專利名稱：電化學(xué)檢測生物活性物質(zhì)的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測樣品中含有的生物活性物質(zhì)的方法，具體涉及一種能夠直接檢測樣本中含有的如蛋白、細(xì)菌或病毒等生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測量方法及該檢測方法用的檢測裝置。
背景技術(shù)：
常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)中的雙抗體(原)夾心法為檢測抗原(體)的常見方法，該方法應(yīng)用針對抗原兩個(gè)不同決定簇的兩種單抗分別作為固相載體和酶標(biāo)抗體檢測溶液中的抗原，但該種方法使用的耗材昂貴，檢測成本較高，且生物活性物質(zhì)分離鑒定試驗(yàn)周期長。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決ELISA法存在的耗材昂貴檢測成本較高的問題，本發(fā)明提供一種能夠快速直接檢測出樣本中的生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，包括將與欲檢測的作為抗原的生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體通過絲膠蛋白固載在電極表面上作為工作電極；將由該工作電極和參比電極構(gòu)成的測試電極組插入到含有待測樣品的反應(yīng)槽中，直接檢測有無欲檢測生物活性物質(zhì)與固載在工作電極上的對應(yīng)抗體特異性結(jié)合而產(chǎn)生的電信號，進(jìn)而判斷待測樣品中有無欲測試的生物活性物質(zhì)的存在。
另外，本發(fā)明還提供一種基于該測試方法的檢測裝置，包括由表面通過絲膠蛋白固載有與欲檢測生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體的工作電極和參比電極組成的測試電極組；容納可能含有欲檢測生物活性物質(zhì)的待測樣品的反應(yīng)槽；和用于固定所述測試電極組的可升降的且使測試電極組能浸入所述反應(yīng)槽中的固定裝置；電信號檢測裝置。
由于本發(fā)明的檢測方法中，沒有ELISA方法中的酶標(biāo)步驟，這不僅明顯的縮短了檢測的周期，提高了測試效率，而且明顯降低了測試的成本。本發(fā)明還提供一種能夠進(jìn)行多通道測試的電極矩陣，該電極矩陣由相互平行的至少2個(gè)以上的測試電極組排列形成的，該種電極矩陣的多通道測試提高了測試的測試效率。本發(fā)明的測試裝置可以進(jìn)一步包括用以更精確和直觀地顯示測得的電信號數(shù)據(jù)采集和處理裝置，其中多通道數(shù)據(jù)采集卡通過由數(shù)據(jù)傳輸排線檢測并收集多個(gè)測試電極組產(chǎn)生的電信號，由分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后將電信號顯示于屏幕上。使用本發(fā)明的檢測生物活性物質(zhì)的電化學(xué)方法具有檢測成本低、速度快的優(yōu)點(diǎn)。


以下附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1(A)表示本發(fā)明的工作電極16和參比電極15的示意圖。
圖1(B)表示圖1(A)中部分A處工作電極16表面上固載的抗體和與其對應(yīng)的欲檢測的生物活性物質(zhì)特異性結(jié)合后的經(jīng)放大的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2表示依照本發(fā)明的實(shí)施例1的在有欲檢測的生物活性物質(zhì)的存在時(shí)，本發(fā)明檢測出的與時(shí)間相對應(yīng)的電信號圖譜。
圖3是表示依照本發(fā)明的實(shí)施例1的在不同濃度的沙門氏菌條件下所測得的電信號圖譜。
圖4是用于本發(fā)明的測試方法的電化學(xué)檢測裝置的示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細(xì)描述。
將生物分子固定在基本傳感器上的方法通常包括吸附法、共價(jià)鍵合法、凝膠/聚合物包埋法、交聯(lián)法等。本發(fā)明選用絲素蛋白固載可能含有欲檢測的生物活性性物質(zhì)。
以下將對本發(fā)明所使用的用于固載抗體的絲膠蛋白進(jìn)行描述。
與絲心蛋白一樣，絲膠蛋白是一種大分子蛋白質(zhì)，其分子量范圍在10-300kDa。它由18種氨基酸組成，這些氨基酸大多有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，如羥基、羰基、氨基等。此外，絲膠蛋白大約含有33.4％的絲氨酸和16.7％天冬氨酸。絲膠蛋白是一種水溶性的蛋白，會(huì)被酸性或堿性極性溶劑水解，或被蛋白水解酶所降解。絲膠蛋白含有大量的中性功能基團(tuán)，含有絲膠蛋白的薄膜有較強(qiáng)的親水性，對含水的有機(jī)液體混和物有著永久選擇性。絲膠蛋白可以包被在多種物質(zhì)表面形成薄膜，該薄膜有良好的應(yīng)變張力，并能在溫度升高時(shí)基本保持穩(wěn)定而不被延長。混合的絲膠蛋白薄膜有著強(qiáng)大的機(jī)械強(qiáng)度，可用來固定生物活性物質(zhì)，特別是酶和抗體。在固化過程中，絲膠蛋白從亞穩(wěn)態(tài)的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的β-層疊結(jié)構(gòu)，生物活性物質(zhì)被包埋在其中，不需任何交聯(lián)劑。