一種提高牛樟芝產(chǎn)量及其生物活性物質(zhì)含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及牛樟芝的培養(yǎng)方法，具體涉及一種提高牛樟芝產(chǎn)量及其生物活性物質(zhì) 含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛樟樹是臺灣特有植物，受到極度的重視，并列為保育類植物，而牛樟芝菌又只長 于牛樟樹，其他樹木無法長出牛樟芝，牛樟芝對抑制癌癥、預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移、B型肝炎、糖尿 病、高血壓等疾病具有功效，并在抗氧化、抗血液中凝血、及腸胃疾病上也有相當(dāng)?shù)墓π?，?樟芝的成份復(fù)雜，其中重要成份包括有：三萜類化合物、超氧歧化酵素、腺甘、β-D-葡聚糖 等營養(yǎng)成份；其中三萜類化合物是牛樟芝最重要的化學(xué)成份之一，也是牛樟芝的萃取物中 苦味成份的來源。以目前的研宄結(jié)果得知，在每種靈芝內(nèi)的三萜類含量約1-3%，而單牛樟 芝一種就擁有15-45%的三萜類含量，三萜類的主要功能有抑制癌細(xì)胞的生長、抑制組織胺 的釋放，防止過敏、促進肝功能、促進血小板凝集、以及降血脂等作用，因此三萜類的含量及 種類愈多，則愈有醫(yī)療價值。
[0003] 現(xiàn)有牛樟芝人工栽培方法包括椴木栽培法、固態(tài)栽培法以及液態(tài)發(fā)酵法。椴木栽 培法是使用枯死的牛樟樹椴木，將牛樟芝菌體植入椴木中，使牛樟芝在椴木中生長，借此取 得牛樟芝子實體。利用該種方法所得到的牛樟芝子實體，其所含有的成分與野生牛樟芝相 似，然而，該種培養(yǎng)方式的成本高、培養(yǎng)時間長，不利于量產(chǎn)與推廣。特別是牛樟樹椴木取得 不易，使得牛樟芝相關(guān)產(chǎn)品的價格高居不下。固態(tài)培養(yǎng)法主要是利用含有營養(yǎng)物質(zhì)的太空 包來培養(yǎng)牛樟芝所得到的牛樟芝其外觀雖然與野生牛樟芝相似，但其三帖類化合物的含量 低，并且其他主要成分與野生牛樟芝子實體并不相同。液態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)牛樟芝雖然可在短 時間內(nèi)收成牛樟芝液體發(fā)酵產(chǎn)品，但其主要產(chǎn)物為多醣類，并不含有三帖類化合物，并且其 他主要成分與野生牛樟芝子實體相去甚遠(yuǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種加速牛樟芝生長速度，并且其 主要成分如三帖類化合物、多醣體、腺苷等與野生牛樟芝相似的提高牛樟芝產(chǎn)量及其生物 活性物質(zhì)含量的方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種提高牛樟芝產(chǎn)量及其生物活性物質(zhì)含量的方法，包括以下步驟： 1)制備五葉松提取液： 將五葉松的根、莖、葉粉碎至粒徑35~60 μπι，混合均勻后溶解于濃度20%的酒精 中進行超聲波破碎處理，破壞其細(xì)胞壁，使得五葉松脂溶出，所述超聲波破碎條件為溫度 25-30°C，時間20-25min ;超聲破碎后再經(jīng)過超臨界流體萃取，提取五葉松脂，所述超臨界 流體萃取具體為：以液態(tài)二氧化碳為溶劑，在壓力4000-5000psi下萃取30-35min，得到不 同pH的五葉松提取液； 其中，根：莖：葉的比例為93-95 :4-6 :1時，得到pH = 5. 5的五葉松提取液； 根遂：葉的比例為45-50 :35-40 :15時，得到pH = 6. O的五葉松提取液； 根：莖：葉的比例為38-40 :30-32 :30時，得到pH = 6. 5的五葉松提取液； 2) 牛樟芝菌繁殖及活化 切取外圍完整厚實的牛樟芝菌絲做為菌種，接入液體培養(yǎng)基中，于25-30?下培養(yǎng) 13-15天，形成牛樟芝菌絲球，完成菌絲活化；所述培養(yǎng)過程，控制二氧化碳濃度為1~5%， 氧氣濃度為5~15% ; 3) 初發(fā)酵 將步驟2)形成的牛樟芝菌絲球移至pH = 5. 5的谷類培養(yǎng)基進行初發(fā)酵，并接上pH值 自動感應(yīng)器，當(dāng)牛樟芝生長環(huán)境pH值低于5時，自動添加 pH = 6. 0的五葉松提取液，待牛樟 芝子實體直徑大于IOcm時，自動添加 pH = 6. 