專利名稱：：一種生物活性物質(zhì)活力的測定方法、一種心肌肽素及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物活性物質(zhì)活力的測定方法，以及一種心肌肽素及其用途，具體地說，本發(fā)明涉及一種從除人類以外的健康哺乳動物的心臟中提取的心肌肽素及其用途，屬于生化
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：健康哺乳動物的器官中，含有多種生物活性物質(zhì)，提取該類活性物質(zhì)用于各種疾病的治療，可突破傳統(tǒng)藥物束縛，從加強誘導體內(nèi)細胞本身抗損傷潛能出發(fā)，提供一種具有里程碑意義的疾病的治療藥物，近二十年來越來越得到科學家的重視。從健康哺乳動物的肝臟中提取的生物活性物質(zhì)用于治療肝臟疾病已經(jīng)用于臨床，并得到了良好的效果。但從健康幼年哺乳動物的其它器官中提取的生物活性物質(zhì)雖然進行了廣泛研究，但至今尚沒有可用于臨床應用的產(chǎn)品。例如，下述對比文獻涉及從健康幼年哺乳動物心臟中提取生物活性物質(zhì)的產(chǎn)品和/或方法ZL94102798公開了一種心肌細胞生長刺激肽及其制備方法，選取健康幼年哺乳動物的心臟，采用機械方式搗碎、-20℃深凍-溶解后加熱60-100℃，再-20℃深凍-溶解后離心3000rpm，經(jīng)負壓截留柱-除菌-分裝-凍干-包裝，得到分子量小于20000道爾頓的多肽類活性物質(zhì)。ZL94102799公開了一種具有刺激原代培養(yǎng)的心肌細胞的DNA合成和蛋白質(zhì)合成的心肌細胞生長刺激肽(GMGSP)，是從健康幼年哺乳動物的心臟中制備提取，在pH2-9范圍內(nèi)穩(wěn)定；在加熱95-100℃10分鐘，60-70℃30分鐘下生物活性不改變；在多種蛋白水解酶，37℃2小時條件下生物活性喪失；在水溶液22℃-30℃條件下可形成聚合體但生物活性改變不明顯；在加入3％-8％甘露醇凍干密封條件下，室溫貯存1.5年，4℃貯存2年，-20℃貯存3年，生物活性不改變；HPLC分析表明所述GMGSP由四個組分組成，各組分相對峰及保留時間分別為10.4％(2.88分)，6.4％(3.93分)，36.3％(5.09分)，7.3％(7.41分)，每個組分均具有生物活性；經(jīng)SDS-PAGE分析顯示的兩條帶分子量分別為8500Da、10800Da，HPLC分析數(shù)均分子量9800Da，重均分子量10500Da，2個組分均有生物活性。ZL031413528、031371337分別公開了一種改良的心肌肽素及其制備工藝，所述心肌肽素是從不包括人的健康哺乳動物的心臟中提取的多肽，其多肽含量為75％～90％，游離氨基酸為6％～15％，核糖核酸含量小于2％，脫氧核糖核酸含量小于7.5％，重均分子量小于10000道爾頓。優(yōu)選的重均分子量為2000～8000道爾頓，最優(yōu)選的重均分子量為2000～5000道爾頓，該心肌肽素在pH3-8范圍內(nèi)生物活性穩(wěn)定，對蛋白酶K敏感，85℃10min生物活性不改變，在冷凍或凍干條件下穩(wěn)定。等電聚焦電泳顯示2-6條染色帶，優(yōu)選等電聚焦電泳顯示2條帶，其中pI為10.92帶著色較深，所述心肌肽素在紫外吸收光譜190-210nm處有一穩(wěn)定的最大吸收峰，優(yōu)選在紫外吸收光譜200±2nm處有一最大吸收峰，活力至少為2.2。其制備方法為將不包括人的健康哺乳動物的心室肌洗凈、切碎，加滅菌蒸餾水勻漿，勻漿液反復冷凍、解凍3～4次，加熱至65～95℃過濾除渣，用板框濾器過濾得到粗濾液，再用中空纖維柱超濾，得到精濾液，用超濾膜超濾，截留重均分子量小于10000Da的心肌肽素溶液，最后經(jīng)過濾除菌，冷凍干燥得成品。其中滅菌蒸餾水的加入量為哺乳動物的心室肌的0.5～4倍；所述勻漿的轉(zhuǎn)速為1000～5000rpm/min；冷凍為在低于-5℃的溫度下冷凍24～72小時，優(yōu)選的為在-20℃～-30℃下冷凍36～48小時；所述加熱方式為采用隔水加熱或直接加熱，溫度為70～90℃，時間為不超過2小時，優(yōu)選的為采用隔水加熱，溫度為75℃～80℃，時間為不超過1小時。上述心肌肽素與ZL94102798和ZL94102799公開的心肌細胞生長刺激肽(GMGSP)比較，具有明顯高的體外生物活性，其活性單位是心肌細胞生長刺激肽的3-5倍，體內(nèi)藥效對比數(shù)據(jù)顯示，其對心肌缺血-再灌流損傷所致心肌磷酸肌酸激酶釋放及乳酸脫氫酶活性與游離脂肪酸和丙二醛含量具有明顯有利影響。但是，上述產(chǎn)品或方法還存在著如下問題1.所述產(chǎn)品的純度及每一部分的活性不夠確定且沒有一個標準；2.該產(chǎn)品為動物提取物，沒有經(jīng)過滅活，作為藥物或保健品，存在對人體潛在的影響。上述問題的存在使其難以發(fā)展為有實用價值的藥品或保健品。另外，上述問題也是生化產(chǎn)品或用于保護心腦血管的生化制品普遍存在且長期沒有解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個目的在于提供一種生物活性物質(zhì)活力的測定方法，該方法能夠反映心腦血管疾病保健、預防和治療保健品或藥物的生物活性。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種心肌肽素，所述心肌肽素為不包括人的健康哺乳動物的生物活性組分，具有高生物活性和相對確定的組成，其藥效明確而顯著、純度高、穩(wěn)定性好。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種心肌肽素在制備治療或預防心腦血管疾病方面的藥物用途。按照本發(fā)明的第一個目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種生物活性物質(zhì)活力的測定方法，包括如下步驟1)選取不包括人的的健康哺乳動物心臟剪碎成組織小塊，消化、分離細胞、終止消化，如此重復，直至心肌組織塊消化完全，得終止消化液；2)將上述終止消化液過濾、離心分離，棄上清液，沉淀細胞用培養(yǎng)基溶液稀釋、過濾，并調(diào)節(jié)濾液中懸浮細胞濃度，查活細胞比率應＞80％；3)取細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)；4)按照如下步驟測定活力(1)損傷組培養(yǎng)板每孔加相應的損傷特定細胞的藥物溶液，棄該藥物溶液，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)實驗組培養(yǎng)板每孔加藥物溶液損傷細胞，棄去藥物溶液，加入被檢測提取物(供試品溶液)培養(yǎng)；上述實驗各組繼續(xù)培養(yǎng)后，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)5h，小心吸凈MTT溶液，每孔加入二甲亞砜100μl，用振蕩器振蕩20min，以酶標儀測定各孔OD值。按照下述公式計算活力t值t值＝(x1-x2)/[(s12/n1+s22/n2)1/2]式中—實驗組OD平均值；—藥物損傷組OD平均值；s1—實驗組OD值標準差；s2—藥物損傷組OD值標準差；n—n1＝n2＝12上述檢測方法中還包括空白對照組，所述空白對照組的細胞用培養(yǎng)液直接培養(yǎng)。本發(fā)明中以酶標儀測定各孔OD值時的檢測波長為570nm，參考波長630nm。本發(fā)明選取不包括人的的健康哺乳動物包括鼠、豬、牛、羊、兔、馬的心臟，優(yōu)選幼年哺乳動物的心臟，本發(fā)明優(yōu)選取乳鼠的心臟制備心肌細胞懸液，本發(fā)明的方法特別適合由動物器官提取的心腦血管類疾病預防和治療用藥物的活力檢測。一般當n等于12時，t值＞2.074說明實驗組與藥物損傷組有顯著性差異，以乳鼠的心臟制備心肌細胞懸液時，t值＞2.074的受試藥物對受損的心肌細胞的保護和修復具有活性。受試藥物的活力單位的計算方法為活力單位＝含量(mg/支或mg/ml)/供試品溶液濃度(μg/ml)。其中所述消化用胰蛋白酶溶液，消化時首先將組織塊用胰蛋白酶溶液2ml吹打均勻，于37℃水浴中保溫消化1～2min，取出，用吸管反復吹打以分離細胞，靜置1min，取上清液。消化后加入20％小牛血清溶液終止消化。所述濾過優(yōu)選用50-200目篩網(wǎng)，離心濾液分離的條件優(yōu)選為500--8000rpm×1-30min，離心后棄上清液，沉淀細胞用小牛血清溶液稀釋，吹打均勻，用50-200目篩網(wǎng)濾過，并調(diào)節(jié)濾液中懸浮細胞濃度至2×105～5×105個/ml。查活細胞比率可以采用臺盼蘭溶液染色法，優(yōu)選活細胞比率＞90％?；盍y定中，損傷組加阿霉素溶液損傷心肌細胞，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板，加入小牛血清溶液(100μl/孔)培養(yǎng)。優(yōu)選阿霉素溶液加入量為50--200μl/孔，阿霉素損傷心肌細胞的時間優(yōu)選為0.5-5小時。加入小牛血清溶液濃度量優(yōu)選為1-15％，量為50--200μl/孔培養(yǎng)。實驗組加阿霉素溶液損傷心肌細胞，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板，加入供試品溶液培養(yǎng)。優(yōu)選每孔加50--200μl/阿霉素溶液損傷心肌細胞0.5-5小時，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板2次，加入供試品溶液50--200μl/孔培養(yǎng)。上述實驗各組繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-10h，優(yōu)選5小時，小心吸凈MTT溶液，每孔加入二甲亞砜50-200μl，用振蕩器振蕩10-40min，以酶標儀測定各孔OD值，檢測波長570nm，參考波長630nm。計算即得。對于心腦血管類疾病預防和治療用藥，一般t值＞2.2即可以滿足預防和治療的用途。按本發(fā)明的第二的目的要求，本發(fā)明所述的心肌肽素的技術(shù)方案為一種心肌肽素，是從不包括人的健康哺乳動物的心臟中提取的多肽，其溶液的HPLC色譜圖中，至少包括三個吸收峰，按峰面積歸一化法計算，其中峰面積最大的三個主峰按出峰時間順序由小至大其峰面積分別不得小于總峰面積的10％、40％、12％，該三個主峰峰面積之和不得小于總峰面積的75％，小于100％。