其所固定的生物活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性、電滲抗性和穩(wěn)定性都優(yōu)于自由的生物活性物質(zhì)。絲膠蛋白是蠶絲經(jīng)過95％乙醇或無水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體，是一種天然的生物膠水，用它和檢測的生物活性物質(zhì)(抗體，蛋白質(zhì)等)等量混合，然后經(jīng)過涂抹而固定在電極表面，固定條件溫和，保持了生物活性物質(zhì)天然的構(gòu)象，大大減少其活性的喪失，增加其利用效率。包埋在膜中的生物活性物質(zhì)在保存8個(gè)月后其活性降低少于20％。然而，生物活性物質(zhì)和絲膠蛋白會(huì)從膜(特別是拉伸的膜)上慢慢脫落，這可以通過加入PVA來阻止。絲膠蛋白有抗氧化、抗菌、防紫外線以及便捷地吸收和釋放水分的性能。它取材方便、價(jià)格低廉，大分子量(≥20kDa)的絲膠蛋白肽多用于醫(yī)藥生物材料、可降解生物材料、聚合膜以及功能生物膜、纖維織物等。
由于絲膠蛋白滿足對固定材料的要求，即1)材料壽命必須滿足生物傳感器的壽命要求；2)被分析物溶液和生物分子必須有可能接觸；3)感測反應(yīng)的副產(chǎn)物可以從固定層擴(kuò)散出去；和4)生物分子不因固定過程而失去活性。因此本發(fā)明選用絲素蛋白固載可能含有欲檢測的生物活性性物質(zhì)。
此外，絲膠蛋白膜修飾電極與其他任何類型修飾電極相比，有以下更優(yōu)良的性質(zhì)1)制備條件溫和，修飾方法比較簡單，蘸涂即可；2)絲膠蛋白較穩(wěn)定，不溶于某種溶劑；絲膠蛋白膜含有大量的活性中心(約10-10-10-6mol/cm2，相當(dāng)于1-105個(gè)單分子層)，提供了本身所固有的化學(xué)和物理的穩(wěn)定性，又可使在三維空間利用其反應(yīng)場所成為可能，十分有利于電催化。3)生物分子包埋在交聯(lián)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，這不僅僅是物理包埋，生物分子上的氨基、羧基還存在較強(qiáng)的氫鍵作用，因此生物分子不易從膜中脫落；4)膜的生物相容性好。由于氫鍵及親水疏水環(huán)境的作用，生物分子在水溶液中的活性構(gòu)型可能在絲膠蛋白中固定并保存下來。且固定中沒有可能導(dǎo)致生物分子失活的自由基產(chǎn)生，也無需加熱或輻射，因此固定化后的生物分子仍具有穩(wěn)定、較高的活性，并且不易失活變性，為生物分子提供了溫和的生存空間。5)可方便地改變薄膜的厚度(一般在10-7-10-3cm)修飾膜一般為幾十納米到幾個(gè)微米。6)它對生物機(jī)體無毒害作用，且不吸附其他生物大分子，不易被玷污，可用于體液、全血的分析，特別有利于進(jìn)行活體監(jiān)測。
絲膠蛋白膜電極是穩(wěn)定的、對溶液中的離子是高度滲透的，能快速傳遞電荷。它與基底電極的接著牢固、電極壽命長、特別是聚合物性質(zhì)與表面結(jié)構(gòu)組成相結(jié)合，提供了本身所固有的化學(xué)和物理上穩(wěn)定性，以及三維的空間結(jié)構(gòu)，造成了空間、靜電和化學(xué)上的特殊微環(huán)境，為分析測定提供有利條件。絲膠蛋白所含的氨基酸中大多帶有較強(qiáng)的極性基團(tuán)，如羥基、羰基、氨基等。在溶液體系中，在密集結(jié)構(gòu)的絲膠蛋白薄膜骨架上借離子質(zhì)點(diǎn)靜電吸引而具氧化還原中心(離子交換型聚合物)，其電活性依賴于膜的離子導(dǎo)電性。它含有很多固定的荷電質(zhì)點(diǎn)和能活動(dòng)的對離子，離子向膜的摻雜非?？焖佟⒖赡?。在發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)情況下，膜的中性質(zhì)點(diǎn)變?yōu)楹呻娰|(zhì)點(diǎn)。這些氧化還原中心固著于薄膜中某一區(qū)域，濃度較高(?？筛哌_(dá)1mol/L以上)，其自由空間小，使電子跳躍速率增加。因此，“電子跳躍”造成的電荷在薄膜中的傳遞可能是主導(dǎo)的。
以下結(jié)合圖1(B)對依照本發(fā)明通過直接檢測固載在鉑電極上的抗體與其對應(yīng)的欲檢測生物活性物質(zhì)特異性結(jié)合而產(chǎn)生的電信號進(jìn)而定性判斷樣品中有無欲檢測的生物活性物質(zhì)的原理進(jìn)行描述。
如圖1(B)所示，絲膠蛋白11固載在工作電極16的表面10上，抗體13固定在絲膠蛋白11上，在工作電極16的表面10上形成一層固定有抗體13的絲膠蛋白膜層14，該絲膠蛋白膜層14為一受體敏感薄膜，該薄膜穩(wěn)定，且具有滲透性。在檢測中，當(dāng)固載有絲膠蛋白膜層14的工作電極放入待測樣品的離子溶液中，工作電極11與復(fù)雜的離子混合物相互作用，每一個(gè)離子都有不同的遷移率和化學(xué)性質(zhì)?；瘜W(xué)反應(yīng)引起工作電極11附近空間電荷層的形成，于是就產(chǎn)生了電容。開始時(shí)，“前向”反應(yīng)(氧化反應(yīng))的能量勢壘低于反方向反應(yīng)(還原反應(yīng))的能量勢壘。最后，由于溶液中離子(空間電荷)和工作電極11上電子形成的電勢降低了反方向反應(yīng)的勢壘，從而達(dá)到了平衡——除非工作電極11的電勢發(fā)生改變，否則流過界面的凈電流為零。從工作電極11向溶液中看去，存在兩組定向的分子，它們構(gòu)成了空間電荷的兩個(gè)概念層絲膠蛋白膜層14和擴(kuò)散層17。