微池；所述微流層具有至少2條微流通道；每一個微池的內(nèi)部空間與至少兩條微流通道連通，其中至少一條微流通道用于往微池中注入液體，上述微流通道稱為輸入微流通道，其余的微流通道用于從微池中抽出液體，上述微流通道稱為輸出微流通道；每一條微流通道在微流芯片上具有一個開口與外界連通，在至少一個微池內(nèi)壁上具有至少一個開口與微池內(nèi)部空間連通，所述開口的橫截面小于微池中魚卵的橫 截面；所述控制層具有至少一條控制通道，每一條控制通道在微流芯片上具有一個開口與外界連通，其他部分均在微流芯片內(nèi)部；每一條微流通道與所述控制通道具有至少一個交叉點，至少一個交叉點位置的連接層由彈性體材料構(gòu)成，當(dāng)控制通道中的壓力增加到一定值時，上述至少一個交叉點位置的彈性體連接層將向微流層方向膨脹并與微流通道內(nèi)表面緊密接觸至完全阻斷微流通道，使其處于斷開的狀態(tài)，當(dāng)控制通道中的壓力恢復(fù)時，交叉點位置的彈性體連接層恢復(fù)原態(tài)，微流通道重新連通，上述交叉點處的彈性體連接層具有閥門的功能，稱為彈性體閥門。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微流芯片，其特征在于微流層、控制層和連接層均由彈性體材料構(gòu)成，控制通道在與微流通道的部分或全部交叉點處擴大形成空腔，該空腔的尺寸大于上述交叉點處微流通道的寬度，所述尺寸指空腔在微流通道的寬度方向上的尺寸，上述具有空腔的交叉點處的連接層具有閥門的功能，稱為彈性體閥門。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微流芯片，其特征在于微流層、控制層和連接層的數(shù)目均為I ;多個微池排列成a行Xb列的點陣，其中a和b均為大于或等于4的正整數(shù)；微流層中的微流通道數(shù)目為2，其中一條微流通道為輸入微流通道，另一條微流通道為輸出微流通道；每一條微流通道均分叉形成分支，在每一個微池內(nèi)壁形成一個或多個開口從而與微池的內(nèi)部空間連通；每一條微流通道與控制通道形成aXb個彈性體閥門，所述彈性體閥門設(shè)置于微流通道上適當(dāng)?shù)奈恢?，從而可以通過彈性體閥門控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流芯片，其特征在于每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁僅形成一個開口，所述彈性體閥門位于上述開口與最近的一個分叉之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流芯片，其特征在于每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁形成多個開口，上述多個開口等間距地分布在微池內(nèi)壁上，所述彈性體閥門位于與上述開口距離 >最近的兩個分叉之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5的任一項所述的微流芯片，其特征在于每一條控制通道只與一條微流通道形成一個彈性體閥門。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的微流芯片，其特征在于微流層、控制層和連接層的數(shù)目均為I ;多個微池排列成a行Xb列的點陣，其中a和b均為大于或等于4的正整數(shù)；微流層中的微流通道數(shù)目為b+Ι，其中b條微流通道為輸入微流通道，一條微流通道為輸出微流通道山條輸入微流通道中的每一條均分叉形成分支，在某一列微池中的每一個微池的內(nèi)壁形成一個或多個開口，從而與微池內(nèi)部空間連通；輸出微流通道則分叉形成分支，在每一個微池內(nèi)壁形成一個或多個開口從而與微池的內(nèi)部空間連通；b條輸入微流通道中的每一條均與控制通道形成a個彈性體閥門，輸出微流通道與控制通道形成aXb個彈性體閥門，所述彈性體閥門設(shè)置于微流通道上適當(dāng)?shù)奈恢?，從而可以通過彈性體閥門控制每一個微池與微流通道的連通狀態(tài)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微流芯片，其特征在于每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁僅形成一個開口，所述彈性體閥門位于上述開口與最近的一個分叉之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微流芯片，其特征在于每一條微流通道在一個微池內(nèi)壁形成多個開口，上述多個開口等間距地分布在微池內(nèi)壁上，所述彈性體閥門位于與上述開口距離最近的兩個分叉之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9的任一項所述的微流芯片，其特征在于每一條控制通道只與一條微流通道形成一個彈性體閥門。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任一項所述的微流芯片,其特征在于,在每一個微池內(nèi)壁上，輸入微流通道的開口與輸出微流通道的開口處于相對的位置。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項所述的微流芯片，其特征在于所述彈性體材料選自聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚碳酸酯(PC)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、環(huán)狀聚烯烴共聚合物(Cyclic Olefin Copolymers ;C0C)、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚砜、尼龍、苯乙烯-丙烯酸共聚物、天然橡膠、聚異戊二烯、丁基橡膠、齒化丁基橡膠、聚丁二烯、丁苯橡膠、丁腈橡膠、氯丁二烯橡膠、乙丙橡膠、表氯醇橡膠、聚丙烯酸酯橡膠、硅酮橡膠、氟硅橡膠、含氟彈性體(FKM)、全氟彈性體(FFKM)、乙烯-乙酸乙烯酯、節(jié)肢彈性蛋白(resilin)、彈性蛋白(elastin)、聚酰亞胺、酚醛樹脂中的一種或者任意兩種以上的混合物。
13.一種可用于對斑馬魚胚胎進(jìn)行自動藥物篩選的裝置，其特征在于該裝置包括權(quán)利要求1-12的任一項所述的微流芯片、與微流通道以及控制通道連通的管道、與所述管道連接的泵、設(shè)置在與控制通道連接的管道上的電磁閥、以及與所述電磁閥連接并對電磁閥進(jìn)行控制的計算機。
14.一種使用權(quán)利要求13所述的裝置對斑馬魚胚胎進(jìn)行自動藥物篩選的方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行1)在每個微池中放入一枚斑馬魚卵以及培養(yǎng)液；2)在與輸入微流通道連接的管道中預(yù)先通入實驗所用的溶液；3)開啟與管道連接的泵，其中與輸入微流通道以及控制通道連接的泵產(chǎn)生正壓，與輸出微流通道連接的泵產(chǎn)生負(fù)壓；4)通過計算機控制電磁閥，在設(shè)定的時間打開或關(guān)閉電磁閥，便可以實現(xiàn)對斑馬魚胚胎進(jìn)行全自動的藥物篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種廉價、易于制備、適合大規(guī)模、高通量、自動化對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選的微流芯片，包括至少一個微流層、至少一個與微流層相鄰的控制層、將相鄰的微流層和控制層連接起來的連接層和至少一個用于容納斑馬魚胚胎并為其提供生長環(huán)境的微池；所述微流層具有微流通道，微流通道與微池的內(nèi)部空間連通，控制層具有至少一條控制通道，微流通道與控制通道具有至少一個交叉點，至少一個交叉點位置的連接層由彈性體材料構(gòu)成，形成彈性體閥門。通過彈性體閥門可以方便地控制微流通道的連通狀態(tài)，從而通過外接計算機控制的電磁閥門，可以實現(xiàn)對斑馬魚胚胎進(jìn)行藥物篩選的全自動化操作。
文檔編號C12M1/36GK102757885SQ20111010628
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者劉新星, 周宏偉, 周瑩, 龐玉宏, 張博, 李文濤, 鄭春紅, 黃巖誼 申請人:北京大學(xué)