專利名稱：斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA及其克隆和重 組應(yīng)用。
背景技術(shù)：
BAFF具有很強(qiáng)的B細(xì)胞趨化性，在體外作為B細(xì)胞增殖和分化的共刺激因子，能 誘導(dǎo)活化的B細(xì)胞分泌大量的IgG、IgA、IgM等。對(duì)于休眠B細(xì)胞，BAFF雖不能獨(dú)立激活使 之進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán)，但通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、BcI-Xl的表達(dá)，可延長(zhǎng)休 眠B細(xì)胞的壽命。在體內(nèi)，它可以促進(jìn)脾臟內(nèi)Tl-B細(xì)胞向T2-B細(xì)胞以及成熟B細(xì)胞的發(fā) 育。BAFF的正常表達(dá)是GC形成、抗體親和力成熟、記憶性B細(xì)胞形成及B細(xì)胞正常發(fā)育的 必須條件BAFF+小鼠的次級(jí)淋巴器官囊外及過(guò)渡區(qū)B細(xì)胞完全缺失，而BAFF轉(zhuǎn)基因小鼠則 由于B220+細(xì)胞數(shù)目劇增而引起脾臟、淋巴結(jié)、派爾斑(Peyer’ s patch)腫大，血清中IgM、 IgG、IgA、IgE滴度上升，8周后出現(xiàn)與典型SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)相似的癥狀。最近的研 究顯示BAFF還具有調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化的作用。BAFF在體外能促進(jìn)B系淋巴瘤的增殖，并抑制 FasL-Fc和TACI-Fc的促凋亡作用，提示其還可能具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。由于T細(xì)胞表面表達(dá)BAFF特異性受體BAFF-R，且用抗BAFF-R的單克隆抗體 能阻斷BAFF對(duì)T細(xì)胞的增殖效應(yīng)，因此推測(cè)BAFF通過(guò)BAFF-R對(duì)T細(xì)胞的激活和分化起共 調(diào)節(jié)作用。有專家認(rèn)為，BAFF是B細(xì)胞存活的關(guān)鍵因子，猶如針對(duì)B細(xì)胞的一個(gè)精妙的安檢 站。過(guò)度表達(dá)BAFF可以減少B細(xì)胞的耐受性，產(chǎn)生免疫反應(yīng)。目前臨床實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果證 明了 BAFF在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病中的病理學(xué)角色。研究發(fā)現(xiàn)，存在于骨髓中的B細(xì) 胞的發(fā)育和選擇不依賴于BAFFJfii B細(xì)胞離開骨髓，便成為外周B細(xì)胞存活和成熟以及 T、B細(xì)胞激活的主要細(xì)胞因子。BAFF不僅是B細(xì)胞的存活因子，還對(duì)T細(xì)胞激活有共刺激作用。最新研究表明， BAFF的表達(dá)水平與感染和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。T、B細(xì)胞在自身免疫疾病中起到了重要作用，而BAFF主要表達(dá)在單核細(xì)胞、巨 噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和活化的T細(xì)胞表面，分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和各種介 質(zhì)，使B細(xì)胞活化為漿細(xì)胞，分泌大量免疫球蛋白，包括自身抗體，使機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)和 破壞。BAFF是B細(xì)胞活化的正調(diào)節(jié)蛋白。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，RA患 者的BAFF血清水平明顯增高，B細(xì)胞活化的標(biāo)記物可溶性⑶23 (s⑶23)同樣有明顯升高， 但二者相比無(wú)相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BAFF與RF具有相關(guān)性，表明BAFF在RA中作用是 誘導(dǎo)自身抗體的產(chǎn)生，而不是B細(xì)胞的活化。干燥綜合征中BAFF及其受體在唾液腺局部表達(dá)的作用，進(jìn)一步研究表明這些細(xì) 胞因子具有活性，可以延長(zhǎng)正常B細(xì)胞的存活。在SS中，BAFF的表達(dá)不僅來(lái)源于上皮細(xì)胞 和T細(xì)胞，還來(lái)自于B細(xì)胞，通過(guò)自分泌發(fā)揮免疫作用各種研究表明，許多惡性B系腫瘤異常表達(dá)BAFF和APRIL，并且這些腫瘤細(xì)胞表面 表達(dá)一種或多種BAFF與APRIL受體。人們也研究了“誘餌受體”BCMA-Fc、TACI_Fc及BAFF 的單克隆抗體對(duì)這些B系腫瘤抑制的影響，發(fā)現(xiàn)這些抗體及抗體類似物均能恢復(fù)這些腫瘤 細(xì)胞的凋亡作用。BAFF/APRIL配體-受體系統(tǒng)極有可能成為對(duì)抗多種惡性腫瘤的分子靶點(diǎn)庫(kù)。