絲膠蛋白膜層14是一層介電常數(shù)小、排列致密的抗體敏感膜層，我們可以將絲膠蛋白膜層14修飾的工作電極11/電解液界面看成是兩個(gè)串聯(lián)的電容器?？偟碾娙?CT)表達(dá)公式為1/CT＝1/Cm+1/Cd；式中Cd是擴(kuò)散層17電容；Cm是絲膠蛋白膜層14電容。Cm符合Helmholtz模型(BardA J and Faulkner L R.Electrochemical MethodsFundamentals and Applications，New YorkWiley，1980)Cm＝εε0A/d.式中ε是絲膠蛋白的凈介電常數(shù)；ε0是真空介電常數(shù)；A是工作電極16面積；d.是膜厚度。而擴(kuò)散層17電容值可以直接從Gouy-Chapman理論公式求得。在Helmholtz模型中，工作電極16表面的電容與電壓是相關(guān)聯(lián)的。通常，電位Φ是相對于電解質(zhì)內(nèi)的某個(gè)遠(yuǎn)點(diǎn)定義的；Φm是金屬表面電位，Φs是絲膠蛋白膜層14外表面電位。由于Cd常忽略不計(jì)，且存在下述關(guān)系(Φm-Φs)/Φm＝CT/Cm.(Porter M D，Bright T B，Allara D L，Chidsey C E D.J Am.Chem.Soc.1987，1093559)，最終得到Φm＝(1+d/εε0A)Φs關(guān)系式，所以簡單分析表明幾乎所有電位降都發(fā)生在絲膠蛋白膜層內(nèi)，電極電位與絲膠蛋白膜層的電位密切相關(guān)。
當(dāng)與固載在工作電極16上的抗體13相對應(yīng)的抗原12(欲檢測的生物活性物質(zhì))存在時(shí)，由于抗原抗體之間特異性的結(jié)合，破壞了雙電層，從而打破了絲膠蛋白膜層14內(nèi)的電子和離子的動(dòng)態(tài)平衡，電解質(zhì)中抗衡離子為補(bǔ)償膜內(nèi)的電荷平衡而在膜中遷入和遷出引起的電極形成暫態(tài)電位。此時(shí)，氧化還原體向膜內(nèi)滲透擴(kuò)散(屬物理擴(kuò)散)，當(dāng)接觸到工作電極16表面時(shí)，氧化還原體在膜層/電極界面上發(fā)生異向電子轉(zhuǎn)移的反應(yīng)，在膜內(nèi)形成濃度梯度，可能引起膜內(nèi)相鄰氧化還原體間的電子跳躍有序運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)了電子跳躍(electron hopping)傳輸電荷。這是分子或離子間電荷交換過程，可理解為還原態(tài)分子在電極上氧化后與其他擴(kuò)散到工作電極16表面的還原態(tài)分子相遇而發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，再擴(kuò)散回到工作電極16表面發(fā)生反應(yīng)。在工作電極16表面發(fā)生了快速、可逆的鍵合，即能很快吸附于工作電極16表面，又能很快從工作電極16表面脫附下來，在工作能電極16上能發(fā)生快速的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。緊密暫態(tài)結(jié)合，導(dǎo)致了高局部電荷界面腔的形成，產(chǎn)生暫態(tài)電位。由于背景雜質(zhì)的干擾使絲膠蛋白膜層14拾取電子，引起噪音。從電極的電子轉(zhuǎn)移過程來看，它不僅包括工作電極14與電解質(zhì)溶液中電活性物質(zhì)間的電子轉(zhuǎn)移，而且涉及到了交叉電子轉(zhuǎn)移過程。此外，絲膠蛋白膜層14通過先膨脹、再壓縮，電位響應(yīng)與絲膠蛋白膜層14受到的表面壓力即吸附的抗原量也有一定關(guān)系，抗原與抗體特異鍵合時(shí)產(chǎn)生電震，可轉(zhuǎn)換為電信號。將傳感器的信號從動(dòng)力學(xué)模式過渡到電荷傳輸模式。因此可以通過電信號檢測裝置將該抗原與抗體的特異性結(jié)合產(chǎn)生的電信號檢測并顯示出來，通過觀測有無顯著電信號的產(chǎn)生來定性判定待測樣品中有無欲檢測的生物活性物質(zhì)。
以下將描述依照本發(fā)明的直接測試用絲膠蛋白將抗體固定在電極上的步驟。由于固體電極的表面狀態(tài)與物質(zhì)在固體電極上伏安行為的重現(xiàn)性差直接相關(guān)，因此為了除去電極表面的污染物質(zhì)或改善電極表面的電化學(xué)性質(zhì)，可以對電極表面進(jìn)行清洗和預(yù)處理。先用蒸餾水在光潔的玻璃板或其它軟質(zhì)材料上對固體電極進(jìn)行拋光，再用如濃度為1mol/L的稀硫酸清洗，有時(shí)還需用95％乙醇及超聲波洗滌。此外也可以采用電化學(xué)預(yù)處理方法一般可以在-0.1-+1.0V(vs.SCE)進(jìn)行循環(huán)掃描使殘余電流降至最小而又穩(wěn)定的數(shù)值，也可以再在+0.2V保持?jǐn)?shù)秒鐘。若將化學(xué)和電化學(xué)法結(jié)合起來，效果更好。即先進(jìn)行陽極極化，后浸入新配制的冷王水中除去氧化層，水洗凈再進(jìn)行陰極極化，最后電位保持在零伏處，以除去吸附的氫。此外，電極響應(yīng)間隔之間需采用適當(dāng)?shù)碾娢谎h(huán)以清洗電極，才能得到穩(wěn)定重現(xiàn)的響應(yīng)，如采用雙或三重脈電位波形氧化清除吸附的物質(zhì)，然后再還原除去氧化物層。如使用鉑電極，本發(fā)明優(yōu)選使用1mol/L NaOH、1∶1 HNO3、丙酮和蒸餾水超聲洗滌，烘干備用，以后每次試驗(yàn)，電極均先用稀硫酸洗滌，再用去離子水清洗后涼干備用。