本發(fā)明的心肌肽素的重均分子量為2000～8000道爾頓，優(yōu)選的重均分子量為2000～5000道爾頓。10％大分子部分重均分子量小于等于7500道爾頓，分子量分布系數(shù)大于1.5小于4.0，優(yōu)選10％大分子部分重均分子量大于3000小于等于7500道爾頓。本發(fā)明的心肌肽素中游離氨基酸總量小于15wt％。本發(fā)明的心肌肽素述不包括人的健康哺乳動物包括豬、牛、羊、兔、馬；優(yōu)選幼年哺乳動物，包括乳豬、乳牛、乳羊、乳兔、乳馬，最優(yōu)選為乳豬。所述心肌肽素在紫外-可見分光光度法測定200±3nm處有最大吸收峰。本發(fā)明的心肌肽素活性值至少為2.2，活力單位為1025～1250。本發(fā)明提供一種心肌肽素的制備方法為將不包括人的健康哺乳動物的心室肌洗凈、切碎勻漿、過濾提取截留重均分子量為2000～8000道爾頓的心肌肽素溶液，優(yōu)選截留重均分子量為2000～5000道爾頓，將所述心肌肽素溶液60-85℃下滅活10-120分鐘。優(yōu)選滅活在水浴下進行，優(yōu)選滅活條件為75--85℃攪拌30-120分鐘，更優(yōu)選80℃±2℃攪拌60分鐘。本發(fā)明提供一種生化物質(zhì)滅活方法，特別是生化提取物的滅活方法，該方法包括取動物的器官或組織，提取其中的生物活性組分，將體取的活性成分的溶液在60-85℃下加熱10-120分鐘，優(yōu)選75-85℃下加熱20-80分鐘。滅活后的溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌。本發(fā)明所述的取動物器官或組織中的生物活性組分可以采用現(xiàn)有技術(shù)中通常采用的方法。生物提取物的生物安全的一項重要的工作是工藝的病毒滅活。病毒滅活一般是兩個方面來源的病毒，一是原料來源(如乳豬酮體攜帶)的病毒，二是在運輸、屠宰、加工、生產(chǎn)制備過程中污染的病毒。由于提取所用很多動物是人類馴化和飼養(yǎng)了幾千年的家畜，長期的生物演化，在其身上存在許多人畜共患的疾病，特別是病毒類的疾病。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)部1999年2月12日發(fā)布的第96號公告，公布的一、二、三類動物疫病病種名錄，有關(guān)的一類動物疫病為口蹄疫、豬水泡病、豬瘟、非洲豬瘟。二類的為偽狂犬病、豬乙型腦炎、豬細小病毒病。人畜共患的病毒有許多種類如口蹄疫病毒FMD，用巴斯德消毒法，可滅活病毒?，F(xiàn)在一些上市藥物，如豬抗人T淋巴細胞免疫球蛋白，凝血酶，肝素鈉，促肝細胞生長素等等，都是豬源性的藥物，采用了不同的病毒滅活工藝。但是巴斯德消毒法嚴重影響動物提取物的生物活性。本發(fā)明在病毒工藝滅活的研究發(fā)現(xiàn)(1)在75℃-80℃，30分鐘即可失去活性，因此我們在制備工藝上采用此法。(2)一般病毒的分子量比較大，在幾萬-幾十萬以上，我們在最后用截留分子量1.5萬以下的Milipore膜過濾，亦可有效的去除病毒。由于“血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗證指導原則”文件規(guī)定，膜過濾法只有在濾膜的孔徑比病毒有效直徑小時才能有效的除去病毒，不能作為單獨的去除病毒的方法使用，因此只作為輔助的方法使用。本發(fā)明人經(jīng)過長期反復實驗發(fā)現(xiàn)常見的一些病毒及其滅活情況如下豬口蹄疫病毒(FMDVs)屬小RNA病毒科，口皰病毒屬。病毒呈16面體立體對稱，粒子直徑很小約20~25nm，無囊膜，對酸敏感，pH7.0以下不穩(wěn)定。單股RNA，有4種結(jié)構(gòu)蛋白及一組具活性的非結(jié)構(gòu)蛋白，有七個血清主型，分子量約13.5~30KD，對熱不穩(wěn)定，在酸堿條件下易滅活。豬瘟病毒(classicalswinefevervirus)，屬黃病毒科瘟病毒屬。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列入A類16種法定傳染病之一。CSFV是一小的有囊膜病毒，其基因組為單股正鏈RNA，總長約12.3kb，含有單一的開放閱讀框(ORF)，編碼為一個由約4000個氨基酸殘基組成的多聚蛋白。推算分子量約為438KD。病毒粒子呈球狀，核衣殼為20面立方對稱，直徑38n。病毒對外界環(huán)境適應力低，在自然干燥的情況下，病毒易死亡，2％氫氧化鈉、5％-10％的漂白粉、3％來蘇能很快將其滅活。水浴加熱60~70℃1小時失去活性。非洲豬瘟病毒(ASF)，60℃，30分鐘即失活，分子量約170-190KD。豬腦心肌炎病毒(EMCN)分子量約2600KD，60℃，30分鐘可失去活性。豬日本乙型腦炎病毒(JEV)屬于披膜病毒科，黃病毒屬。病毒呈球囊狀，有囊膜，具有20面體核衣殼的單股RNA病毒。乙腦病毒對外界環(huán)境抵抗力不大，56℃，5分鐘可失去活性。豬細小病毒(PorcineParvovirusPPV)屬細小病毒科，細小病毒屬，核酸為單股DNA，直徑為18~26nm，分子量約5300KD。對熱和酸均穩(wěn)定，對外部環(huán)境抵抗力強，干熱65℃，2小時不能完全將其殺滅，在80℃，5分鐘可滅活。豬偽狂犬病毒(PerudorabiesvirusPRV)屬于豬皰疹病毒I型，是家畜和野生動物偽狂犬病的病原體，對豬的危害性最大。PRV的基因是雙線形DNA，分子量約150KD。病毒對低溫、干燥的環(huán)境存活力較強，對熱敏感，56℃，5分鐘或100℃，1分鐘可使病毒完全滅活。豬呼吸冠狀病毒(PRCV)，七種冠狀病毒平均分子量約170~220KD。豬流感病毒(SIV)屬正粘病毒科，A型流感病毒屬。病毒粒子多型態(tài)，多數(shù)呈球狀，直徑為80-120nm。具有囊膜，由雙層類脂膜、糖蛋白突起和基脂蛋白組成。囊膜表面有許多防射狀排列的突起，即纖突和刺突，其長度為12-14nm。病毒粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋對稱，直徑為10nm。兩端具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，存在于病毒的囊膜內(nèi)。SIV和其他有囊膜的病毒相似，對乙醚、丙酮等有機溶劑敏感，60℃，20min可使病毒完全喪失活性。豬水皰病病毒(水泡痘)屬微RNA病毒科，水皰病毒屬16面體立體對稱，粒子直徑20~25nm，無囊膜，單股RNA，有七個血清主型，在酸堿條件下易滅活。Sindbisvirus(新必斯病毒)披膜病毒科甲病毒屬。病毒呈球狀，直徑為40-80mm，由核衣殼包裹一正鏈單股RNA，分子量約4300KD，不耐熱，對乙醚，去氧膽鹽和酸均敏感。本發(fā)明的方法，可以將上述所有病毒以及動物的其他常見病毒滅活，同時保證提取物的生物活性。本發(fā)明的方法特別適合于本發(fā)明所述的心肌肽素的滅活。所述的制備工藝還包括滅活后溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌。所述的制備工藝還包括過濾除菌后進行冷凍干燥得成品。所述制備方法中，心室肌的制備包括將豬心去除包膜、血管、心臟瓣膜、肌腱及心房，將心室肌以蒸餾水清洗干凈后切碎成約1cm3的小塊，再用冷注射用水清洗一次。所述制備方法中勻漿液的制備包括按心室肌∶注射用水＝1∶1(質(zhì)量比)比例投料，用膠體磨重復勻漿三次(1000-10000rpm/min離心，每次5分鐘，間隔5分鐘)，得勻漿液。勻漿液盛于不銹鋼桶中，每桶裝量不超過5000ml，-20℃凍存。此項操作應在10萬級層流條件下進行，溫度16℃～18℃，濕度50％～60％。質(zhì)控標準手指研磨應光滑，無顆粒感，光學顯微鏡下觀察無完整細胞。所述過濾包括粗濾、精濾和超濾。本發(fā)明用板框濾器過濾得到粗濾液，用中空纖維柱超濾后得到分子量小于12kDa的精濾液；再用超濾膜超濾截流得到分子量小于10kDa的精濾液。所述制備方法中，粗濾液的制備包括將凍存≥24小時的勻漿液流水融解后，置75℃水浴中恒溫10分鐘，用紗布過濾除渣，收集濾液，再用5μm板框濾器過濾一次，得粗濾液。此項操作應在10萬級層流條件下進行，溫度16℃～18℃，濕度50％～60％。質(zhì)控標準溶液應澄清、透明，顯微紅色。所述制備方法中，精濾液的制備包括將粗濾液經(jīng)三柱串聯(lián)的中空纖維柱，正壓過濾三次(截留分子量≤12KD，蠕動泵壓力0.2MPa，透過液流速5±3ml/min)，初始液50ml棄去，得精濾液。操作條件此項操作應在10萬級層流條件下進行，溫度16℃～18℃，濕度50％～60％，3小時內(nèi)完成。所述制備方法中，超濾液的制備包括將精濾液再用密濾膜超濾、截留(超濾分子量＜10KD，截留分子量＜1KD，壓力1.5～2.0MPa，透過液流速應500ml±30ml/min)，得超濾液。操作條件此項操作應在1萬級層流條件下進行，16℃～18℃，濕度50％～60％。所述心肌肽素滅活后，取Vml心肌肽素溶液(相當于多肽20克)及120克甘露醇，加水溶解并攪拌均勻，使成4000ml(多肽含量為5.0mg/ml)，可根據(jù)生產(chǎn)需要按上述比例放大；用蔡氏濾器加混合纖維素酯微孔濾膜(0.22μm)負壓過濾除菌，經(jīng)灌裝、冷凍干燥可以制成藥學上可接受的凍干粉針?？筛鶕?jù)生產(chǎn)需要按上述比例發(fā)放大。所述心肌肽素是從不包括人的健康哺乳動物的心臟中提取的多肽，其溶液的HPLC色譜圖中，至少包括三個吸收峰，按峰面積歸一化法計算，其中峰面積最大的三個主峰按出峰時間順序由小至大其峰面積分別不得小于總峰面積的10％、40％、12％，該三個主峰峰面積之和不得小于總峰面積的75％，小于100％。本發(fā)明的心肌肽素的重均分子量為2000～8000道爾頓，優(yōu)選的重均分子量為2000～5000道爾頓。10％大分子部分重均分子量小于等于7500道爾頓，分子量分布系數(shù)大于1.5小于4.0，優(yōu)選10％大分子部分重均分子量大于3000小于等于7500道爾頓。本發(fā)明的心肌肽素中游離氨基酸總量小于15wt％。本發(fā)明的心肌肽素述不包括人的健康哺乳動物包括豬、牛、羊、兔、馬；優(yōu)選幼年哺乳動物，包括乳豬、乳牛、乳羊、乳兔、乳馬，最優(yōu)選為乳豬。所述心肌肽素在紫外-可見分光光度法測定200±3nm處有最大吸收峰。本發(fā)明的心肌肽素活性值至少為2.2，活力單位為1025～1250。采用上述制備方法，經(jīng)板框濾器過濾、中空纖維柱超濾和超濾膜超濾的過濾方式，可得到本發(fā)明所述的重均分子量為2000～8000道爾頓的心肌肽素，與
背景技術(shù)：