5的五葉松提取液；同時，所述初發(fā)酵過程，采 用震蕩發(fā)酵，震蕩速度為150_200r/min，溫度28-30°C，同時控制二氧化碳濃度為1~5%， 氧氣濃度為5~15 %，發(fā)酵3-5天； 其中，所述谷類培養(yǎng)基的制備方法如下：將谷類高溫滅菌后與馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng) 基混合均勻，放置冷卻成型，即為谷類培養(yǎng)基； 4) 后發(fā)酵 初發(fā)酵3-5天后，將牛樟芝菌移植到新的谷類培養(yǎng)基進行后發(fā)酵，所述后發(fā)酵過程，當(dāng) 牛樟芝生長環(huán)境PH值低于5時，自動添加 pH = 5. 5的五葉松提取液，同時，控制二氧化碳 濃度為1~5%，氧氣濃度為5~15%，發(fā)酵40-45天以上。
[0006] 所述五葉松的根、莖、葉在溫度5~10°C，真空條件下進行粉碎。
[0007] 所述步驟2)形成的牛樟芝菌絲球直徑為0. 5-1. 0cm。
[0008] 所述步驟2)中的液體培養(yǎng)基是指含蛋白胨及葡萄糖含量分別為5-7%和10-12% 的營養(yǎng)液。
[0009] 所述谷類是指玉米、小麥、薏仁、糙米、黑芝麻、蕎麥、綠豆、黃豆中的一種或兩種以 上的組合。
[0010] 本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，將五葉松的根、莖、葉以不同的比例混合，提取五葉松 月旨，得到不同PH的五葉松提取液，由于牛樟芝菌生長所需最適pH值為5-7之間，而生長過 程會產(chǎn)酸導(dǎo)致PH值降低至5以下，減緩生長速度及生物活性物質(zhì)的形成，本發(fā)明借助不同 PH的五葉松提取液來控制牛樟芝生長過程的pH環(huán)境，同時牛樟芝菌還可以充分吸收利用 五葉松提取液，加速合成三萜類及腺苷等生物活性成分。
[0011] 本發(fā)明還具有以下優(yōu)點： 1、本發(fā)明通過五葉松提取液結(jié)合谷類培養(yǎng)基，使得牛樟芝菌富含各種營養(yǎng)素，能夠快 速生長，取代傳統(tǒng)牛樟椴木栽培，可以大幅度提升產(chǎn)量。
[0012] 2、本發(fā)明嚴(yán)格控制牛樟芝菌特殊生長條件pH值（5-7)及環(huán)境中二氧化碳和氧氣 濃度，可以加速牛樟芝菌生長速度。
[0013] 3、本發(fā)明克服了傳統(tǒng)臺灣牛樟芝椴木培養(yǎng)方法，生物活性成分偏低，生長速度慢 的缺陷，達到促使牛樟芝快速生長，同時提高活性成分（三萜類化合物、多醣體、腺苷）含量 的目的，本發(fā)明培養(yǎng)的牛樟芝，總?cè)祁惡看笥?000ppm，多醣體含量大于16000ppm，腺 苷含量大于2000ppm。
【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明的一種提高牛樟芝產(chǎn)量及其生物活性物質(zhì)含量的方法，包括以下步驟： 1) 制備五葉松提取液： 將五葉松的根、莖、葉在低溫5~10°C，真空條件下粉碎至粒徑35~60 μ m，混合均勻 后溶解于20%酒精中進行超聲波破碎處理，破壞其細(xì)胞壁，使得五葉松脂溶出，所述超聲 波破碎條件為溫度25-30°C，時間20-25min ;超聲破碎后再經(jīng)過超臨界流體萃取，提取五葉 松脂，所述超臨界流體萃取具體為：以液態(tài)二氧化碳為溶劑，在壓力4000-5000psi下萃取 30-35min，得到不同pH的五葉松提取液； 其中，根：莖：葉的比例為93-95 :4-6 :1時，得到pH = 5. 5的五葉松提取液； 根遂：葉的比例為45-50 :35-40 :15時，得到pH = 6. 0的五葉松提取液； 根：莖：葉的比例為38-40 :30-32 :30時，得到pH = 6. 5的五葉松提取液； 2) 牛樟芝菌繁殖及活化 切取外圍完整厚實的牛樟芝菌絲做為菌種，其大小約為5mm X 5mm，將上述菌種接入液 體培養(yǎng)基中，于25-30°C下培養(yǎng)13-15天，形成直徑0. 5-1. Ocm的牛樟芝菌絲球，完成菌絲活 化；所述液體培養(yǎng)基是指含蛋白胨及葡萄糖含量分別為5-7%和10-12%的營養(yǎng)液； 所述培養(yǎng)過程，控制二氧化碳濃度為1~5%，氧氣濃度為5~15% ; 3) 初發(fā)酵 將步驟1)形成的牛樟芝菌絲球移至pH = 5. 5的谷類培養(yǎng)基進行初發(fā)酵，并接上pH值 自動感應(yīng)器