將與欲檢測的生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體溶液與絲膠溶液等體積混合后制得抗體絲膠蛋白溶液。將如鉑電極等工作電極浸入到抗體絲膠蛋白的混合溶液中適宜的時(shí)間，然后垂直移出液面。再使用如小型電風(fēng)扇等風(fēng)干裝置將電極上多余的溶液吹去，在室溫下余留部分在電極表面揮發(fā)干燥成均勻膜，從而制得表面固載有與欲檢測的生物活性物質(zhì)(抗原)相對應(yīng)的抗體的工作電極。如欲得到較厚的膜，可多次重復(fù)同樣的操作，而且無針孔。但重復(fù)操作應(yīng)不超過三次，因?yàn)槟み_(dá)到兩層以后電流不再隨層數(shù)增加而增加。且膜較厚時(shí)，由于擴(kuò)散受到阻礙，致使響應(yīng)信號下降，響應(yīng)時(shí)間延長。由于電極表面積一致，絲膠蛋白膜在電極上的覆蓋量基本相同。絲膠蛋白本身已含有電活性基，可方便地用上述方法制備膜，無需接著電活性基。該涂膜方法的優(yōu)點(diǎn)是過程可控和重現(xiàn)性好。絲膠蛋白接著牢固而均勻，可在室溫下進(jìn)行，方法簡單易行。
本發(fā)明的待測樣品溶液的配制是用NaOH-KH2PO4緩沖液將待檢測物質(zhì)配成待測樣品溶液，其中所配成的待測樣品溶液的pH值優(yōu)選為7.0-7.4，待檢測物質(zhì)的稀釋范圍優(yōu)選為1∶100-1∶100000的要求，并加入適量的硅油和氨基乙醇。
將該工作電極16和作為參比電極15的鉑電極組成一個(gè)測試電極組，置于含有配置好的樣品溶液的反應(yīng)槽中，在工作電極16和參比電極15之間使用電信號檢測裝置檢測工作電極16上固載的抗體和與其相對應(yīng)的生物活性物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合而產(chǎn)生的電信號。如果檢測出有顯著電信號的存在，就表明是欲檢測的生物活性物質(zhì)與工作電極16上固載的與其相對應(yīng)的抗體發(fā)生了特異性結(jié)合，即表明待測樣品中有欲檢測的生物活性物質(zhì)的存在。反之，如果沒有電信號產(chǎn)生或者電信號很弱，則表明待測樣品中沒有欲檢測的生物活性物質(zhì)的存在。
在本發(fā)明的測試過程中可能會(huì)出現(xiàn)干擾和電極玷污的現(xiàn)象。相對高分子量物質(zhì)，如蛋白質(zhì)的吸附是玷污的主要來源，這些非電活性物質(zhì)的吸附鈍化了電極表面，使得生物傳感器的響應(yīng)隨時(shí)間逐漸下降?？梢圆捎迷陔姌O表面上涂覆絲膠蛋白膜，以增加固定生物分子的穩(wěn)定性，來防止玷污和干擾的能力。此外，也可通過控制膜的厚度在一定程度上控制膜的選擇性。
實(shí)施本發(fā)明方法的電化學(xué)測試裝置可以是采用常用的如伏安法等可以來檢測抗體抗原特異性結(jié)合而產(chǎn)生的電信號的測試裝置，可以不需要數(shù)據(jù)采集裝置和相應(yīng)的分析軟件而直接從如電壓表或電流表等測試裝置上直接觀測有無明顯電信號的產(chǎn)生。本發(fā)明優(yōu)選采用下述方法使用數(shù)據(jù)采集卡來進(jìn)行電化學(xué)檢測，以更直觀和準(zhǔn)確地檢測產(chǎn)生的電信號。
采用常見的方法將工作電極組和參比電極電學(xué)連接到數(shù)據(jù)采集卡上。但優(yōu)選將工作電極組和參比電極的后端以一預(yù)定的間隔電學(xué)連接或接插在數(shù)據(jù)傳輸排線的接口上，對于本發(fā)明的測試方法可以使用具有不同接口的數(shù)據(jù)采集卡，如標(biāo)準(zhǔn)接口的采集卡、USB接口的采集卡或者PC接口的采集卡。數(shù)據(jù)傳輸排線另一端的標(biāo)準(zhǔn)插口與數(shù)據(jù)采集卡的接口相連，該數(shù)據(jù)傳輸排線為市場可買到的電腦上常用的排線，其插口處有許多間隔相等的小孔，鉑絲可以插入并不會(huì)掉下來，如使用其他電極如石墨電極等較粗或較細(xì)的電極可以通過用合適如銅等的導(dǎo)線纏繞后插接到數(shù)據(jù)傳輸排線的接口上，并保持與水平面垂直及互相平行。數(shù)據(jù)傳輸排線的另一端的另一接口與數(shù)據(jù)采集卡的插口相匹配，插接后使工作電極組與數(shù)據(jù)采集卡電學(xué)連接。且插接上的工作電極16和參比電極15可以拆卸下來，進(jìn)行清洗后重復(fù)使用。接口使數(shù)據(jù)傳輸排線和數(shù)據(jù)采集卡相連接，如圖4所示，工作電極16以及參比鉑電極與接口的水平面保持垂直。數(shù)據(jù)采集卡及其接口可從深圳市研祥智能科技股份有限公司購得，型號為PCL-812PG，該種型號的數(shù)據(jù)采集卡有8個(gè)通道，既能進(jìn)行單通道測試，也能同時(shí)進(jìn)行多通道測試，其采集方法和步驟可按照其說明書的要求操作。應(yīng)該指出，本發(fā)明中使用的數(shù)據(jù)采集卡具有能夠檢測與其相連接的工作電極16和參比電極15之間的電壓，即具有電壓檢測功能，如果連接有多組工作電極16和參比電極15可以同時(shí)進(jìn)行多通道的電壓檢測。本發(fā)明也可以采用其他與上述型號的數(shù)據(jù)采集卡的基本原理相同的數(shù)據(jù)采集卡，并不影響測定的技術(shù)效果。