中ZL94102798相比，工作時間短，產(chǎn)品的處理量多，得到產(chǎn)品的濃度高，活性大，不易產(chǎn)生熱原。采用本發(fā)明的制備方法所得心肌肽素與專利ZL94102798和ZL94102799公開的心肌細胞生長刺激肽(GMGSP)比較，具有明顯高的體外生物活性，本發(fā)明所述心肌肽素活性單位是心肌細胞生長刺激肽的3-5倍，體內(nèi)藥效對比數(shù)據(jù)顯示，其對心肌缺血-再灌流損傷所致心肌磷酸肌酸激酶釋放及乳酸脫氫酶活性與游離脂肪酸和丙二醛含量具有明顯有利影響。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種心肌肽素在制備治療或預防心腦血管疾病藥物方面上的用途，具體的是對于急慢性冠心病心絞痛、心肌梗塞、心律失常及其它缺血性心臟疾病、心肌炎、風濕性心臟病均有良好的預防和治療效果(見實施例10、實施例11、實施例12)；還可以為適應于心血管外科圍術(shù)期的心肌保護(見實施例13)。圖1是心肌肽素組(n＝442)和GIK組(n＝215)圍術(shù)期CK變化值(PP分析集)。圖2是心肌肽素組(n＝442)和GIK組(n＝215)圍術(shù)期CK變化率(PP分析集)。圖3是心肌肽素組(n＝442)和GIK組(n＝215)圍術(shù)期CK-MB變化值(PP分析集)圖4是心肌肽素組(n＝442)和GIK組(n＝215)圍術(shù)期CK-MB變化率(PP分析集)圖5是心肌肽素組(n＝442)和GIK組(n＝215)圍術(shù)期LDH變化值(PP分析集)圖6是心肌肽素組(n＝442)和GIK組(n＝215)圍術(shù)期LDH變化率(PP分析集)圖7是心肌肽素組(n＝319)和GIK組(n＝174)圍術(shù)期TnT變化值(PP分析集)圖8是心肌肽素組(n＝319)和GIK組(n＝174)圍術(shù)期TnT變化率(PP分析集)圖9是心肌肽素組(n＝123)和GIK組(n＝41)圍術(shù)期TnI變化值(PP分析集)圖10是心肌肽素組(n＝123)和GIK組(n＝41)圍術(shù)期TnI變化率(PP分析集)圖11是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)CK變化值(PP分析集)圖12是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)CK變化率(PP分析集)圖13是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)CK-MB變化值圖14是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)CK-MB變化率圖15是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)LDH變化值圖16是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)LDH變化率圖17是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)TnT變化值圖18是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝338)和GIK組(n＝113)TnT變化率圖19是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝123)和GIK組(n＝41)TnI變化值圖20是瓣膜置換病人心肌肽素組(n＝123)和GIK組(n＝41)TnI變化率圖21是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)CK變化值圖22是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)CK變化率圖23是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)CK-MB變化值圖25是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)LDH變化值圖26是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)LDH變化率圖27是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)TnT變化值圖28是冠脈搭橋病人心肌肽素組(n＝104)和GIK組(n＝102)TnT變化率圖29為本發(fā)明實施例1得到的心肌肽素的HPLC30是心肌肽素加法滅活PRV效果動力學曲線圖31是心肌肽素加熱法處理滅活偽狂犬病毒(PVR)結(jié)果圖32是75-80℃、1小時滅活Sindbis病毒效果動力學曲線圖1-28全部為PP分析集具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實施例1心肌肽素溶液的制備心肌肽素溶液系從健康幼齡豬心室肌中提取的具有活性的小分子多肽溶液。一、原料(豬心)質(zhì)量控制選廣東、廣西、湖南等地雜種豬，生豬出生后30天±6天，體重＜10公斤，心臟重量35g±5g，統(tǒng)一飼養(yǎng)場地，統(tǒng)一配飼料，統(tǒng)一飼養(yǎng)時間，統(tǒng)一收購。應提供《動物產(chǎn)地檢疫合格證明》或《出縣境動物檢疫合格證明》、《動物、動物產(chǎn)品運載工具消毒證明》和《非疫區(qū)證明》。生豬宰殺前后，按《生豬屠宰廠(場)的檢疫操作規(guī)程》由國家正規(guī)防疫檢疫站進行生豬宰殺前后檢疫。生豬活殺后取心臟，并在低溫條件下運輸，豬心表面應光潔，無結(jié)節(jié)，色澤新鮮，心臟剖面無異常。1％隨機抽檢豬心的組織學結(jié)構(gòu)，進行心房、心室切片，連續(xù)切片各5張，光學顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)應無異常。依法檢查揮發(fā)性鹽基氮(國家標準GB/T5009.44-2003)，應符合規(guī)定。二、制備1、原料(豬心)的初步處理將豬心去除包膜、血管、心臟瓣膜、肌腱及心房，將心室肌以蒸餾水清洗干凈后切碎成約1cm3的小塊，再用冷注射用水清洗一次。2、勻漿液的制備按心室肌∶注射用水＝1∶1(質(zhì)量比)比例投料，膠體磨重復勻漿三次(3000rpm/min離心，每次5分鐘，間隔5分鐘)，得勻漿液。勻漿液盛于不銹鋼桶中，每桶裝量不超過5000ml，-20℃凍存。質(zhì)控標準手指研磨應光滑，無顆粒感，光學顯微鏡下觀察無完整細胞。3、粗濾液的制備將凍存24小時的勻漿液解凍后，置75℃水浴中恒溫10分鐘，用紗布過濾除渣，收集濾液，再用5μm板框濾器過濾一次，得粗濾液。質(zhì)控標準溶液應澄清、透明，顯微紅色。4、精濾液的制備將粗濾液過三柱串聯(lián)的中空纖維柱，正壓過濾三次(截留分子量≤12KD，蠕動泵壓力0.2MPa，透過液流速5±3ml/min，初始液50ml棄去)，得精濾液。質(zhì)控標準溶液應澄清透明，顯微黃色；pH值6.4±0.2；蛋白質(zhì)檢查應呈陰性(按注射用心肌肽質(zhì)量標準中的蛋白質(zhì)項下方法進行檢查)。上述1-4項操作應在10萬級層流條件下進行，溫度16℃～18℃，濕度50％～60％，3小時內(nèi)完成。5、超濾液的制備將精濾液過Millipore超濾膜超濾、截留(超濾分子量＜10KD，截留分子量＜1KD，壓力1.5～2.0MPa，透過液流速應500ml±30ml/min)，得超濾液。優(yōu)選操作在1萬級層流條件下進行，16℃～18℃，濕度50％～60％。6、病毒滅活將超濾液置80℃±2℃水浴中攪拌1小時。病毒滅活后溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝于無熱原、無菌不銹鋼桶內(nèi)，裝量≤5000ml/桶，密封，-20℃貯存。優(yōu)選操作在百級層流條件下操作，溫度16℃～18℃，濕度50％～60％。7、要求乳豬豬心離體至加工成勻漿液不應超過6小時；自粗濾始至病毒滅活應連續(xù)操作，總時間控制＜7小時。三、成品檢驗按心肌肽溶液質(zhì)量標準進行全檢，合格后-20℃凍存。所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為90％，游離氨基酸含量5％，核糖核酸含量為1％，脫氧核糖核酸含量為3％，重均分子量為3000道爾頓；分子量分布系數(shù)為3。HPLC分析見圖29及表a。實施例2心肌肽素溶液的制備心肌肽素溶液系從健康幼齡豬心室肌中提取的具有活性的小分子多肽溶液。一、原料(豬心)質(zhì)量控制同實施例1二、制備參照實施例1的方法，其中1、原料(豬心)的初步處理將豬心去除包膜、血管、心臟瓣膜、肌腱及心房，將心室肌以蒸餾水清洗干凈后切碎成約1cm3的小塊，再用冷注射用水清洗一次。2、勻漿液的制備按心室肌∶注射用水＝1∶1(質(zhì)量比)比例投料，膠體磨重復勻漿三次(5000rpm/min離心，每次5分鐘，間隔5分鐘)，得勻漿液。勻漿液盛于不銹鋼桶中，每桶裝量不超過5000ml，-20℃凍存。3、粗濾液的制備將凍存36小時的勻漿液解凍后反復3次，置75℃水浴中恒溫10分鐘，用紗布過濾除渣，收集濾液，再用5μm板框濾器過濾一次，得粗濾液。4、精濾液的制備將粗濾液過三柱串聯(lián)的中空纖維柱，正壓過濾三次(截留分子量≤12KD，蠕動泵壓力0.2MPa，透過液流速5±3ml/min，初始液50ml棄去)，得精濾液。5、超濾液的制備將精濾液過Millipore超濾膜超濾、截留(超濾分子量＜10KD，截留分子量＜1KD，壓力1.5～2.0MPa，透過液流速應500ml±30ml/min)，得超濾液。6、病毒滅活將超濾液置75-85℃水浴中攪拌80分鐘。病毒滅活后溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝于無熱原、無菌不銹鋼桶內(nèi)，裝量≤5000ml/桶，密封，-20℃貯存。三、成品檢驗按心肌肽溶液質(zhì)量標準進行全檢，合格后-20℃凍存。所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為88％，游離氨基酸含量5％，核糖核酸含量為1％，脫氧核糖核酸含量為3％，重均分子量為2000道爾頓；分子量分布系數(shù)為1.5；HPLC分析見表a。實施例3心肌肽素溶液的制備心肌肽素溶液系從健康幼齡豬心室肌中提取的具有活性的小分子多肽溶液。