根據(jù)GenBank、EMBL和DDBJ國(guó)際三大主要核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果得知，目前已 知BAFF基因序列的魚類包括虹鱒魚，大西洋鮭魚，斑點(diǎn)綠河豚；APRIL基因序列包括虹 鱒魚，大西洋鮭魚，斑點(diǎn)叉尾鮰，并分別已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中申請(qǐng)了序列號(hào)，序列號(hào)分別 是 ABC84582、NP_001135232, SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑馬 魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(zBAFF) cDNA還未被克隆出來(lái)，關(guān)于斑馬魚BAFF基因的研究在整 個(gè)國(guó)內(nèi)外還處于完全空白狀態(tài)。斑馬魚(Zfeflio rerio)，又名藍(lán)條魚、花條魚、斑馬擔(dān)尼魚，屬于輻鰭亞綱 (Actinopterygii)鯉科iPyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(JMnio)的一種硬骨魚。原產(chǎn)自印度東 部、巴基斯坦、緬甸、孟加拉國(guó)等南亞地區(qū)，是一種常見(jiàn)的熱帶魚。斑馬魚是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織 認(rèn)可的5種魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，已經(jīng)成為發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)等研究常用的模式生 物。60年代末70年代初，Mreisinger首先對(duì)這種生物進(jìn)行了單倍體培育，建立了第 一個(gè)用紫外線突變的突變體。隨著純合子培養(yǎng)技術(shù)的成熟和廣泛高效的突變劑ENU的出 現(xiàn)，位于TUbingen和Boston等地的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室自1993年開始對(duì)斑馬魚進(jìn)行ENU大規(guī)模系 統(tǒng)突變篩選和建庫(kù)工作。1994年，在冷泉港召開的斑馬魚研究專題會(huì)議，標(biāo)志著斑馬魚已成 為繼小鼠，果蠅，線蟲后又一生物學(xué)研究的重要模式生物。雖然斑馬魚最初主要被用來(lái)進(jìn)行遺傳學(xué)及發(fā)育生物學(xué)研究，但近幾年，隨著 對(duì)斑馬魚了解的日趨深入，其在免疫學(xué)中的應(yīng)用也越來(lái)越為人們所重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從斑馬魚提取的B淋巴細(xì)胞刺激因子 cDNA，并提供斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組應(yīng)用。本發(fā)明從斑馬魚中克隆到B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的 序列。斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。本發(fā)明的斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的克隆方法如下
(1)從斑馬魚脾臟組織總RNA
(2)利用RT-PCR方法通過(guò)同源克隆(homologycloning)策略并結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò) 增法(RACE)克隆斑馬魚全長(zhǎng)BAFF的cDNA序列。上述斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的克隆方法具體操作如下
(1)利用Trizol試劑一步法提取斑馬魚脾臟組織總RNA
(2)通過(guò)Clustalw軟件分析虹鱒魚，大西洋鮭魚，斑點(diǎn)綠河豚BAFF cDNA保守區(qū)， 設(shè)計(jì)兼并引物
zBAFF1 5'-TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3' ； (SEQ ID N0. 3)zBAFF2 5' -GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3' (SEQ ID NO. 4) (3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到807bp的片段，如SEQ ID NO. 1所示。通過(guò)CLUSTAL軟件分析，比對(duì)斑馬魚與虹鱒魚、大西洋鮭魚、斑點(diǎn)綠河豚的BAFF氨 基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN: SINFRUP00000153079)結(jié)果如圖 3所示， 它們的同源性分別為67. 6，61. 4和66. 9%，并且可溶部分比跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)在進(jìn)化上更保 守。其開放閱讀框如SEQ ID NO. 1所示。上述斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(zBAFF)的cDNA的重組應(yīng)用，通過(guò)現(xiàn)有基因工程 方法，生產(chǎn)重組zBAFF。具有綠色熒光活性的重組蛋白，其可溶性、穩(wěn)定性及生物學(xué)活性達(dá)到 了預(yù)期的良好效果，為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的研究提供了生物工程工具的前體。