在測試之前，將由制得的工作電極16與作為參比電極15的鉑金電極組成的測試電極組一起浸入反應(yīng)槽中，使用上述的數(shù)據(jù)采集卡采集電信號后傳入電腦并經(jīng)過數(shù)據(jù)分析后將測得的電信號顯示在屏幕上，如有顯著電信號的出現(xiàn)則表明樣品中有欲測的生物活性物質(zhì)的存在，反之則樣品中沒有欲測的生物活性物質(zhì)的存在。為了更直觀和精確地觀測所產(chǎn)生的顯著電信號，本發(fā)明使用相應(yīng)的分析軟件分析數(shù)據(jù)采集卡收集的數(shù)據(jù)通過電腦屏幕顯示出來。本發(fā)明使用的從深圳市研祥智能科技股份有限公司購得的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶有數(shù)據(jù)分析軟件，可以使用該分析軟件對測試結(jié)果進(jìn)行分析。但另外根據(jù)本發(fā)明的測試方法的特點(diǎn)以及所采用的數(shù)據(jù)采集卡的數(shù)據(jù)采集方式，也可以在該軟件的基礎(chǔ)上了進(jìn)行編程，使所開發(fā)的軟件用于本發(fā)明的數(shù)據(jù)分析。使用上述的本發(fā)明的測試方法的最低檢測濃度1.0×10-11mol/L，最快的響應(yīng)時(shí)間為7分鐘左右，一般來說不同濃度的待測樣品共同被檢測出來的時(shí)間范圍是70-110分鐘。
圖2為依照本發(fā)明的實(shí)施例1的通過電化學(xué)方法測得的經(jīng)分析軟件處理后的電壓信號與時(shí)間對應(yīng)關(guān)系圖。顯示的電壓信號包括噪音電信號、一般電信號和顯著電信號，噪音值的電壓在-34.2±5mV，而響應(yīng)電信號值在-164.4±10mV至-431.1±10mV。表明檢測效果明顯，抗干擾能力強(qiáng)。
圖3為本發(fā)明依照實(shí)施例1的所檢測出的電信號圖譜，其中A為空白對照，以pH 7.0NaOH-KH2PO4緩沖液作為待測溶液；B為加入105個(gè)/mL沙門氏菌的pH 7.0 NaOH-KH2PO4緩沖液的樣品溶液；C為加入2×104個(gè)/mL沙門氏菌的pH 7.0 NaOH-KH2PO4緩沖液的樣品溶液；D為加入104個(gè)/mL沙門氏菌的pH 7.0 NaOH-KH2PO4緩沖液的樣品溶液；E為加入2×103個(gè)/mL沙門氏菌的pH 7.0 NaOH-KH2PO4緩沖液的樣品溶液。從圖3中可以看出當(dāng)待測樣品中不含有欲檢測的生物活性物質(zhì)時(shí)，沒有顯著電信號的產(chǎn)生，當(dāng)待測樣品中含有欲檢測的生物活性物質(zhì)時(shí)有顯著電信號的產(chǎn)生，且隨著欲檢測生物活性物質(zhì)的含量增加，顯著電信號的強(qiáng)度增加，因此采用本發(fā)明的檢測方法，能直接定性地檢測生物活性物質(zhì)。
加入適量的氨基乙醇可以減少噪音，這是因?yàn)榘被掖伎梢詼p少反應(yīng)過程中的非特異性結(jié)合，降低背景噪音，從而提高了檢測的靈敏度。另外因?yàn)楣栌褪巧矶栊缘?，介電性能好，所以加入適量的硅油可以增強(qiáng)電信號。
在以上的實(shí)施方式中，可以用鉑電極、石墨電極、玻碳電極、玻璃電極、銻電極等金屬電極，但本發(fā)明優(yōu)選鉑電極。
上面所述的測試步驟中，也可以使用按照下述的多通道測試電極矩陣來代替由單一的工作電極16和參比電極15組成的測試電極組來進(jìn)行電信號的多通道檢測。該多通道電極矩陣由兩個(gè)以上的測試電極組構(gòu)成，所述測試電極組同樣也由按照上面所述步驟制得的固載有氧化還原酶標(biāo)記的抗體抗原復(fù)合物的工作電極16和參比電極組成。其中工作電極16和參比電極15可以通過常用的方法電學(xué)連接到數(shù)據(jù)采集卡的接口上，為了操作方便也可以將工作電極和參比電極以合適的間距通過固定板等固定。但本發(fā)明優(yōu)選以下述方法和數(shù)據(jù)采集卡電學(xué)連接。將工作電極16和參比電極15以一預(yù)定的間隔接插在數(shù)據(jù)傳輸排線的接口上，且測試電極組與接口的水平面保持垂直，測試電極組之間的間距相等，測試電極組的間距可以根據(jù)反應(yīng)槽的大小確定，測試電極組之間互相平行，數(shù)據(jù)傳輸排線另一端的標(biāo)準(zhǔn)插口與數(shù)據(jù)采集卡的接口相連。數(shù)據(jù)采集卡中配制的電壓檢測裝置相應(yīng)地檢測每一個(gè)測試電極組的工作電極16和參比電極15間形成的電壓差信號，并采集后傳給分析軟件。每一個(gè)測試電極組數(shù)據(jù)占用采集卡的一個(gè)通道，如可以使用8個(gè)測試電極組構(gòu)成2×4測試電極組矩陣，8個(gè)測試電極組分別連接數(shù)據(jù)采集卡的8個(gè)通道。但如果數(shù)據(jù)采集卡能夠提供足夠的通道數(shù)，可以根據(jù)需要擴(kuò)增測試電極組矩陣的大小，如4×4、8×8等。該種由測試電極組構(gòu)成的電極矩陣便于洗滌以及重新涂膜和檢測，且在進(jìn)行電化學(xué)檢測時(shí)能夠同時(shí)多通道檢測出多個(gè)電信號，提高了檢測的效率。以上的數(shù)據(jù)采集卡可以使用上述的深圳市研祥智能科技股份有限公司型號為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡。