一、原料(豬心)質(zhì)量控制同實施例1二、制備參照實施例1的方法，其中1、原料(豬心)的初步處理將豬心去除包膜、血管、心臟瓣膜、肌腱及心房，將心室肌以蒸餾水清洗干凈后切碎成約1cm3的小塊，再用冷注射用水清洗一次。2、勻漿液的制備按心室肌∶注射用水＝1∶2(質(zhì)量比)比例投料，膠體磨重復勻漿三次(4000rpm/min離心，每次5分鐘，間隔5分鐘)，得勻漿液。勻漿液盛于不銹鋼桶中，每桶裝量不超過5000ml，-20℃凍存。3、粗濾液的制備將凍存30小時的勻漿液解凍后反復3次，置75℃水浴中恒溫10分鐘，用紗布過濾除渣，收集濾液，再用5μm板框濾器過濾一次，得粗濾液。4、精濾液的制備將粗濾液過三柱串聯(lián)的中空纖維柱，正壓過濾三次(截留分子量≤12KD，蠕動泵壓力0.2MPa，透過液流速5±3ml/min，初始液50ml棄去)，得精濾液。5、超濾液的制備將精濾液過Millipore超濾膜超濾、截留(超濾分子量＜10KD，截留分子量＜1KD，壓力1.5～2.0MPa，透過液流速應500ml±30ml/min)，得超濾液。6、病毒滅活將超濾液置65-75℃水浴中攪拌100分鐘。病毒滅活后溶液經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝于無熱原、無菌不銹鋼桶內(nèi)，裝量≤5000ml/桶，密封，-20℃貯存。三、成品檢驗按心肌肽溶液質(zhì)量標準進行全檢，合格后-20℃凍存。所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為85％，游離氨基酸含量8％，核糖核酸含量為2％，脫氧核糖核酸含量為6％，重均分子量為4000道爾頓；分子量分布系數(shù)為2，HPLC分析見表a。實施例4同實施例1，不同的是原料采用健康乳牛心室肌，截留重均分子量為5000道爾頓的心肌肽素溶液，所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為78％，游離氨基酸含量15％，核糖核酸含量為2％，脫氧核糖核酸含量為5％，重均分子量為5000道爾頓；分子量分布系數(shù)為2HPLC分析見表a。實施例5同實施例1，不同的是原料采用健康乳兔心室肌，截留重均分子量為4000道爾頓的心肌肽素溶液，所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為84％，游離氨基酸含量6％，核糖核酸含量為2％，脫氧核糖核酸含量為6％，重均分子量為4000道爾頓；分子量分布系數(shù)為3.5HPLC分析見表a。實施例6同實施例1，不同的是原料采用健康乳馬心室肌，截留重均分子量為5000道爾頓的心肌肽素溶液，所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為80％，游離氨基酸含量12％，核糖核酸含量為2％，脫氧核糖核酸含量為5％，重均分子量為6000道爾頓；分子量分布系數(shù)為2.5；HPLC分析見表a。實施例7同實施例3，不同的是原料采用健康乳牛心室肌，截留重均分子量為8000道爾頓的心肌肽素溶液，所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為82％，游離氨基酸含量11％，核糖核酸含量為2％，脫氧核糖核酸含量為5％，重均分子量為8000道爾頓；分子量分布系數(shù)為2.2。HPLC分析見表a。實施例8同實施例2，不同的是原料采用健康乳牛心室肌，截留重均分子量為5000道爾頓的心肌肽素溶液，所述心肌肽素經(jīng)分析，多肽含量為80％，游離氨基酸含量14％，核糖核酸含量為2％，脫氧核糖核酸含量為5％，重均分子量為5000道爾頓；分子量分布系數(shù)為2.9；HPLC分析見表a。表a各主峰相對百分峰面積百分面積％實施例9本實施例涉及滅活實驗3.材料3.1心肌肽素(本發(fā)明實施例1，實施例2，實施例3)3.2三種病毒的來源及生物學和理化特性3.2.1受試病毒3.2.1.1豬細小病毒(PPV，TCID50＞105/0r1ml)，PPV株來自中國獸藥監(jiān)察所，由本實驗室傳后代保存。豬細小病毒(PigParvovirus，PPV)屬細小病毒科，細小病毒屬，核酸為單股DNA，直徑為18-26nm，分子量約5、3×108D。豬是唯一已知的易感動物。對熱和酸均穩(wěn)定，對環(huán)境抵抗力極強，70℃2小時仍不能將其殺滅，在80℃5分鐘才能將其殺滅。3.2.1.2豬偽狂犬病病毒(PPV，CID50＞106/ml)，PPV株來自廣東一發(fā)病豬場分離并鑒定的，毒種保存于華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病學教研室。偽狂犬病毒(pesudorabiesvirus，PRV)屬于豬皰疹病毒I型，是家畜和野生動物偽狂犬病的病原體，尤以對豬的危害性最大，PRV的基因是雙股線性DNA，大小約150kb。病毒對低溫、干燥的抵抗力較強，對熱敏感，56℃5分鐘或100℃1分鐘可使病毒完全滅活。3.2.1.3豬瘟病毒(HCV)，豬瘟弱毒來自中國獸藥監(jiān)察所，由本實驗室傳后代保存。豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV或稱HogCholeraVerus，HCV)屬黃病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒屬(pestivirus).為有包膜的正鏈RNA病毒。直徑為40-60nm。CSFV是一小的有囊膜病毒，其基因組為單股正鏈RNA，總長約12、3kb，分子量約438KD，強毒力的CSFV導致的急性豬瘟引起高熱、大量內(nèi)出血，致死率幾乎是100％。豬瘟病毒對熱抵抗力不強，76℃1小時可使病毒失去感染力，在干燥條件下，病毒容易死亡。豬瘟弱毒可引起兔體的定型熱反應。3.2.2動物細胞的選擇3.2.2.1主腎細胞(PK15)、細胞株來源于廣州進出口檢驗檢疫局中心實驗室。細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)。3.2.2.2猴腎細胞(Vero)和狗腎細胞(MDCK)細胞株，來源于廣州進出口檢驗檢疫局中心實驗室。細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)。3.2.3細胞培養(yǎng)液及細胞培養(yǎng)板DMEM細胞培養(yǎng)液(sigma)，3％FBS(國產(chǎn)，杭州四季青公司)，24孔細胞培養(yǎng)板(Costar)。4.方法4.1觀察加熱對心肌肽素生物學活性的影響。包括加熱溫度的選擇、心肌肽素制劑生物學活性檢測方法以及結(jié)果判定。4.2觀察加熱心肌肽素生產(chǎn)工藝對三種動物源性病毒的滅活作用。包括各實施例心肌肽素原料中三種動物源性病毒的檢測、加熱對三種動物源性病毒的影響、溫度選擇(同4.1的方法)。主要是為了研究影響去除/滅活病毒效果的參數(shù)(包括機械參數(shù)和理化參數(shù))和允許變化的幅度。檢測三個心肌肽素原料。4.2.1指示病毒選擇豬細小病毒，毒株病滴度測定應≥105，才進行下一步實驗；豬偽狂犬病毒，毒株病滴度測定應≥105，才進行下一步實驗；豬瘟病毒，毒株病滴度測定應≥105，才進行下一步實驗。4.2.2細胞培養(yǎng)及接毒條件按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法，用DMEM培養(yǎng)液加10％無牛病毒性腹瀉病毒抗體的胎牛血清作為PK細胞的培養(yǎng)液(ph7.2)；DMEM培養(yǎng)液加20％的胎牛血清作為PK15細胞培養(yǎng)液(ph7.2)。待細胞接近長滿單層時接毒，于37℃感染1h后，經(jīng)Hands洗滌，加維持液(phwei7.6-7.8)培養(yǎng)，維持掖含2％-4％的胎牛血清。4.2.3病毒滴度測定方法毒株經(jīng)雙抗處理，分別做101、102、103、101、105……109倍稀釋，按常規(guī)方法接種于敏感細胞。培養(yǎng)3-6天并觀察CPE(包括細胞變圓、細胞核固縮和細胞溶解)，按照Reech-Mud的方法測定病毒的半數(shù)組織感染量(TCI50)。4.2.4研究病毒滅活動力學，包括病毒滅活速率和滅活曲線。4.2.4.1病毒滅活速率的測定，加入的病毒與待驗證樣品體積比不能高于1∶9。三種恒溫溫度對病毒滅活速率的影響，實驗中應考慮應試品在溫度上升過程多耗費的時間。升溫后時間點的選擇2，5，8，10，20，30，45，60分鐘。如可能，驗證過程中每步取出的樣品應盡快直接進行病毒滴定，不做進一步處理。4.2.4.2檢測方法檢測方法可包括蝕斑形成、細胞病變(如合胞體或灶形成)、終點滴定或其他方法。這些方法應該有適宜的靈敏度和可重復性，每一個取樣點取3份樣品并沒有對照以保證結(jié)果的準確性。4.2.4.3豬瘟病毒的滅活檢測試驗，現(xiàn)用30只家兔測定豬瘟病毒毒種的最小敏感量RID50。A組處理前的樣品。樣品中加入豬瘟病毒，終濃度為每毫升500RID50(兔體反應量。)收集樣品。B組處理后的樣品。樣品中加入豬瘟病毒，終濃度為每毫升500RID50(兔體反應量)，經(jīng)加工工藝(加熱)處理后，收集樣品。將收集的A、B兩組樣品用雙抗處理，每個樣品肌肉注射接種家兔3只，每只2ml(共1000RID50)，連續(xù)測量體溫并觀察3天。記錄定型熱的出現(xiàn)。C組為對照組。取家兔3只，接種生理鹽水，記錄定型熱的出現(xiàn)。4.2.4.4觀察指標4.2.4.4.1病毒方面(1)去除/滅活病毒滴度經(jīng)滅活后樣品的TCID50大于或等于4個滴度，說明病毒滅活完全。例如未經(jīng)滅活的樣品接種細胞出現(xiàn)CPE的最大稀釋度為106，那么如果該樣品滅活后再接種細胞，這時測出來的能出現(xiàn)CPE的最大稀釋度為102或更小，我們就可以判定該樣品的滅活有效。(2)滅活病毒速率、滅活曲線、以列表和做圖形式報告嚴驗證結(jié)果。(3)豬瘟病毒的滅活檢測試驗滅活完全A組出現(xiàn)定型熱反應、B組和C組沒有定型熱反應。滅活未完全A組、B組出現(xiàn)定型熱反應、C組沒有定型熱反應。附根據(jù)兔的體溫變化情況，按如下標準判定結(jié)果。①定型熱潛伏期24-48h，體溫上升呈明顯曲線，超過常溫1℃以上至少3個溫次，并稽留18-36h；②輕熱反應潛伏期24-72h，體溫上升有一定去，超過常溫0.5℃以上至少2個溫次，并稽留12-36h；③可疑反應潛伏期不到24h，或者72h以上，體溫曲線起伏不定或稽留不到12h或稽留超過36h而不下降。④無變化，體溫正常。4.2.5病毒去除/滅活各參數(shù)允許變化范圍4.2.6心肌肽素生物學活性方面4.2.7效果的判定判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來確定。