圖1 zBAFF (GenBank NO. FJ587513)的cDNA序列及對(duì)應(yīng)的蛋白序列
圖2保守氨基酸用黑色陰影標(biāo)注，跨膜區(qū)域用虛線標(biāo)注，(★)為三個(gè)保守的Cys殘基， 箭頭所指為N-糖基化位點(diǎn)，雙線標(biāo)注部位為Flap環(huán)，劃線部分為胞外可溶區(qū)。圖3是EGFP和EGFP-zsBAFF的熒光光譜測(cè)定。圖4是zsBAFF空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型(aa 116-268) hsBAFF空間結(jié)構(gòu)模型比較(aa 134-285) 0 (a)和(b)表示zsBAFF3D結(jié)構(gòu)的卡通示意模型和空間填滿模型，(c)和(d)表 示hsBAFF 3D結(jié)構(gòu)的卡通模型和空間填滿模型。圖5是SDS-PAGE分析EGFP_zsBAFF在大腸桿菌中的表達(dá)1重組蛋白非誘導(dǎo)；2 重組蛋白誘導(dǎo)20h ；3純化后蛋白EGFP-zsBAFF ；4 western blotting圖。圖6是EGFP-zsBAFF對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的促存活作用。圖7是EGFP-zsBAFF與小鼠淋巴細(xì)胞結(jié)合的激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果。(a)和(d)為 透射光(相位差)。(b)和(e)為(a)和(d)在488nm激發(fā)下的EGFP熒光(綠色)。(c) 和(f)為a/b or d/e兩圖的合并。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā) 明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。 所用到的引物，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同引物，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1
斑馬魚購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物遺傳中心
(1)引物設(shè)計(jì)通過(guò)Clustal W軟件分析虹鱒魚，大西洋鮭魚，斑點(diǎn)綠河豚BAFF cDNA 保守區(qū)，設(shè)計(jì)兼并引物 zBAFFl 5' -TTGTNCCNTGGCTTCTNAGCTTTAA-3' ；zBAFF2 5' -GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC-3'。(2)提取總RNA 應(yīng)用RNA抽提試劑TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手冊(cè) 提取斑馬魚脾臟細(xì)胞的總RNA，并通過(guò)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。(3)RT-PCR 以上述zBAFFl及zBAFF2為弓|物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到807bp的片段Pl。①逆轉(zhuǎn)錄
在DEPC處理的1. 5ml Eppendorf管中依次加入總RNA抽提物3 μ 1，Oligo d(T)18 1μ 1， 10mmol/L dNTP 2 μ 1，DEPC水5 μ 1置于；65 ° C，15min后立即冰浴5min ；再在上述體系 中加入 5 X RT 反應(yīng)緩沖液 4 μ 1，RNase inhibitor 0· 5 μ 1 (20u)，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μ 1，DEPC 水2. 5μ1至總體積為20μ1的反應(yīng)液，于42 ° C反應(yīng)1.5h，94 ° C，IOmin終止反應(yīng)，置 于冰上； ②PCR
利用逆轉(zhuǎn)錄所得模板進(jìn)行PCR，體系為5 O μ 1，10 μ mo 1 /L上、下游引物各2. 5 μ 1， 2. 5mmol/L dNTP 4 μ 1，25mmol/L MgCl2 3 μ 1，IOX 緩沖液 5 μ 1，cDNA 模板 5 μ 1，rTaq 酶 IylJnddH2O 27 μ I0 反應(yīng)程序?yàn)?4 ° C 5min，94 ° C 30s, 56 ° C 30s,72° C lmin, 30個(gè)循環(huán)，最后72 ° C孵育5min。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用膠回收試劑盒回收得到約 340bp的DNA條帶，克隆入pMDIS-T載體，經(jīng)含Amp抗生素(50mg/ml)的瓊脂糖平板篩選轉(zhuǎn) 化子，挑出陽(yáng)性克隆送往上海英駿測(cè)序公司進(jìn)行堿基序列測(cè)定。(4)同源檢索將所得序列Pl通過(guò)CLUSTAL軟件分析，比對(duì)斑馬魚與虹鱒 魚、大西洋鮭魚、斑點(diǎn)綠河豚的BAFF氨基酸序列(Genbank ABC84582, NP_001135232, EN:SINFRUP00000153079)結(jié)果如圖2所示，它們的同源性分別為67. 6，61. 4和66. 9%，并 且可溶部分比跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)在進(jìn)化上更保守。實(shí)施例2