圖4為用于本發(fā)明描述的檢測生物活性物質(zhì)的方法的測試裝置的一種實(shí)施方式的示意圖。數(shù)據(jù)傳輸排線1的接口3由可升降的固定裝置9固定。一個(gè)固定裝置9沿著其移動(dòng)的柱狀體8垂直固定在底座上，固定裝置9將接口3固定在水平位置，其中接口3上插接有與接口3面垂直的單一的測試電極組4或者測試電極組矩陣。底物反應(yīng)槽5置于底座上，且與接口3上插接的測試電極組4相對應(yīng)。接口3通過數(shù)據(jù)傳輸排線1的導(dǎo)線和安裝在計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)采集卡相連接。欲進(jìn)行檢測時(shí)，下降接口3的固定裝置9，以使插接在接口3上的固載有與欲檢測的生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體的工作電極16和參比電極15組成的測試電極組或者由該種測試電極組組成的測試電極組矩陣浸入到反應(yīng)槽5中的樣品溶液中，通過數(shù)據(jù)收集卡檢測并采集電極組之間的電壓差信號，傳輸給計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)運(yùn)用相應(yīng)的分析軟件進(jìn)行分析處理后，將電信號顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，通過判斷有無響應(yīng)的顯著電信號的存在來檢測樣品中有無欲測試的生物活性物質(zhì)的存在。
本發(fā)明的測試方法可檢測沙門氏菌、牛血清IgG、人體血清中的甲胎蛋白、人血清中的白細(xì)胞介素-6等，其測試范圍廣。
使用本發(fā)明測試方法，即使按照鉑絲(尺寸為 )以16根計(jì)，150-200人民幣，且可重復(fù)利用；數(shù)據(jù)采集卡1500-3000人民幣；電腦4000人民幣左右。而用于ELISA測試法用的熒光標(biāo)記的酶為千元左右，ELISA還要用到以增加熒光強(qiáng)度便于檢測一抗二抗甚至三抗等，增加開支。用于熒光檢測的讀取器(ELISA Reader)需48000左右人民幣，進(jìn)口的全自動(dòng)熒光檢測的讀取器價(jià)格可高達(dá)幾十萬美元。因此本測試方法能夠很明顯地節(jié)約測試成本。此外，ELISA測試中要用到供氧體常用的如鄰苯二胺和四甲基聯(lián)苯胺等供氫體具有強(qiáng)烈的致癌作用，具有較高的操作危險(xiǎn)性。此外，通過本發(fā)明的具體實(shí)施方式
可以看出，由于本測試方法中采用了電泳步驟和基于自動(dòng)檢測和分析的電化學(xué)測試技術(shù)，使得本發(fā)明方法的定性檢測生物活性物質(zhì)的時(shí)間降低為l小時(shí)左右，比ELISA方法所需的檢測時(shí)間1.5-24小時(shí)有明顯降低。
下面以實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1本實(shí)驗(yàn)用沙門氏菌鞭毛單克隆抗體檢測沙門氏菌。
將尺寸為 的鉑金電極分別用稀硫酸和去離子水清洗后晾干，將沙門氏菌的單克隆抗體與絲膠蛋白溶液等體積混合后，涂膜該鉑電極面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲膠蛋白是蠶絲經(jīng)過95％乙醇或無水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
用pH7.0的NaOH-KH2PO4緩沖液將沙門氏菌lO8個(gè)/mL(法國巴斯德研究所提供)分別稀釋1000、5000、10000、50000倍，并加入適量硅油和氨基乙醇，配成待測樣品溶液。將工作鉑電極和一個(gè)作為參比電極的鉑電極插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的接口板的插口處，接口板由固定裝置固定在水平位置，數(shù)據(jù)傳輸排線與數(shù)據(jù)采集卡相連。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測試范圍至-500mv到+500mv之間。打開深圳市研祥智能科技股份有限公司購得的型號為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。
向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作鉑電極浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測試電極組浸入待測樣品溶液中，直接檢測沙門氏菌抗體與沙門氏菌相互結(jié)合過程中產(chǎn)生的電信號。在此過程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡可以每秒10至100次的速率采集工作電極與參比電極間傳送來的電信號，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將響應(yīng)電信號顯示在屏幕上。通過該方法的經(jīng)過分析處理后，最后形成結(jié)論是否存在沙門氏菌。產(chǎn)生電信號的電壓值區(qū)間在-173～-420mV，產(chǎn)生電信號的顯著時(shí)間區(qū)段為70-85分鐘。
實(shí)施例2本實(shí)驗(yàn)用鼠抗牛IgG抗體檢測牛血清中的IgG。
將尺寸為 的鉑金電極分別用稀硫酸和去離子水清洗后晾干，將鼠抗牛IgG抗體(購自美國Sigama公司，按1∶1000稀釋)與絲膠蛋白溶液等體積混合后，涂膜該鉑電極面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲膠蛋白是蠶絲經(jīng)過95％乙醇或無水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