在確定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評價每次驗證結(jié)果。驗證試驗所選擇的病毒是否適宜，病毒驗證的設計是否合理。病毒降低量(log10)≥4logs，表示該步驟去除/滅活病毒有效。如因檢測方法造成病毒降低量＜4logs時，應盲傳三代，如無病毒檢出，可認定是有效的滅活病毒方法。病毒滅活動力學可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡單的一級反應。往往是起始反應速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時間明顯降低，表示該方法可能無效，或者殘留的指示病毒對該滅活方法有抵抗力，說明該步病毒滅活方法無效。病毒的實際滴度為基礎病毒，指示病毒與樣品1∶9的比例混勻后零點取樣的病毒滴度，通過與經(jīng)去除/滅活病毒后的測定的實際病毒殘留量的比較，作為該病毒去除/滅活方法(步驟)實際的滅活病毒的量。病毒檢測敏感度的限值。4.2.8生產(chǎn)工藝去除/滅活能力的驗證4.2.9去除/滅活病毒方法的再驗證5.結(jié)果(病毒去除/滅活方法驗證結(jié)果)經(jīng)中國藥品生物制品檢定所鑒定，結(jié)果如下心肌肽素加熱法滅活偽狂犬病毒(PRV)效果驗證報告一、驗證目的根據(jù)本發(fā)明的病毒滅活工藝，驗證加熱法(水浴75-80℃；1小時)對所選指示病毒PRV的滅活效果。二、驗證樣品樣品為本發(fā)明實施例中加熱法處理之前一步，于-20℃保存。三、指示病毒及其培養(yǎng)偽狂犬病毒(PRV)滴度8.88LgTCHID50/ml，-70℃保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)用細胞PK-15細胞滴定方法96孔細胞病變法四、病毒滅活驗證步驟1.樣品于20-25℃水浴解凍，完全融化后充分混懸，除菌過濾。2.取樣(1)三批樣品(實施例1，實施例2，實施例3)各取36ml，分別加入4mlPRV液(9∶1)，混勻。(2)將樣品-素混合液分裝于小離心管，每管1.2ml。留取零時樣本。其余進行76.2-76.4℃恒溫水浴加熱處理，分別于5分、15分、30分、1小時取樣。各樣本取出后立刻于-70℃凍存?zhèn)錅y。每批樣本須至少重復測定二次。五、病毒滴定方法96孔細胞病變法，計算按Karber法。六、驗證結(jié)果(詳見表b、圖30)三批樣品進行加熱(水浴75-80℃；1小時)病毒滅活后，殘余PRV滴度均低于本試驗最低檢測限(0.50LgTCID50/0.1ml)?？蓽缁钏尤胫甘静RV分別為實施例1/6.62LgTCID50/0.1ml；實施例2/6.50LgTCID50/0.1ml，實施例3/6.38LgTCID50/0.1ml。采用類似方法檢查實施例4-8的產(chǎn)品，結(jié)果基本相同。注射用心肌肽素加熱法滅豬細小病毒(PPV)效果驗證報告一驗證目的根據(jù)本發(fā)明的病毒滅活工藝，驗證加熱法(75-80℃、1小時)滅活PPV病毒效果。二驗證用樣品樣品為本發(fā)明實施例中加熱法處理之前一步，-20℃保存。三指示病毒及細胞培養(yǎng)指示病毒PPV病毒，滴度7.13LgTCID50/0.1ml，培養(yǎng)細胞PK-15細胞，滴定方法96孔盤微量細胞病變法。四滅活病毒步驟1各取三批樣品(實施例1，實施例2，實施例3)25℃水浴融化后用0.22um濾器除菌過濾。2取三批樣品27ml，分別加入3mlPPV病毒，混均。分裝置尖離管中，每管1.2ml，每取樣點4管。放入76.0-76.5℃水浴。于0.5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘。取樣置-70℃凍存。3留存部分病毒對照。五病毒檢測方法采用96孔盤微量細胞病變法。六病毒滴度結(jié)果見c、圖31。七結(jié)果三批樣品入指示病毒PPV后經(jīng)76.0-76.5℃、1小時處理，可滅活該病毒滴度為實施例1≥5.38LgTCID50/0.1ml實施例2≥5.25LgTCID50/0.1ml實施例3≥5.50LgTCID50/0.1ml。采用類似方法檢查實施例4-8的產(chǎn)品，結(jié)果基本相同。注射用心肌肽素加熱法滅活Sindbis病毒效果驗證報告一驗證目的根據(jù)本發(fā)明的病毒滅活工藝，驗證加熱法(75-80℃、1小時)滅活Sindbis病毒效果。二驗證用樣品送驗樣品-20℃保存。三指示病毒及細胞培養(yǎng)指示病毒Sindbis病毒，滴度7.48LgPFU/ml，培養(yǎng)細胞BHK-21細胞，滴定方法6孔盤蝕斑法。四滅活病毒步驟1各取三批樣品(實施例1，實施例2，實施例3)25℃水浴融化后用0.22um濾器除菌過濾。2各取三批樣品27ml，分別加入3mlSindbis病毒，混均。分裝置尖離管中，每管1.2ml，每取樣點4管。放入76.0-76.5℃水浴。于0、5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘。取樣置-70℃凍存。3留存部分病毒對照。五病毒檢測方法采用6孔盤蝕斑法。六病毒滴度結(jié)果見表d、圖32。七結(jié)果三批樣品加入指示病毒Sindbis后經(jīng)76.0-76.5℃、1小時處理，可滅活該病毒滴度為實施例1≥6.10LgPFU/ml實施例2≥6.12LgPFU/ml實施例3≥6.08LgPFU/ml加熱法滅活病毒效果驗證，該方法屬有效滅活病毒的方法。采用類似方法檢查實施例4-8的產(chǎn)品，結(jié)果基本相同。實施例10-1生化提取物活性檢測方法一、試劑配制1、D-Hank’s的配制稱取氯化鈉8.00g、氯化鉀0.40g、磷酸氫二鈉一水0.006g、碳酸氫鈉0.35g，加水溶解并稀釋至1000ml。2、PBS液的配制稱取氯化鈉8.00g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉一水1.56g、磷酸二氫鉀0.20g，加水溶解并稀釋至1000ml。3、培養(yǎng)基溶液稱取DMEM培養(yǎng)基適量，加重蒸餾水制成10mg/ml的溶液(用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)使其pH值為7.2~7.4)，過濾除菌，凍存待用。4、MTT溶液稱取3-(4，5-二甲噻唑)-2，4-二苯基溴化四唑(MTT)適量，用PBS制成1.5mg/ml的溶液(用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)使其pH值為7.2)，過濾除菌后分裝凍存。使用時用培養(yǎng)基或PBS溶液按1∶10稀釋使用。5、胰蛋白酶溶液稱取胰蛋白酶適量，加D-Hanks液(無酚紅)制成0.125％的溶液(用7.5％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)使其pH值為8.0)，過濾除菌，凍存。6、小牛血清溶液臨用前，取滅活后小牛血清適量，用培養(yǎng)基溶液分別制成含20％和5％小牛血清的培養(yǎng)基溶液，待用。7、阿霉素溶液稱取阿霉素適量，加培養(yǎng)基溶液制成1μg/ml的溶液，過濾除菌，凍存待用。8、臺盼蘭溶液稱取臺盼蘭適量，用PBS制成0.4％的溶液。二、心肌細胞懸液的制備1、環(huán)境條件制取心肌細胞懸液操作室環(huán)境溫度宜控制在25~28℃。2、實驗前準備啟動潔凈工作臺的紫外線燈，滅菌30分鐘。3、心肌細胞懸液的制備(1)啟動潔凈工作臺的風機，自凈15分鐘。(2)取出生3天內(nèi)的SD乳鼠，于潔凈工作臺中用75％酒精消毒，剪開胸壁，取出心臟，將心臟置于無菌紗布上擦凈血跡，再用培養(yǎng)基溶液洗滌心臟，取心室肌，放入10ml玻璃抗生素瓶中，將心室肌剪碎成1mm3以下的組織小塊。(3)將組織塊用胰蛋白酶溶液2ml吹打均勻，于37℃水浴中保溫消化1～2min，取出，用吸管反復吹打以分離細胞，靜置1min，取上清液，加入20％小牛血清溶液終止消化，如此重復，直至心肌組織塊消化完全。(4)將上述終止消化液用100目篩網(wǎng)濾過，濾液1000rpm×10min離心，棄上清液，沉淀細胞用20％小牛血清溶液稀釋，吹打均勻，用100目篩網(wǎng)濾過，并調(diào)節(jié)濾液中懸浮細胞濃度至2×105～5×105個/ml，臺盼蘭溶液染色，查活細胞比率應＞90％。(5)取細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，100μl/孔，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時。三、供試品溶液配制取將被檢測活性的動物提取物----供試品適量，用5％小牛血清溶液溶解并稀釋成20μg/ml，備用。四、測定法棄去細胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)液，用DMEM培養(yǎng)基洗板兩次。實驗分組(1)空白對照組心肌細胞用5％小牛血清溶液(100μl/孔)培養(yǎng)。(2)損傷組(阿霉素損傷)每孔加100μl阿霉素溶液損傷心肌細胞1h，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板2次，加入5％小牛血清溶液(100μl/孔)培養(yǎng)。(3)實驗組每孔加100μl阿霉素溶液損傷心肌細胞1h，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板2次，加入供試品溶液(100μl/孔)培養(yǎng)。上述實驗各組繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)5h，小心吸凈MTT溶液，每孔加入二甲亞砜100μl，用振蕩器振蕩20min，以酶標儀測定各孔OD值，檢測波長570nm，參考波長630nm。計算即得。五、計算公式①活性判斷指標式中—實驗組OD平均值；—阿霉素損傷組OD平均值；s1—實驗組OD值標準差；s2—阿霉素損傷組OD值標準差；n—n1＝n2＝12注當n等于12時，t值＞2.074說明實驗組與阿霉素損傷組有顯著性差異，本品對受損的心肌細胞的保護和修復具有活性。為了保證產(chǎn)品活性，我們規(guī)定本品t值應＞2.2。②活力單位活力單位＝含量(mg/支或mg/ml)/供試品溶液濃度(μg/ml)。