斑馬魚BAFF重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 根據(jù)已知的zsBAFF序列和EGFP序列為模板分別設(shè)計(jì)引物Al、A2和A3、A4。其中Al 的5’端具有I酶切位點(diǎn)，A4的5’端具有Λ /7 /ΙΙΙ酶切位點(diǎn)，而Α2和A3含有在EGFP 和 zsBAFF之間編碼(GlyJer)2 linker 的堿基序列。通過(guò)over-lap PCR擴(kuò)增 EGFP-zsBAFF 基因片段。兩輪PCR后，將PCR產(chǎn)物割膠回收及pET-28a載體分別用B_H I和Hind III酶 切，T4 DNA Ligase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五coh'DH5a中，獲得含pET28a-EGFP-zsBAFF重組 菌株。挑選陽(yáng)性重組菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)提取pET28a-EGFP-ZSBAFF重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL2KDE3)中，挑選陽(yáng)性菌株誘導(dǎo)表達(dá)。引物序列如下 Al CGCGGATCCATGGTGAGCAAG (SEQ ID N0. 5)
A2 GCTGCCACCTCCACCGCTACCGCCGCCTCCCTTGTACAGCTC(SEQ ID N0. 6) A3 GGTGGAGGTGGCAGCAGCTTGAGTCATGCGCCAAAC(SEQ ID N0. 7) A4: CCCAAGCTTTCAGGCCAGTTTTATTGCTCCTA(SEQ ID NO. 8)
(其中Al含有及^/7 I酶切位點(diǎn)，A4含有Λ /^ΙΙΙ酶切位點(diǎn)；A2、A3含有編碼一個(gè)linker (Gly4Ser)2的基因序列)
經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)(圖5)顯示，在大約50 kDa處為目的蛋白，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)20 h達(dá)到
最大表達(dá)量。重組目的蛋白的Ni+親和純化
IPTG低溫誘導(dǎo)含有重組載體pET28a-EGFP-ZSBAFF的大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)24小時(shí)后，4°C收菌，冰上超聲破碎(160W，工作4s，暫停8s，共99次)表達(dá)菌體，4°C，13， 000Xg，20min離心超聲破碎液后，棄沉淀，留上清過(guò)Ni+-NTA柱。簡(jiǎn)要過(guò)程是3體積 Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手動(dòng)上樣含可溶性重組蛋白的上清，先后用10倍體積 的Binding buffer和 6倍體積的Washing buffer(20 mmol/L Imidazole, 0· 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl，pH 7. 9)洗去雜蛋白，最后用 Elute buffer (1 mol/L Imidazole，0. 5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9)洗脫目的蛋白，分管收集，PBS 除鹽。SDS-PAGE 檢測(cè)各收集管蛋白純度和紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。如圖5 (條帶3)所示，表達(dá)得到 的目的蛋白經(jīng)Ni+柱親和純化得到純度達(dá)95%的活性目的蛋白。zsBAFF空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
如圖4所示，zsBAFF空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型和hsBAFF空間結(jié)構(gòu)模型比較，由此看出，其空 間結(jié)構(gòu)與人BAFF已知結(jié)構(gòu)非常相似。Western 印記分析
Western-blot中所用一抗為鼠抗Hk6單抗，二抗為辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。 其簡(jiǎn)要步驟是將樣品先進(jìn)行SGS-PAGE，然后以浸入式法將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 (NC膜)上，用記號(hào)筆標(biāo)記蛋白marker各條帶，然而依次經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉lh，與一 抗孵育lh，與HRP標(biāo)記的二抗IgG孵育lh，每步完成后均嚴(yán)格洗膜，最后加TMB避光顯色。 結(jié)果如圖5 (條帶4)所示在目的蛋白位置出現(xiàn)了特異性條帶。實(shí)施例3 受體結(jié)合特性