用PBS混合緩沖液(pH7.4 PBS199.9mL、吐溫0.1mL，牛血清白蛋白BSA 0.2g，混合即可)將稀釋1∶450倍，并加入適量硅油和氨基乙醇，配成待測樣品溶液。將工作鉑電極和一個(gè)作為參比電極的鉑電極插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的接口板的插口處，接口板由固定裝置固定在水平位置，數(shù)據(jù)傳輸排線與數(shù)據(jù)采集卡相連。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測試范圍至-500mv到+500mv之間。打開深圳市研祥智能科技股份有限公司購得的型號為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。
向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作鉑電極浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測試電極組浸入待測樣品溶液中，直接檢測鼠抗牛IgG抗體和牛血清中的IgG相互結(jié)合過程中產(chǎn)生的電信號。在此過程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡可以每秒10至100次的速率采集工作電極與參比電極間傳送來的電信號，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將響應(yīng)電信號顯示在屏幕上。通過該方法的經(jīng)過分析處理后，最后形成結(jié)論是否存在牛血清中的IgG。產(chǎn)生電信號的電壓值區(qū)間在-209～-410mV，產(chǎn)生電信號的顯著時(shí)間區(qū)段為72-87分鐘。
實(shí)施例3用甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體檢測人體血清中的甲胎蛋白。
將尺寸為 的鉑金電極分別用稀硫酸和去離子水清洗后晾干，將甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體(購自華能博賽生物制品研究所)與絲膠蛋白溶液等體積混合后，涂膜該鉑電極面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲膠蛋白是蠶絲經(jīng)過95％乙醇或無水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
AFP陽性血清由鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院贈(zèng)送。用PBS混合緩沖液(pH7.4 PBS200mL，BSA0.2g，混合即可)將稀釋成20-200ug/L，并加入適量硅油和氨基乙醇，配成待測樣品溶液。將工作鉑電極和一個(gè)作為參比電極的鉑電極插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的接口板的插口處，接口板由固定裝置固定在水平位置，數(shù)據(jù)傳輸排線與數(shù)據(jù)采集卡相連。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測試范圍至-500mv到+500mv之間。打開深圳市研祥智能科技股份有限公司購得的型號為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。
向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作鉑電極浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測試電極組浸入待測樣品溶液中，直接檢測甲胎蛋白(AFP)單克隆抗體和人體血清中的甲胎蛋白相互結(jié)合過程中產(chǎn)生的電信號。在此過程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡可以每秒10至100次的速率采集工作電極與參比電極間傳送來的電信號，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將響應(yīng)電信號顯示在屏幕上。通過該方法的經(jīng)過分析處理后，最后形成結(jié)論是否存在甲胎蛋白。產(chǎn)生電信號的電壓值區(qū)間在-168～-416mV，產(chǎn)生電信號的顯著時(shí)間區(qū)段為67-80分鐘。
實(shí)施例4用IL-6單克隆抗體4B1檢測人血清中的白細(xì)胞介素-6將尺寸為 的鉑金電極分別用稀硫酸和去離子水清洗后晾干，將IL-6單克隆抗體4B1(揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)教研室提供)與絲膠蛋白溶液等體積混合后，涂膜該鉑電極面，在室溫下自然涼干成膜。其中絲膠蛋白是蠶絲經(jīng)過95％乙醇或無水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
血清標(biāo)本由鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院提供。用PBS混合緩沖液(pH7.4 PBS200mL，BSA 0.2g，混合即可)將稀釋成20-200ug/L，并加入適量硅油和氨基乙醇，配成待測樣品溶液。將工作鉑電極和一個(gè)作為參比電極的鉑電極插接入數(shù)據(jù)傳輸排線的接口板的插口處，接口板由固定裝置固定在水平位置，數(shù)據(jù)傳輸排線與數(shù)據(jù)采集卡相連。接通計(jì)算機(jī)電源，調(diào)整數(shù)據(jù)采集卡的測試范圍至-500mv到+500mv之間。打開深圳市研祥智能科技股份有限公司購得的型號為PCL-812PG的數(shù)據(jù)采集卡本身自帶分析軟件。