表1不同加熱溫度下、不同時間對心肌肽素活性的影響(-M-TT法)(x±s，n＝12)注**與阿霉素組比較，P＜0.01從表1中可以看出，加熱滅活對于阿霉素損傷原代培養(yǎng)心肌細胞琥珀酸脫氫酶活力沒有影響。實施例10冠心病臨床效果經(jīng)心電圖及其它檢查確診后，選擇冠心病患者228例，男147例，女81例；年齡30～75歲，平均(52.2±4.7)歲，隨機分組，如下■用藥組(心肌肽)114例，劑量3mg/kg，給藥方式為靜脈滴注，連續(xù)用藥3天。■對照組(GIK液)114例，劑量及給藥方式同上。連續(xù)用藥3天后對照組/用藥組各項指標變化情況注CK磷酸激酶；CK-MB磷酸激酶-MB；LDH乳酸脫氫酶；LDH-1乳酸脫氫酶-1，TnI肌鈣蛋白I*p＜0.05，**p＜0.01.結(jié)果由上表可見，三個批次的心肌肽在連續(xù)用藥3天后，各項指標較對照組均有所改善，且兩組間差異顯著，有統(tǒng)計學意義；用藥組心功能好轉(zhuǎn)率為50.34％，對照組心功能好轉(zhuǎn)率僅為23.45％。實施例11風濕性心臟病臨床效果經(jīng)臨床檢查確診后，選擇風濕性心臟病患者100例，男67例，女33例；年齡15～55歲，平均(31.14±5.73)歲?！鲇盟幗M(心肌肽)60例，每批次各20例。劑量3mg/kg，給藥方式為靜脈滴注，連續(xù)用藥3天?！鰧φ战M(葛根素)40例，劑量及給藥方式同上。風心病患者用藥組與對照組各項指標變化情況注CK-MB磷酸激酶-MB；LDH-1乳酸脫氫酶-1；TnI肌鈣蛋白I*p＜0.05，**p＜0.01.結(jié)果由上表可見，心肌肽組的各項指標較對照組均有所改善，且兩組間差異顯著，有統(tǒng)計學意義；用藥組心功能好轉(zhuǎn)率為57.5％，對照組心功能好轉(zhuǎn)率僅為30.4％；用藥組的總有效率為92.23％，而對照組總有效率為88.6％。實施例12心肌炎臨床效果選擇經(jīng)實驗室檢查確診心肌炎患者66例，男42例，女24例；年齡16～55歲，平均(35.4±8.1)歲?！鲇盟幗M(心肌肽)48例，每批次各16例。劑量3mg/kg，給藥方式為靜脈滴注，連續(xù)用藥3天。■對照組(1，6-二磷酸果糖)18例，劑量及給藥方式同上。心肌炎患者用藥組與對照組各項指標變化情況注CK-MB磷酸激酶-MB；LDH-1乳酸脫氫酶-1；TnI肌鈣蛋白I；BNP腦鈉肽；LVEDD左心室舒張末期直徑；LVEF左室射血分數(shù)*p＜0.05，**p＜0.01.結(jié)果由上表可見，心肌肽組的各項指標較對照組均有所改善，且兩組間差異顯著，有統(tǒng)計學意義；用藥組的總有效率為81％，而對照組總有效率為78％。實施例13心肌肽素能促進因缺血、缺氧、中毒、變態(tài)反應等所致的心肌細胞損傷的修復，穩(wěn)定細胞膜，增強心肌細胞合成蛋白質(zhì)的能力?？捎糜陟o脈滴注或加入心臟停跳液中。適用于降低心臟手術(shù)心肌的損傷，促進心肌損傷的修復或加入心臟停跳液中作為對心臟手術(shù)的保護手段之一，臨床研究證明了心肌肽素的心肌保護作用。1.適應癥范圍及確定研究對象心肌肽素適應于心血管外科圍術(shù)期的心肌保護。心血管外科手術(shù)中，阻斷心肌血供以便手術(shù)操作為必不可少的步驟，心肌則不可避免地遭受缺血缺氧性打擊和再灌注損傷。最易遭受這些損傷的手術(shù)為心臟瓣膜置換術(shù)和冠狀動脈搭橋術(shù)等手術(shù)。故本試驗選擇瓣膜性心臟病及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者作為研究對象。2.分組方法2.1選擇瓣膜性心臟病患者用藥組330例，陽性對照組110例，共440例。2.2選擇冠狀動脈粥樣硬化心臟病患者用藥組110例，陽性對照組110例，共220例，均在非體外循環(huán)下完成手術(shù)。3.受試藥物按實施例1方法制備的心肌肽素溶液4.對照藥物GIK液，組成成分為10％葡萄糖500ml，胰島素8u，15％氯化鉀10ml5.給藥方案心肌肽素的給藥劑量為3mg/kg/日，GIK每日用量為10％葡萄糖500ml，內(nèi)含15％KCL10ml，胰島素8U。滴注速度1～2ml/min，嚴重心功能不全者液體量減半。6.統(tǒng)計處理6.1分別在術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后對心臟手術(shù)患者的血清心肌酶學、心臟功能、超聲心動圖及各項實驗室檢查、不適癥狀與體征檢查的結(jié)果及安全性評價指標進行分類分析、t檢驗、方差分析或秩和檢驗。6.2比較手術(shù)前后各項實驗室檢查指標和臨床觀察客觀指標。以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有非常顯著性差異。7.試驗步驟麻醉后，靜脈滴注心肌肽素1mg/kg，30分鐘給藥完畢；第1次灌注時在停跳液中一次性加入心肌肽素2mg/kg。術(shù)后1～3日每日靜脈滴注心肌肽素3mg/kg。心肌肽素溶于500ml液體中，滴注速度1～2ml/min，嚴重心功能不全者液體量減半。非體外循環(huán)手術(shù)，麻醉后，靜脈滴注心肌肽素3mg/kg，至手術(shù)結(jié)束，術(shù)后1～3日靜脈滴注心肌肽素3mg/kg。陽性對照組在麻醉、手術(shù)全程中不給心肌肽素，給陽性對照藥GIK液，GIK的用量為10％葡萄糖500ml，內(nèi)含15％KCL10ml，胰島素8U，術(shù)后連用3日。滴注速度1～2ml/min，嚴重心功能不全者液體量減半。手術(shù)全過程其他處理同給藥組。8.主要和次要觀察指標與觀察時間主要觀察指標與觀察時間1、手術(shù)和住院死亡率。統(tǒng)計術(shù)中和術(shù)后的死亡率。2、心功能變化。觀察時間為術(shù)前和術(shù)后5~7天。3、心肌組織形態(tài)學變化由于心肌肽素II期臨床研究中的心肌組織形態(tài)學檢查已明確揭示，體外循環(huán)下在心臟停跳液中給予心肌肽素能明顯減輕瓣膜置換和冠脈搭橋病人的心肌形態(tài)學損傷，本試驗研究僅取自非體外循環(huán)下冠脈搭橋術(shù)患者的心肌組織作心肌形態(tài)學觀察。觀察時間為心包切開心臟暴露后(給藥前)、心肌血運恢復后5~10min(給藥后)。4、心肌酶學和肌鈣蛋白。測定項目為肌酸磷酸肌酶(CK)、肌酸磷酸肌酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、乳酸脫氫酶同工酶(LDH-1)和TnT(TnI)。觀察時間，體外循環(huán)下手術(shù)為升主動脈阻斷前、復灌后6h，24h、48h、72h、5-7天各測定一次。非體外循環(huán)下手術(shù)為心包切開心臟暴露后、心肌血運恢復后6h，24h、48h、72h、5-7天各測定一次。9.安全性觀察指標①對血液動力學的影響是否影響心率(律)和血壓。②有無過敏或類過敏反應過敏性肺水腫、支氣管哮喘、蕁麻疹、皮疹等。③肝、腎功能損害。④術(shù)后惡心嘔吐。10.療效評定標準①與陽性對照藥GIK液比較，不增加或降低手術(shù)和住院死亡率。②與陽性對照藥GIK液比較，能改善術(shù)后病人的心功能。③與陽性對照藥GIK液比較，減少心肌酶和肌鈣蛋白的漏出量。④與陽性對照藥GIK液比較，明顯減輕心肌組織形態(tài)學損傷。11.試驗結(jié)果11.1實際病例數(shù)及分配本試驗入選受試者隨機化人數(shù)669例(瓣膜置換手術(shù)454例．非體外循環(huán)下冠脈搭橋手術(shù)215例)。由于1例瓣膜置換手術(shù)觀察指標參數(shù)缺失，被剔出，試驗觀察病例668例。668例中9例患者因違背試驗方案，不列入統(tǒng)計學處理。1例非體外循環(huán)下冠脈搭橋患者(GIK液對照組)術(shù)后4小時發(fā)生急性心肌梗死，搶救無效死亡；1例先天性心臟病、二尖瓣脫垂患者合并高血壓病史10年，瓣膜置換術(shù)后發(fā)生急性腎功能不全，經(jīng)利尿、透析等治療無效，術(shù)后5日出現(xiàn)多臟器功能衰竭，術(shù)后15日死亡外，實際觀察統(tǒng)計病例657例。657例中瓣膜置換組451例，其中心肌肽素組338例、GIK對照組113例。非體外循環(huán)冠脈搭橋組206例中心肌肽素組104例、GIK對照組102例。受試病例中除2例發(fā)生嚴重不良事件導致死亡外，另有12例發(fā)生一般不良事件。一般不良事件包括心臟瓣膜置換術(shù)和冠脈搭橋術(shù)常見的心力衰竭、心房纖顫、術(shù)后出血、心包填塞、冠脈橋血栓形成、術(shù)中血壓下降、術(shù)后惡心嘔吐、痛風等。兩例嚴重不良事件死亡病例經(jīng)試驗者仔細評述，判斷為與心肌肽素無關(guān)。一般不良事件中的心力衰竭、心房纖顫、術(shù)后出血、心包填塞、冠脈橋血栓形成、術(shù)中血壓下降、術(shù)后痛風等由于原因復雜，干擾因素較多，試驗者難以判斷與心肌肽素有關(guān)。但1例病人術(shù)后出現(xiàn)的惡心嘔吐則可能與心肌肽素有關(guān)。11.2受試者基本情況分析及可比性分析受試入選病例心肌肽素組和GIK組年齡、性別、身高、體重和體重指數(shù)、均數(shù)±標準差()見表1。*P＜0.05兩組術(shù)前心功能分級見表2。**P＜0.01兩組術(shù)前血液學和血生化檢查均數(shù)±標準差()見表3。兩組術(shù)前心電圖檢查均數(shù)±標準差()見表4.從表1-4的術(shù)前檢查結(jié)果可見，心肌肽素組術(shù)前心功能劣于GIK組，心率快于GIK組。心肌肽素組心率偏快與心功能較差相吻合。其它術(shù)前各項檢查結(jié)果兩組具有較好的可比性。11.3主要觀察指標結(jié)果及分析①手術(shù)和住院死亡率入選669例中死亡2例，總死亡率為0.3％，遠遠低于國際上瓣膜置換2％左右的死亡率和冠脈搭橋1.5％～2％的死亡率。死亡病例與心肌肽素無關(guān)。②心功能變化術(shù)前心肌肽素組心功能劣于GIK組(p＝0.0010)，但術(shù)后5～7天心功能檢查兩組無明顯差異，說明心肌肽素較GIK液可明顯改善瓣膜病人和冠心病人的心功能。③心肌組織形態(tài)學變化均取自非體外循環(huán)下冠脈搭橋患者的心肌組織。心肌肽素和GIK液給藥前后兩組心肌病變分值見表5。表5心肌肽素組和GIK組給藥前后心肌病變分值組內(nèi)比較××P＜0.0001，組間比較##P＜0.0001。④心肌酶學和肌鈣蛋白由于心肌肽素組術(shù)前心功能劣于GIK組，心肌酶學和肌鈣蛋白的基礎值心肌肽素組均高于GIK組。具體變化為觀察指標資料完整的657例中，心肌肽素組442例，GIK組215例。