BAFF可以與其三個(gè)受體結(jié)合，它們分別是TACI，BCMA和BAFF-R。TACI 表達(dá)與B細(xì)胞和激活的T細(xì)胞表面，而BCMA和BAFF-R則大部分或絕對(duì)表達(dá)與B細(xì)胞 表面。在這里EGFP-zsBAFF的結(jié)合特性我們用激光共聚焦顯微鏡來(lái)檢測(cè)。通過(guò)激光共聚焦 顯微鏡我們可以看到EGFP-zsBAFF可以結(jié)合與小鼠的淋巴細(xì)胞表面，而對(duì)照EGFP沒(méi)有結(jié)合 特性(圖7)。 EGFP-zsBAFF對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞促存活作用
在體外通過(guò)MTT細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測(cè)EGFP-zsBAFF對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的促存活作用，如圖6 所示，PBS為空白對(duì)照，12 μ g/ml EGFP-zsBAFF、12 μ g/ml EGFP+anti_IgM、5 μ g/ml EGFP和 anti-IgM 培養(yǎng)細(xì)胞為陰性對(duì)照，6 μ g/ml zsBAFF+ anti-IgM 和 2 μ g/ml hsBAFF+anti-IgM 為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)克隆得到的EGFP-zsBAFF對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞都具有明顯的促存 活效應(yīng)，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。實(shí)施例4
將實(shí)施例1獲得的斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法，轉(zhuǎn)入動(dòng)物 體內(nèi)，增加其免疫力，在飼養(yǎng)中應(yīng)用。按照本發(fā)明的方法可以通過(guò)現(xiàn)有基因工程技術(shù)，修飾斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子 基因并用于所述研究和生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子CDNA，其特征在于，具有SEQID NO. 1所示的序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子的克隆方法，其特征在于包括如 下步驟(1)TRIzol法提取斑馬魚脾臟總RNA，(2)根據(jù)B淋巴細(xì)胞刺激因子的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物 正義寡核苷酸引物 zBAFFl :5，-ATGCCTGCTGAAGATGTTGGTCC-3，， 反義寡核苷酸引物 zBAFF2 :5，- TCAGGCCAGTTTTATTGCTCC-3，，(3)通過(guò)RT-PCR方法，以上述引物dBAFFl及dBAFF2為引物，擴(kuò)增出斑馬魚全長(zhǎng)BAFF 的cDNA序列。
3.一種權(quán)利要求1所述的斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子cDNA的重組應(yīng)用，是通過(guò)現(xiàn)有基 因工程方法，生產(chǎn)重組斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子，作為斑馬魚類免疫增強(qiáng)劑。
4.斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子，其特征在于，具有SEQID NO. 2所示的序列。
全文摘要
斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(zBAFF)cDNA及其克隆方法和重組應(yīng)用，涉及生物基因工程領(lǐng)域。斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子基因的克隆方法如下TRIzol法提取斑馬魚脾臟總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；通過(guò)Clustalw軟件分析虹鱒魚,大西洋鮭魚,斑點(diǎn)綠河豚BAFFcDNA以及虹鱒魚，大西洋鮭魚，斑點(diǎn)叉尾鮰BAFFcDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得807bp全長(zhǎng)cDNA。所述斑馬魚B淋巴細(xì)胞刺激因子和增殖誘導(dǎo)配體cDNA可通過(guò)現(xiàn)有基因工程方法，生產(chǎn)重組斑馬魚的BAFF。
文檔編號(hào)C07K14/52GK102115748SQ20101059839
公開日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者張雙全, 梁臻寧, 閔翠 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)