向下調(diào)整固定裝置的位置，使工作鉑電極浸入置于底座上的含有氨基乙醇和硅油的PBS溶液的反應(yīng)槽內(nèi)，將測試電極組浸入待測樣品溶液中，直接檢測IL-6單克隆抗體4B1和人體血清中的白細(xì)胞介素-6相互結(jié)合過程中產(chǎn)生的電信號。在此過程中，與計(jì)算機(jī)相連的數(shù)據(jù)采集卡可以每秒10至100次的速率采集工作電極與參比電極間傳送來的電信號，分析軟件讀取數(shù)據(jù)采集卡的電壓值進(jìn)行處理，將響應(yīng)電信號顯示在屏幕上。通過該方法的經(jīng)過分析處理后，最后形成結(jié)論是否存在白細(xì)胞介素-6。產(chǎn)生電信號的電壓值區(qū)間在-178～-375mV，產(chǎn)生電信號的顯著時(shí)間區(qū)段為65-80分鐘。
權(quán)利要求
1.一種測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，包括通過絲膠蛋白將與欲檢測的作為抗原的生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體固載在電極表面上制得工作電極；將由該工作電極和參比電極構(gòu)成的測試電極組插入到可能含有欲檢測的生物活性物質(zhì)的待測樣品反應(yīng)槽中，測量有無反應(yīng)而產(chǎn)生的電信號，進(jìn)而判斷有無欲測試的生物活性物質(zhì)的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于所述抗體固載是將抗體溶液與絲膠蛋白溶液混合后涂膜在工作電極的表面上。
3.如權(quán)利要求1所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于所述絲膠蛋白是蠶絲經(jīng)過95％乙醇或無水乙醇浸泡洗滌后再放入溴化鋰中溶解所得的粘稠液體。
4.如權(quán)利要求1所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于所述抗體的固載是將所述測試電極組為由相互平行的至少2個(gè)以上的測試電極組排列形成的能夠進(jìn)行多通道測試的電極組矩陣。
5.如權(quán)利要求1所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于使用與計(jì)算機(jī)相聯(lián)的數(shù)據(jù)采集卡測試和采集反應(yīng)產(chǎn)生的電信號。
6.如權(quán)利要求5所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于工作電極和參比電極電學(xué)連接在接數(shù)據(jù)采集卡的數(shù)據(jù)傳輸排線的標(biāo)準(zhǔn)接口上，且可以拆卸。
7.如權(quán)利要求1所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于在固載抗體之前分別使用稀硫酸和蒸餾水對電極進(jìn)行洗滌。
8.如權(quán)利要求1所述的測量生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，其特征在于所述待測樣品的反應(yīng)槽中含有氨基乙醇和硅油。
9.一種用于權(quán)利要求1-8所述的任一種電化學(xué)測試方法的測試裝置，包括由表面通過絲膠蛋白固載有與欲檢測生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體的工作電極和參比電極組成的測試電極組；容納可能含有欲檢測生物活性物質(zhì)的待測樣品的反應(yīng)槽；和用于固定所述測試電極組的可升降的且使測試電極組能浸入所述反應(yīng)槽中的固定裝置；電信號檢測裝置。
10.如權(quán)利要求9所述的測試裝置，其特征在于進(jìn)一步包括數(shù)據(jù)采集裝置和處理裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能夠快速直接檢測出樣本中的生物活性物質(zhì)的電化學(xué)測試方法，包括將與欲檢測的作為抗原的生物活性物質(zhì)相對應(yīng)的抗體通過絲膠蛋白固載在電極表面上作為工作電極；將由該工作電極和參比電極構(gòu)成的測試電極組插入到含有待測樣品的反應(yīng)槽中，直接檢測有無欲檢測生物活性物質(zhì)與固載在工作電極上的對應(yīng)抗體特異性結(jié)合而產(chǎn)生的電信號，進(jìn)而判斷待測樣品中有無欲測試的生物活性物質(zhì)的存在。本發(fā)明的測試方法具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。此外本發(fā)明還提供一種基于該測試方法的測試裝置，包括測試電極組；容納可能含有欲檢測生物活性物質(zhì)的待測樣品的反應(yīng)槽；和用于固定所述測試電極組的固定裝置；以及電信號檢測裝置。
文檔編號G01N33/50GK1566936SQ0312967
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者李偉, 陳石燕, 陳健俊, 潘寧, 黃文尉, 李幼榮 申請人:李偉, 陳石燕, 陳健俊