由于心肌肽素組術(shù)前心功能分級劣于GIK組，故心肌酶學、肌鈣蛋白和形態(tài)學病變分值在心肌血運阻斷前均高于GIK組(p＜0.05～p＜0.0001)。兩組CK在術(shù)后6小時即明顯升高(p＜0.0001)，24小時達峰值，然后逐漸下降，但直到術(shù)后5～7天仍高于心肌血運阻斷前(p＜0.0001)。各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析表明，各試驗中心的心肌肽素和GIK液對CK變化值的影響的研究結(jié)果無明顯差異(p＝0.1152～0.7738)，即心肌肽素和GIK對CK的影響無明顯差異(p＝0.0539～0.7530)。兩組CK變化率及各中心對CK變化率的影響一致性的協(xié)方差分析結(jié)果類似于CK變化值，見圖1、圖2。CK-MB在心肌肽素組和GIK組的變化完全類似于CK的變化，見圖3、圖4。LDH的變化在心肌肽素組和GIK組類似于CK的變化，即在術(shù)后6小時明顯升高(p＜0.0001)，24小時達峰值。但直至術(shù)后5～7天均持續(xù)在高水平。各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果類似于CK，見圖5、圖6。肌鈣蛋白的測定分兩種，即TnT和TnI。TnT檢測心肌肽素組受試病例數(shù)據(jù)完整者為319例，GIK組為174例；TnI檢測心肌肽素組受試病例數(shù)據(jù)完整者為123例，GIK組為41例。心肌肽素組TnT在心肌血運阻斷前(6.34±12.44)明顯高于GIK組(0.06±0.24)(P＜0.0001)。術(shù)后6小時GIK組TnT明顯升高(P＜0.0001)，并持續(xù)到術(shù)后5～7天。而心肌肽素組術(shù)后6小時TnT較前明顯降低(P＜0.0001)，直至術(shù)后5～7天均顯著低于心肌血運阻斷前水平(P＜0.0001)(圖7)，此可能與心肌血運阻斷前基礎值較高的緣故。TnT在心肌肽素和GIK給藥前后變化值各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析表明，各中心的研究結(jié)果無明顯差異(p＝0.1591～0.6289)，在術(shù)后6、24、48、72小時和5～7天TnT的變化值在心肌肽素組和GIK組之間有明顯差異(p＝0.0118～0.0001)。變化率在各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果類似于變化值(p＝0.0387～0.0010)(圖8)。TnT變化率在心肌肽素組和GIK組之間的差異提示圍術(shù)期使用心肌肽素可使心肌損傷較快得到恢復。心肌肽素組和GIK組TnI在術(shù)后6小時較心肌血運阻斷前明顯升高(P＜0.0001)，并達峰值，然后逐漸下降。TnI在心肌肽素和GIK給藥前后變化值各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析表明，各中心的研究結(jié)果無明顯差異(p＝0.1619～0.8171)，在術(shù)后5～7天心肌肽素組TnI明顯低于GIK組，兩組之間有明顯差異(P＝0.0017)(圖9)。TnI的變化率(圖10)各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果表明，術(shù)后5～7天心肌肽素組和GIK組差異非常顯著(p＝0.0132)。TnI變化值和TnI變化率在心肌肽素組和GIK組之間的差異提示圍術(shù)期使用心肌肽素可使心肌損傷較快得到恢復。11.4.瓣膜置換組和冠脈搭橋組11.4.1瓣膜置換組心肌肽素組和GIK組術(shù)前心功能分級無明顯差異(p＝0.5362)。術(shù)后5～7天的心功能檢查分級兩組均明顯好于術(shù)前(p＜0.0001)，但組間比較無明顯差異(p＝0.8724)。CK在術(shù)后兩組均明顯升高(p＜0.0001)，變化趨勢類似，無明顯差異(p＞0.05)，即術(shù)后24小時達峰值，然后緩慢下降，術(shù)后5～7天仍高于心肌血運阻斷前(p＜0.0001)(圖11)。CK變化率兩組亦呈現(xiàn)類似變化(圖12)。各試驗中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果表明，各試驗中心對心肌肽素和GIK液對CK的影響的研究結(jié)果無明顯差異(p＞0.05)。CK-MB在心肌肽素組和GIK組術(shù)后6小時達峰值，然后緩慢下降，術(shù)后5～7天仍高于術(shù)前(p＜0.0001)(圖13)。CK-MB的其它變化及各試驗中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果類似于CK(圖14)。LDH的變化在心肌肽素組和GIK組完全類似于CK-MB(圖15、16)。各試驗中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果表明，各試驗中心對心肌肽素和GIK液對LDH的影響的研究結(jié)果無明顯差異(p＞0.05)。瓣膜置換組肌鈣蛋白的測定分兩種，即TnT和TnI。瓣膜置換組TnT檢測心肌肽素受試病例數(shù)據(jù)完整者為215例，GIK組為72例；TnI檢測心肌肽素受試病例數(shù)據(jù)完整者為123例，GIK組為41例。心肌肽素組TnT在心肌血運阻斷前(5.26±9.96)明顯高于GIK組(0.13±0.36，P＜0.0001)。術(shù)后6小時GIK組TnT明顯升高(P＜0.0001)，并持續(xù)到術(shù)后5～7天。而心肌肽素組術(shù)后6小時TnT較前明顯降低(P＜0.0001)，直至術(shù)后5～7天均低于心肌血運阻斷前水平(P＜0.0001)(圖17)。TnT的變化率在術(shù)后6、24、48、72小時和5～7天兩組之間均有明顯差異(P＜0.0001)。瓣膜置換組TnT在心肌肽素和GIK給藥前后變化值各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析表明，各中心的研究結(jié)果無明顯差異(P＞0.05)，在術(shù)后6、24、48小時和5～7天心肌肽素組和GIK組之間有明顯差異(P＜0.05)。變化率在各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果類似于變化值(圖18)。其它地區(qū)心肌肽素組和GIK組TnI在術(shù)后6小時較心肌血運阻斷前明顯升高(P＜0.0001)，并達峰值，然后逐漸下降(圖19)。TnI在心肌肽素和GIK給藥前后變化值各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析表明，各中心的研究結(jié)果無明顯差異(P＞0.05)，在術(shù)后5～7天心肌肽素組TnI明顯低于GIK組，兩組之間有明顯差異(P＝0.0017)。TnI的變化率各中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果類似于變化值(圖20)。11.4.2冠脈搭橋手術(shù)組受試者心肌肽素組和GIK對照組基本臨床資料(年齡、性別、身高和體重)組間比較無顯著差異(p＞0.05)。心肌肽素組和GIK組術(shù)前心功能分級無明顯差異(p＝0.3992)。術(shù)后5～7天的心功能檢查分級兩組均明顯好于術(shù)前(p＜0.0001)，但組間比較無明顯差異(p＝0.5192)。CK在心肌血運恢復后兩組均明顯升高(p＜0.0001)，變化趨勢類似，無明顯差異(p＞0.05)，即術(shù)后24小時達峰值，然后緩慢下降，術(shù)后5～7天仍高于心肌血運阻斷前(p＜0.0001)(圖21)。CK變化率兩組亦呈現(xiàn)類似變化(圖22)。各試驗中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果表明，各試驗中心對心肌肽素和GIK液對CK的影響的研究結(jié)果無明顯差異(p＞0.05)。CK-MB的變化類似于CK(圖23、24)。TnT在兩組的變化趨勢相同，組間無明顯差異(p＞0.05)(圖27、28)。各試驗中心結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果表明，各試驗中心對心肌肽素和GIK液對TnT的影響的研究結(jié)果無明顯差異(p＞0.05)。但TnT的變化趨勢即不同于CK、CK-MB、也不同于LDH，即峰值時間在術(shù)后72小時，術(shù)后5～7天明顯下降，但仍高于基礎值(p＜0.0001)。心肌組織形態(tài)學的變化明顯不同于酶學和肌鈣蛋白的變化。用藥前心肌肽素組心肌組織病變分值(1.31±0.72)明顯高于GIK組(0.97±0.61，P＝0.0013)，而用藥后(0.79±0.49)則明顯低于GIK組(1.39±0.72，P＜0.0001)；心肌肽素組和GIK組用藥前后心肌組織病變分值的變化率有明顯差異(p＜0.0001)。各試驗中心對心肌肽素和GIK用藥前后心肌組織病變分值及變化率結(jié)果一致性的協(xié)方差分析結(jié)果表明，各試驗中心對心肌肽素和GIK液對心肌組織形態(tài)學的影響的研究結(jié)果無明顯差異(p＝0.0940～0.2246)，心肌肽素與GIK相比，能明顯減輕心肌組織的形態(tài)學損傷(p＜0.0001)。另心肌肽素組和GIK組用藥前后各組內(nèi)心肌組織病變分值的變化為心肌肽素組用藥后心肌組織病變分值(0.79±0.49)較用藥前(1.31±0.72)顯著降低(P＜0.0001)而GIK組用藥后心肌組織病變分值(1.39±0.72)較用藥前(0.97±0.61)顯著升高(P＜0.0001)(表6)。表6心肌肽素組和GIK組心肌形態(tài)學病變分值()<tablesid="table12"num="012"><tablewidth="769">心肌肽素組1.31±0.720.79±0.49****GIK組0.97±0.611.39±0.72****</table></tables>組內(nèi)比較****p＜0.0001****p＜0.000111.5有效性小結(jié)①從手術(shù)前后心功能變化看，術(shù)前心肌肽素組心功能劣于GIK組(p＝0.0010)，但術(shù)后5～7天心功能檢查兩組之間已無差異，提示心肌肽素對瓣膜置換和冠脈搭橋病人的心肌保護作用優(yōu)于GIK液。②從非體外循環(huán)下冠脈搭橋病人給藥前后心肌組織病變分值看，術(shù)中靜脈滴注心肌肽素對冠脈搭橋病人的心肌保護作用優(yōu)于GIK液。③根據(jù)對肌鈣蛋白TnT(TnI)指標的統(tǒng)計分析，其變化率在心肌肽素組和GIK組之間的差異提示圍術(shù)期使用心肌肽素可使心肌損傷較快得到恢復，證明注射用心肌肽素對心肌損傷有一定的保護作用。11.6安全性分析①入選受試669例中圍術(shù)期死亡2例，均與心肌肽素無關(guān)。②12例發(fā)生一般不良事件。一般不良事件包括心臟瓣膜置換術(shù)和冠脈搭橋術(shù)常見的心力衰竭、心房纖顫、術(shù)后出血、心包填塞、冠脈橋血栓形成、術(shù)中血壓下降、術(shù)后惡心嘔吐、痛風等。一般不良事件中的心力衰竭、心房纖顫、術(shù)后出血、心包填塞、冠脈橋血栓形成、術(shù)中血壓下降、術(shù)后痛風等由于原因復雜，干擾因素較多，難以判斷與心肌肽素有關(guān)。③1例病人術(shù)后出現(xiàn)的惡心嘔吐則可能與心肌肽素有關(guān)。④心肌肽素和GIK液對肝腎功能和血液學的影響見表7。表7兩組術(shù)后5～7天血液學和血生化檢查()。<tablesid="table13"num="013"><tablewidth="862">組別血紅蛋白(g/L)白細胞(109/L)尿素氮(mmol/L)血肌酐(umol/L)總膽紅素(umol/L)SGOT(u/L)SGPT(u/L)心肌肽素組119.35±17.7110.25±3.677.64±3.5280.91±42.2516.84±8.4940.03±50.4746.03±58.05GIK組119.41±16.549.70±3.247.88±3.6981.33±24.4216.13±8.8339.31±35.5541.59±40.05P值p＞0.05p＞0.05p＞0.05p＞0.05p＞0.05p＞0.05p＞0.05</table></tables>未見心肌肽素對肝、腎功能和血液學的損害。11.7安全性小結(jié)心肌肽素在圍術(shù)期使用是安全的，無嚴重不良反應。偶有病人可出現(xiàn)惡心嘔吐的不良反應，但停藥后可自行消失。12.討論與結(jié)論心肌肽素在心臟瓣膜置換術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)患者圍術(shù)期使用是安全的，未見明顯嚴重不良反應。術(shù)后靜注心肌肽素偶有患者可發(fā)生惡心嘔吐的不良反應。心肌肽素在心臟瓣膜置換術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)患者圍術(shù)期對心肌的保護作用優(yōu)于陽性對照藥GIK液。綜上所述，通過藥學研究、藥理毒理研究和臨床研究證明本品安全、有效、質(zhì)量可控。心肌肽素加熱法處理滅活偽狂犬病毒(PRV)結(jié)果本試驗樣本中病毒最低檢測限為0.50LgTCID50/0.1ml。表b76.0-76.5、1小時滅活心肌肽素中PPV病毒效果病毒滴度單位LgTCID50/0.1ml表c76.0-76.5、1小時滅活心肌肽素中Sindbis病毒效果病毒滴度單位LgPFU/ml表d權(quán)利要求1.一種生物活性物質(zhì)活力的測定方法，包括如下步驟1)選取不包括人的的健康哺乳動物心臟剪碎成組織小塊，消化、分離細胞、終止消化，如此重復，直至心肌組織塊消化完全，得終止消化液；2)將上述終止消化液過濾、離心分離，棄上清液，沉淀細胞用培養(yǎng)基溶液稀釋、過濾，并調(diào)節(jié)濾液中懸浮細胞濃度，查活細胞比率應＞80％；3)取細胞懸液接種于細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)；4)按照如下步驟測定活力(1)損傷組培養(yǎng)板每孔加相應的損傷特定細胞的藥物溶液，棄該藥物溶液，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)實驗組培養(yǎng)板每孔加藥物溶液損傷細胞，棄去藥物溶液，加入被檢測提取物(供試品溶液)培養(yǎng)；上述實驗各組繼續(xù)培養(yǎng)后，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液100μl，培養(yǎng)5h，吸凈MTT溶液，每孔加入二甲亞砜100μl，用振蕩器振蕩20min，以酶標儀測定各孔OD值；按照下述公式計算活力t值t值＝(x1-x2)/[(s12/n1+s22/n2)1/2]式中-實驗組OD平均值；-藥物損傷組OD平均值；s1-實驗組OD值標準差；s2-藥物損傷組OD值標準差；n-n1＝n2＝122.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，還包括空白對照組，所述空白對照組的細胞用培養(yǎng)液直接培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其中以酶標儀測定各孔OD值時的檢測波長為570nm，參考波長630nm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，受試藥物的活力單位的計算方法為活力單位＝含量(mg/支或mg/ml)/供試品溶液濃度(μg/ml)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，所述消化用胰蛋白酶溶液；消化時首先將組織塊用胰蛋白酶液2ml吹打均勻，于37℃水浴中保溫消化1～2min，取出，用吸管反復吹打以分離細胞，靜置1min，取上消液，消化后加入20％小牛血清溶液終止消化。。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其中所述過濾用50-200目篩網(wǎng)，離心濾液分離的條件為500-8000rpm×1-30min，離心后棄上清液，沉淀細胞用小牛血清溶液稀釋，吹打均勻，用50-200目篩網(wǎng)濾過，并調(diào)節(jié)濾液中懸浮細胞濃度至2×105～5×105個/ml。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其中損傷組加阿霉素溶液損傷心肌細胞，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板，加入小牛血清溶液培養(yǎng)，優(yōu)選阿霉素溶液加入量為50--200μl/孔，阿霉素損傷心肌細胞的時間為0.5-5小時，加入小牛血清溶液的濃度為1-15％，用量為50-200μl/孔培養(yǎng)；實驗組加阿霉素溶液損傷心肌細胞，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板，加入供試品溶液培養(yǎng)。優(yōu)選每孔加50-200μl/阿霉素溶液損傷心肌細胞0.5-5小時，棄去阿霉素溶液，用培養(yǎng)基溶液洗板2次，加入供試品溶液50--200μl/孔培養(yǎng)。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其中實驗各組繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-10h，優(yōu)選5小時，吸凈MTT溶液，每孔加入二甲亞砜50-200μl，用振蕩器振蕩10-40min，以酶標儀測定各孔OD值。9.一種從不包括人的健康哺乳動物的心臟中提取的心肌肽素，其特征在于，其重均分子量為2000～8000道爾頓，優(yōu)選的重均分子量為2000～5000道爾頓；10％大分子部分重均分子量小于等于7500道爾頓，分子量分布系數(shù)大于等于1.5小于等于4.0，優(yōu)選10％大分子部分重均分子量大于3000小于等于7500道爾頓；其溶液的HPLC色譜圖中，至少包括三個吸收峰，按峰面積歸一化法計算，其中峰面積最大的三個主峰按出峰時間順序其峰面積不得小于總峰面積的10％、40％、12％，三個主峰峰面積之和不得小于總峰面積的75％，小于100％。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的心肌肽素，其中游離氨基酸總量小于15wt％；其中在紫外-可見分光光度法測定200±3nm處有最大吸收峰。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的心肌肽素，其中不包括人的健康哺乳動物包括豬、牛、羊、兔、馬；優(yōu)選幼年哺乳動物，包括乳豬、乳牛、乳羊、乳兔、乳馬，最優(yōu)選為乳豬。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的心肌肽素，其中活性值至少為2.2，活力單位為1025～1250。13.一種心肌肽素，其特征在于通過下述方法制備取不包括人的健康哺乳動物的心室肌洗凈、切碎，加滅菌蒸餾水勻漿，過濾提取重均分子量為2000～8000道爾頓的心肌肽素溶液，將所述心肌肽素溶液在60-85℃下加熱滅活病毒10-120分鐘，然后過濾除菌，冷凍干燥得成品；優(yōu)選所述滅活在水浴下進行，優(yōu)選滅活條件為75-85℃攪拌30-120分鐘，更優(yōu)選80℃±2℃攪拌60分鐘。14.權(quán)利要求9-13任一項所述的心肌肽素及產(chǎn)品在制備治療或預防心腦血管疾病藥物上的用途，優(yōu)選所述的心腦血管疾病為急慢性冠心病心絞痛、心肌梗塞、心律失常及其它缺血性心臟疾病、心肌炎及風濕性心臟病，還優(yōu)選為適應于心血管外科圍術(shù)期的心肌保護。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物活性物質(zhì)活力的測定方法，以及一種心肌肽素及其用途，具體地說，一種從除人以外的健康哺乳動物的心臟中提取的心肌肽素及其在制備治療或預防心腦血管疾病方面的藥物用途。該心肌肽素的重均分子量為2000～8000道爾頓，優(yōu)選的重均分子量為2000～5000道爾頓；10％大分子部分重均分子量小于等于7500道爾頓，分子量分布系數(shù)大于等于15小于等于4.0，其溶液的HPLC色譜圖中，至少包括三個吸收峰，按峰面積歸一化法計算，其中峰面積最大的三個主峰按出峰時間順序其峰面積不得小于總峰面積的10％、40％、12％，三個主峰峰面積之和不得小于總峰面積的75％，小于100％。文檔編號G01N33/50GK101016560SQ20061016686公開日2007年8月15日申請日期2006年11月14日優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日發(fā)明者李恕,王日升,梁強,阮忠生申請人:大連珍奧藥業(yè)有限公司